经胎盘诱发脑肿瘤动物模型的建立及bFGF对其发生发展的影响
作者：杨 军 尤玉才 张彦芳 王象昌
单位：杨 军:苏州市第二人民医院；尤玉才 张彦芳 王象昌:北京医科大学第一医院 邮政编码：215002
关键词：脑肿瘤 动物模型 亚硝基乙基脲 碱性成纤维细胞生长因子
江苏医药991102 摘要 孕鼠经腹腔一次性给予亚硝基乙基脲(ENU)可引起子代鼠中较高的脑肿瘤发生，并且与人类脑肿瘤发生的高峰期、类型及好发部位相似。建立该肿瘤模型其方法简便、经济、观察时间短，为肿瘤发生前、肿瘤发生早期及发生后不同阶段的观察提供了条件。经脑立体定向一次性颞叶实质内注射碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)其肿瘤内的新生血管面积和血管数既高于对照组肿瘤内，也高于同组瘤外正常组织内的新生血管面积和血管数。提示bFGF可以促进肿瘤内新生血管形成，也可能是影响肿瘤生长的原因。
Animal Model of Transplacental Ethylnitrosourea-induced Brain Tumor
, 百拇医药
and the Effect of bFGF on its Incidence and Growth
Yang Jun et al
Second Affiliated Hospital，Suzhou Medical College，Suzhou
Abstract High incidence of brain tumor was found in offspring rats after intraperitoneally injection of Ethylnitrosourea (ENU) into pregnant rats.The tumors demonstrated the similar features to human brain tumor in type，location and the peak of onset.This simple，inexpensive and stable method is helpful in observing tumors of various stages.After stereotactic injection of bFGF to temporal lobe，the areas and numbers of intratumoral neovessels were significantly higher than that in both extratumor tissues of the same group and intratumoral samples of the control rats without bFGF.
, 百拇医药
Key words Brain tumor Animal model Ethylnitrosourea Basic fibroblast growth factor
脑肿瘤动物模型的建立一直是探索肿瘤发病机制和治疗的实验基础。本实验使用亚硝基乙基脲(ENU)一次性经腹膜下注射到孕17天SD大鼠体内，建立了经胎盘诱发原发性脑肿瘤动物模型，并利用这一模型经脑立体定向方法脑实质内注入bFGF对肿瘤发生发展的影响进行了观察。
材料与方法
一、试剂、仪器设备：ENU100mg/支，bFGF 250μg/支，Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)0.2ml/支。鼠脑立体定向仪。IBSA486细胞图像分析仪。
二、实验动物：选SD孕17天大鼠18只。
, 百拇医药
三、方法：
1.脑肿瘤诱发 取SD孕17天大鼠10只，经腹腔注射ENU100mg/kg。产子鼠120只，子鼠处死时间分别在30、60、90、120天各20只，150天40只。另取SD孕17天大鼠8只，产子鼠后即腹腔内注射ENU100mg/kg，共产子鼠100只，母乳喂养30天后雌雄分开。子鼠处死时间在30、60、90、120和150天各20只。
2.鼠脑立体定向 取120天脑肿瘤诱发子鼠40只，每组20只，一组经脑立体定向脑内注射bFGF，剂量10μl/只。另一组注射生理盐水为对照组，剂量10μl/只。采用SN2型鼠脑立体定向仪。定向以前囟为零点，分别以前囟前3mm、右侧2mm、深度3～4mm为X、Y、Z轴。穿刺针到达右侧颞叶为靶点。用剪碎的明胶海绵溶于bFGF和生理盐水各10μl注入靶点，喂养30天后，处死取脑。
3.取材、制片与染色 用10%福尔马林磷酸缓冲液灌注后开颅取脑，将脑组织固定在10%福尔马林磷酸缓冲液中，用于制作光镜标本。石蜡切片，HE染色，免疫组织化学染色(胶质纤维酸性蛋白)。
, 百拇医药
四、统计分析：资料用Spsspc统计软件。
结 果
一、孕期注药子鼠在120天(20只)石蜡切片光镜下发现肿瘤7例，发生率为35%，共有8个肿瘤，脑室旁白质内肿瘤4个、脑叶白质内肿瘤2个、脑室内肿瘤2个。子鼠150天(40只)石蜡切片光镜下发现肿瘤29例，发生率为72.5%，共有46个肿瘤，多发肿瘤13例，其中4个肿瘤1例、3个肿瘤2例、2个肿瘤10例。肿瘤位于脑室旁白质内24个，脑叶白质内12个，脑室内肿瘤10个。子鼠在30天、60天、90天(各20只)石蜡切片光镜下未发现肿瘤生长。全部肿瘤行GFAP抗体免疫组化染色，54个肿瘤中34个GFAP阳性为星形细胞瘤，12个为室管膜肿瘤，5个为肿瘤样增生(GFAP阴性)，2个混合性肿瘤(GFAP部分阳性)，1个性质难定(GFAP阴性)。经卡方检验，鼠龄120天与鼠龄150天的肿瘤发生率差异有显著性(P＝0.0052)。
二、产后诱发子鼠在30、60、90、120、150天石蜡切片光镜下均未发现肿瘤生长。
, 百拇医药
三、bFGF组鼠龄150天(20只)发生肿瘤17例，发生率为85%，共有29个肿瘤，多发肿瘤8例，脑实质内肿瘤22个，脑室内肿瘤7个。肿瘤直径大于300μm25个。生理盐水对照组鼠龄150天(20只)，发生肿瘤12例，发生率为60%，共有17个肿瘤，多发肿瘤5例，脑实质内肿瘤14个，脑室内肿瘤3个。肿瘤直径大于300μm7个。经卡方检验bFGF组与生理盐水对照组肿瘤发生率差异无显著性，但有增高的趋势(P＝0.058)。经t检验两组肿瘤直径及截面积差异有显著性(P<0.01)；两组肿瘤内血管面积和血管数差异有显著性(P<0.05)；两组脑血管面积和血管数差异有显著性(P<0.05)。经t检验bFGF组肿瘤内与同体脑实质内血管面积、血管数差异有显著性(P<0.05)。
讨 论
研究发现，生命的过程和疾病的发生都受到基因编码的控制，在胚胎期受到致癌因子的影响时最易发生基因编码的改变。在孕期采取化学药物诱发肿瘤动物模型也逐渐受到人们的重视。而以往的研究中均是在诱发鼠出现症状或在观察相当长的时期内进行的[1～3]。本实验将孕17天SD大鼠经腹膜下注射ENU100mg/kg，分别在30、60、90、120、150天五个阶段对脑肿瘤的发生、部位、类型进行研究的。结果表明：经胎盘一次性给予一定剂量的致癌物可引起较高的脑肿瘤发生率，且肿瘤的发生具有一个潜伏期(90～120天)。而鼠龄150天的肿瘤发生率(72.5%)高于鼠龄120天的肿瘤发生率(35%)(P<0.05)。150天的大鼠相当于成年，此与人类脑肿瘤发生的高峰期相似。实验发生的54个脑肿瘤中星形细胞瘤34个，室管膜瘤12个，发生率达85%，肿瘤位于脑室旁白质内28个(52%)，产后注药母乳喂养组无1例发生脑肿瘤，说明孕期注射ENU的肿瘤发生与产后持续母乳喂养无关。综上所述，孕17天大鼠一次性给予ENU时，子代鼠在出生后150天发生脑肿瘤的时间、部位、类型与人类相似。该模型的建立方法简便、经济、观察时间短、肿瘤发生率高，与一个完善的肿瘤模型所具备的条件接近。同时，由于该模型具有一个明显的潜伏期(90～120天)，这就为肿瘤发生前、肿瘤发生早期及发生后不同阶段的观察提供条件。造成子代鼠基因编码的改变是在胚胎期，而肿瘤的发生是在成年期，加上大多数子代鼠肯定会发生肿瘤，这就为研究肿瘤发生前的基因连锁变化提供了条件。孕期大鼠一次性接触致癌因子足可使子代鼠在成年发生肿瘤，这一现象提示成年脑肿瘤患者可能与胚胎期接触致癌物有关。
, 百拇医药
实体肿瘤的进行性生长依赖于其诱导产生的血管网的建立，以满足肿瘤细胞不断增殖的供氧和营养的需要。在脑肿瘤中，内皮细胞增殖所至的新生血管形成是神经胶质瘤的一个分级标准，所有实体性肿瘤均表现为高度血管增殖，脑恶性肿瘤的浸润常沿血管径路发生，血管形成对肿瘤的生长和转移有重要的影响[4]。肿瘤能产生各种血管因子并促进肿瘤新生血管形成。在已发现的诸多血管生成因子中，肝素结合生长因子(bFGF、ECGF)与肿瘤发生发展的线索最多，实验结果表明，bFGF在体外对培养的小牛胚胎血清(BAE)细胞有促进管状结构形成和在体内对移植鼠脑肿瘤有促进新生血管形成的作用[5，6]。本实验是在动物自然生存状态下在肿瘤发生的早期(120天)给予bFGF，从整体观察了bFGF对肿瘤的发生和发展的影响。所采用的给药方法是经脑立体定向一次性颞叶实质内注药。结果发现注射bFGF组的正常脑实质内血管面积、血管数均高于对照组，且分布弥散，说明药物在脑实质内同样可以通过吸收和弥散作用于全脑。注射bFGF组脑肿瘤内部的新生血管面积和血管数既高于对照组肿瘤内部，也高于同组瘤外正常脑组织内的新生血管面积和血管数。bFGF的给药为120天，正值该模型肿瘤发生的早期阶段，30天后观察发现bFGF组的肿瘤发生率为85%，而对照组为60%，结合文献我们认为bFGF组的肿瘤发生率有高于对照组的趋势。至于肿瘤发生前既潜伏期内90天给药是否可能增加肿瘤的发生率尚需进一步探讨。
, 百拇医药
参考文献
[1] CraftD，et al.Natl Cancer Inst Monogr 1977；46：11.
[2] 陈柄桓，等.北京医学 1981；3(1)：15.
[3] Mennel HD，et al.Exp Path 1985；28：207.
[4] 陶厚权，等.国外医学神经病学神经外科学分册 1996；23(3)：146.
[5] Gately S，et al.Neurosurgery 1995；37(4)：723.
[6] Tatsuga，et al.J Clin Invest 1993；92(6)：54.
(1998年9月5日收稿 1999年2月11日修回), http://www.100md.com
单位：杨 军:苏州市第二人民医院；尤玉才 张彦芳 王象昌:北京医科大学第一医院 邮政编码：215002
关键词：脑肿瘤 动物模型 亚硝基乙基脲 碱性成纤维细胞生长因子
江苏医药991102 摘要 孕鼠经腹腔一次性给予亚硝基乙基脲(ENU)可引起子代鼠中较高的脑肿瘤发生，并且与人类脑肿瘤发生的高峰期、类型及好发部位相似。建立该肿瘤模型其方法简便、经济、观察时间短，为肿瘤发生前、肿瘤发生早期及发生后不同阶段的观察提供了条件。经脑立体定向一次性颞叶实质内注射碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)其肿瘤内的新生血管面积和血管数既高于对照组肿瘤内，也高于同组瘤外正常组织内的新生血管面积和血管数。提示bFGF可以促进肿瘤内新生血管形成，也可能是影响肿瘤生长的原因。
Animal Model of Transplacental Ethylnitrosourea-induced Brain Tumor
, 百拇医药
and the Effect of bFGF on its Incidence and Growth
Yang Jun et al
Second Affiliated Hospital，Suzhou Medical College，Suzhou
Abstract High incidence of brain tumor was found in offspring rats after intraperitoneally injection of Ethylnitrosourea (ENU) into pregnant rats.The tumors demonstrated the similar features to human brain tumor in type，location and the peak of onset.This simple，inexpensive and stable method is helpful in observing tumors of various stages.After stereotactic injection of bFGF to temporal lobe，the areas and numbers of intratumoral neovessels were significantly higher than that in both extratumor tissues of the same group and intratumoral samples of the control rats without bFGF.
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Key words Brain tumor Animal model Ethylnitrosourea Basic fibroblast growth factor
脑肿瘤动物模型的建立一直是探索肿瘤发病机制和治疗的实验基础。本实验使用亚硝基乙基脲(ENU)一次性经腹膜下注射到孕17天SD大鼠体内，建立了经胎盘诱发原发性脑肿瘤动物模型，并利用这一模型经脑立体定向方法脑实质内注入bFGF对肿瘤发生发展的影响进行了观察。
材料与方法
一、试剂、仪器设备：ENU100mg/支，bFGF 250μg/支，Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)0.2ml/支。鼠脑立体定向仪。IBSA486细胞图像分析仪。
二、实验动物：选SD孕17天大鼠18只。
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三、方法：
1.脑肿瘤诱发 取SD孕17天大鼠10只，经腹腔注射ENU100mg/kg。产子鼠120只，子鼠处死时间分别在30、60、90、120天各20只，150天40只。另取SD孕17天大鼠8只，产子鼠后即腹腔内注射ENU100mg/kg，共产子鼠100只，母乳喂养30天后雌雄分开。子鼠处死时间在30、60、90、120和150天各20只。
2.鼠脑立体定向 取120天脑肿瘤诱发子鼠40只，每组20只，一组经脑立体定向脑内注射bFGF，剂量10μl/只。另一组注射生理盐水为对照组，剂量10μl/只。采用SN2型鼠脑立体定向仪。定向以前囟为零点，分别以前囟前3mm、右侧2mm、深度3～4mm为X、Y、Z轴。穿刺针到达右侧颞叶为靶点。用剪碎的明胶海绵溶于bFGF和生理盐水各10μl注入靶点，喂养30天后，处死取脑。
3.取材、制片与染色 用10%福尔马林磷酸缓冲液灌注后开颅取脑，将脑组织固定在10%福尔马林磷酸缓冲液中，用于制作光镜标本。石蜡切片，HE染色，免疫组织化学染色(胶质纤维酸性蛋白)。
, 百拇医药
四、统计分析：资料用Spsspc统计软件。
结 果
一、孕期注药子鼠在120天(20只)石蜡切片光镜下发现肿瘤7例，发生率为35%，共有8个肿瘤，脑室旁白质内肿瘤4个、脑叶白质内肿瘤2个、脑室内肿瘤2个。子鼠150天(40只)石蜡切片光镜下发现肿瘤29例，发生率为72.5%，共有46个肿瘤，多发肿瘤13例，其中4个肿瘤1例、3个肿瘤2例、2个肿瘤10例。肿瘤位于脑室旁白质内24个，脑叶白质内12个，脑室内肿瘤10个。子鼠在30天、60天、90天(各20只)石蜡切片光镜下未发现肿瘤生长。全部肿瘤行GFAP抗体免疫组化染色，54个肿瘤中34个GFAP阳性为星形细胞瘤，12个为室管膜肿瘤，5个为肿瘤样增生(GFAP阴性)，2个混合性肿瘤(GFAP部分阳性)，1个性质难定(GFAP阴性)。经卡方检验，鼠龄120天与鼠龄150天的肿瘤发生率差异有显著性(P＝0.0052)。
二、产后诱发子鼠在30、60、90、120、150天石蜡切片光镜下均未发现肿瘤生长。
, 百拇医药
三、bFGF组鼠龄150天(20只)发生肿瘤17例，发生率为85%，共有29个肿瘤，多发肿瘤8例，脑实质内肿瘤22个，脑室内肿瘤7个。肿瘤直径大于300μm25个。生理盐水对照组鼠龄150天(20只)，发生肿瘤12例，发生率为60%，共有17个肿瘤，多发肿瘤5例，脑实质内肿瘤14个，脑室内肿瘤3个。肿瘤直径大于300μm7个。经卡方检验bFGF组与生理盐水对照组肿瘤发生率差异无显著性，但有增高的趋势(P＝0.058)。经t检验两组肿瘤直径及截面积差异有显著性(P<0.01)；两组肿瘤内血管面积和血管数差异有显著性(P<0.05)；两组脑血管面积和血管数差异有显著性(P<0.05)。经t检验bFGF组肿瘤内与同体脑实质内血管面积、血管数差异有显著性(P<0.05)。
讨 论
研究发现，生命的过程和疾病的发生都受到基因编码的控制，在胚胎期受到致癌因子的影响时最易发生基因编码的改变。在孕期采取化学药物诱发肿瘤动物模型也逐渐受到人们的重视。而以往的研究中均是在诱发鼠出现症状或在观察相当长的时期内进行的[1～3]。本实验将孕17天SD大鼠经腹膜下注射ENU100mg/kg，分别在30、60、90、120、150天五个阶段对脑肿瘤的发生、部位、类型进行研究的。结果表明：经胎盘一次性给予一定剂量的致癌物可引起较高的脑肿瘤发生率，且肿瘤的发生具有一个潜伏期(90～120天)。而鼠龄150天的肿瘤发生率(72.5%)高于鼠龄120天的肿瘤发生率(35%)(P<0.05)。150天的大鼠相当于成年，此与人类脑肿瘤发生的高峰期相似。实验发生的54个脑肿瘤中星形细胞瘤34个，室管膜瘤12个，发生率达85%，肿瘤位于脑室旁白质内28个(52%)，产后注药母乳喂养组无1例发生脑肿瘤，说明孕期注射ENU的肿瘤发生与产后持续母乳喂养无关。综上所述，孕17天大鼠一次性给予ENU时，子代鼠在出生后150天发生脑肿瘤的时间、部位、类型与人类相似。该模型的建立方法简便、经济、观察时间短、肿瘤发生率高，与一个完善的肿瘤模型所具备的条件接近。同时，由于该模型具有一个明显的潜伏期(90～120天)，这就为肿瘤发生前、肿瘤发生早期及发生后不同阶段的观察提供条件。造成子代鼠基因编码的改变是在胚胎期，而肿瘤的发生是在成年期，加上大多数子代鼠肯定会发生肿瘤，这就为研究肿瘤发生前的基因连锁变化提供了条件。孕期大鼠一次性接触致癌因子足可使子代鼠在成年发生肿瘤，这一现象提示成年脑肿瘤患者可能与胚胎期接触致癌物有关。
, 百拇医药
实体肿瘤的进行性生长依赖于其诱导产生的血管网的建立，以满足肿瘤细胞不断增殖的供氧和营养的需要。在脑肿瘤中，内皮细胞增殖所至的新生血管形成是神经胶质瘤的一个分级标准，所有实体性肿瘤均表现为高度血管增殖，脑恶性肿瘤的浸润常沿血管径路发生，血管形成对肿瘤的生长和转移有重要的影响[4]。肿瘤能产生各种血管因子并促进肿瘤新生血管形成。在已发现的诸多血管生成因子中，肝素结合生长因子(bFGF、ECGF)与肿瘤发生发展的线索最多，实验结果表明，bFGF在体外对培养的小牛胚胎血清(BAE)细胞有促进管状结构形成和在体内对移植鼠脑肿瘤有促进新生血管形成的作用[5，6]。本实验是在动物自然生存状态下在肿瘤发生的早期(120天)给予bFGF，从整体观察了bFGF对肿瘤的发生和发展的影响。所采用的给药方法是经脑立体定向一次性颞叶实质内注药。结果发现注射bFGF组的正常脑实质内血管面积、血管数均高于对照组，且分布弥散，说明药物在脑实质内同样可以通过吸收和弥散作用于全脑。注射bFGF组脑肿瘤内部的新生血管面积和血管数既高于对照组肿瘤内部，也高于同组瘤外正常脑组织内的新生血管面积和血管数。bFGF的给药为120天，正值该模型肿瘤发生的早期阶段，30天后观察发现bFGF组的肿瘤发生率为85%，而对照组为60%，结合文献我们认为bFGF组的肿瘤发生率有高于对照组的趋势。至于肿瘤发生前既潜伏期内90天给药是否可能增加肿瘤的发生率尚需进一步探讨。
, 百拇医药
参考文献
[1] CraftD，et al.Natl Cancer Inst Monogr 1977；46：11.
[2] 陈柄桓，等.北京医学 1981；3(1)：15.
[3] Mennel HD，et al.Exp Path 1985；28：207.
[4] 陶厚权，等.国外医学神经病学神经外科学分册 1996；23(3)：146.
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[6] Tatsuga，et al.J Clin Invest 1993；92(6)：54.
(1998年9月5日收稿 1999年2月11日修回), http://www.100md.com