兔自体静脉移植物的中膜平滑肌细胞超微结构变化*
作者：曲乐丰 景在平 曹贵松
单位：第二军医大学长海医院血管外科，上海，2000433
关键词：自体静脉移植物；血管平滑肌细胞；超微结构；内膜增生
第二军医大学学报991108 摘要 目的：观察自体静脉移植物的中膜平滑肌细胞超微结构变化及其增生特点，为内膜增生的防治提供实验依据。方法：以兔右颈外静脉间置于同侧颈总动脉为模型，术后3，7，14，28 d分别获取移植段静脉，在透射电镜下观察其中膜平滑肌细胞超微结构的变化。结果：术后3 d时未见移植段静脉中膜平滑肌细胞增生，7 d时可见增生，14 d时达高峰，可见正在分裂中的平滑肌细胞呈哑铃形，胞质内内质网和线粒体等丰富，核仁明显变大。28 d时增生则以胞外基质形成为主。结论：兔自体静脉移植后7 d时中膜平滑肌细胞开始增生并游移至内膜参与形成新内膜，2周左右增生达高峰，此时为通过抑制平滑肌细胞增生来抑制内膜增生的最佳时机。
, http://www.100md.com
中图分类号 R 654.3 文献标识码：A
Ultrastructure changes of medial smooth muscle cells in rabbit autogenous vein graft
Qu Lefeng，Jing Zaiping，Cao Guisong (Department of Vascular Surgery,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective:To observe ultrastructure changes in autogenous vein graft medial smooth muscle cells in treatment of intimal hyperplasia.Methods:The right external jugular vein of rabbit was interposed between ipsilateral common carotid artery and the vein graft was harvested 3,7,14 and 28 d postoperatively,the ultrastructure of medial smooth muscle cells was observed under electron microscope.Results:There were no special changes of smooth muscle cells at 3rd day.The proliferation changes could be seen on the 7th day,the proliferation peak was on the 14th day and the proliferating smooth muscle cell was dumbbell-like,the cytoplasm was rich of endoplasmic reticulum and mitochondria,the core of nuclear became much larger.On the 28th day,the extracellular matrix dominated.Conclusion:After autogenous grafting,the medial smooth muscle cells begin proliferating and migrating to intima, joining the formation of neointima on the 7th day,the proliferation peak around 14 days hints an optimal opportunity for inhibition of intimal hyperplasia.
, 百拇医药
KEY WORDS autogenous vein graft;vascular smooth muscle cells; ultrastructure;intimal hyperplasia
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(11): 848～850]
自体静脉(如大隐静脉、前臂静脉)在血管搭桥或成形术中的应用已较为普及，但血管内膜增生导致的自体静脉狭窄是此类血管手术中远期疗效差乃至失败的主要原因[1]，而血管平滑肌细胞增生又是血管内膜增生的中心环节。本研究以兔右颈外静脉间置于同侧颈总动脉为模型，在不同的时间点取移植段静脉在透射电镜下观察其中膜平滑肌细胞的超微结构变化，了解其增生情况，为内膜增生的防治提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 雄性新西兰兔12只(购于海军医学研究所实验动物中心)，体质量2.5～3.0 kg。
, http://www.100md.com
1.2 兔自体静脉移植模型的建立 以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉注射麻醉成功后将动物固定于手术台上。剪毛、消毒、铺无菌巾单，颈正中线切口，游离出右侧颈外静脉及颈总动脉，在颈总动脉的上、下两端用无创动脉夹阻断血流后，横断血管，取右侧颈外静脉约2.0 cm间置于同侧颈总动脉之间，以8-0缝线采用间断外翻法行端端吻合，每个吻合口缝8针。检查无出血及吻合口漏血后即缝合伤口。麻醉时及术毕腹腔各注射头孢拉定0.5 g，术后皮下注射肝素6 250 U。动物置于温度适宜的清洁通风环境中饲养。
1.3 原位灌注固定及取材 术后3，7，14，28 d各取3只动物，以3%戊巴比妥钠同法麻醉后打开胸腔，将导管插至左心室主动脉出口处，用4%多聚甲醛溶液进行原位灌注固定。固定充分后取下移植段静脉，固定于2.5%戊二醛中以备电镜制片。
1.4 透射电镜标本制备 移植段静脉在2.5%戊二醛中固定2 h，PBS漂洗3次，修块，1%锇酸固定1 h，PBS漂洗3次，每次10 min，而后乙醇逐级脱水，Poly/Bed 812包埋后超微切片(厚400 nm)，铀染色30 min，铅染色10 min，JEM-100SX透射电镜下观察。
, 百拇医药
2 结 果
术后3 d组未见移植段静脉中膜平滑肌细胞增生，平滑肌细胞排列较整齐，其间散在胶原纤维，平滑肌细胞内未见明显变化。
7 d组则见移植静脉中膜平滑肌细胞排列稍紊乱，平滑肌细胞较肥大，周围为胶原纤维等(图1A)。
14 d组见移植静脉中膜平滑肌细胞增生活跃，可见正在分裂中的平滑肌细胞呈哑铃形(图1B)，胞质内内质网呈管状、囊泡状，特别丰富，并可见运输小泡及线粒体，胞核内染色质聚集，核仁明显变大(图1C)。
28 d组见移植静脉中膜平滑肌细胞增生趋于静止，常见较多的胶原纤维等围绕平滑肌细胞(图1D)。
图1 兔自体静脉移植物中膜超微结构变化
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Fig 1 Ultrastructure changes of media in rabbit
autogenous vein graft
A:7th day postoperation (×2 000);B:14th day postoperation
(×2 500);C:14th day postoperation (×15 000);D:28th
day postoperation (×1 000)
3 讨 论
随着生活水平的提高、饮食习惯的改变及老龄化社会的到来，冠心病、动脉硬化闭塞症等血管闭塞性疾病的发病率日趋增高，血管搭桥或成形术是外科治疗这类疾病的主要方法，自体静脉如大隐静脉、臂静脉等则成为首选移植物，但术后半年到两年约一半以上的患者症状复发而需再次手术，失败的主要原因之一是移植物内膜增生导致的管腔再狭窄[1]。研究表明血管平滑肌细胞的增生是移植物内膜增生的中心环节，主要是中膜的平滑肌细胞增生并向内膜游移，但既往的研究多集中在增生的内膜方面，较少见对中膜平滑肌的研究。
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自体静脉在动脉旁路术后的损伤主要是手术操作中的损伤及高压、高速动脉血流的损伤及缺血再灌注损伤。手术中的机械损伤致内皮细胞、中膜平滑肌细胞等直接受损而释放内皮细胞生长因子(EGF)、血小板源性细胞生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGFS)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，同时血小板在受损血管处粘附激活后释放生长因子，从而启动自身修复过程，导致平滑肌细胞增生及胞外基质沉积[2]。移植静脉在动脉血流的冲击下内皮细胞受损，释放多种生长因子，同样，粘附的血小板被激活而释放生长因子，促使平滑肌细胞增生。缺血再灌注也主要是使内皮受损后释放生长因子促使平滑肌细胞增生。
本实验结果显示，自体移植静脉在3 d时中膜平滑肌细胞未见增生，7 d时见平滑肌细胞排列稍紊乱，肥大，周围为胶原纤维等，提示已开始增生。14 d时(图1C)见胞质内内质网丰富，提示合成蛋白质旺盛，在为增生作准备，运输小泡则将内质网合成的蛋白质运送到高尔基体进一步加工修饰，线粒体通过氧化作用产生ATP供能给细胞增生，胞核内染色质聚集，提示染色质可能在复制中，核仁是细胞制造核糖体的装置，核仁变大提示蛋白合成旺盛，以上细胞器的变化均说明细胞处在增生中。最直接的论据是可见到呈哑铃形的平滑肌细胞(图1B)，说明正处在分裂中。至28 d时平滑肌细胞增生趋于静止，胶原纤维等增多。但很多研究[3，4]，包括我们自己的研究(待发表)均发现移植静脉中膜的厚度较自体正常静脉的厚度并无明显增厚，那么中膜增生的平滑肌细胞到哪里去了呢?推测其去向可能系游离至内膜参与新内膜形成了。但目前一直未找到标记中膜平滑肌细胞而示踪其去向的成熟方法，此问题有待进一步研究。
, 百拇医药
总之，本研究提示自体静脉移植后14 d左右中膜平滑肌细胞增生达高峰并向内膜游移，是为通过抑制平滑肌细胞增生来抑制内膜增生的最佳时机，为内膜增生的防治提供了实验依据。
*国家自然科学基金资助项目,批准号39670707
作者简介：曲乐丰，1970年9月生，博士生
参考文献
1 Davies AH,Magee TR,Sheffield E,et al.The aetiology of vien graft stenoses[J].Eur J Vasc Surg,1994,8(4):389
2 Neschis DG,Safford SD,Hanna AK,et al.Antisense basic fibroblast growth factor gene transfer reduces early intimal thickening in a rabbit femoral artery balloon injury model[J].J Vasc Surg,1998,27(1):126
, http://www.100md.com
3 Fulton GJ,Davies MG,Koch WJ,et al.Antisense oligonucleotide to proto-oncogene c-myb inhibits the formation of intimal hyperplasia in experimental vein grafts[J].J Vasc Surg,1997,25(3):453
4 Fulton GJ,Davies MG,Barber L,et al.Localized versus systemic angiotensin Ⅱ receptor inhibition of intimal hyperplasia in experimental vein grafts by the specific angiotensin Ⅱ receptor inhibitor L158,809[J].Surgery,1998,123(2):218
(1999-06-02收稿，1999-09-24修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院血管外科，上海，2000433
关键词：自体静脉移植物；血管平滑肌细胞；超微结构；内膜增生
第二军医大学学报991108 摘要 目的：观察自体静脉移植物的中膜平滑肌细胞超微结构变化及其增生特点，为内膜增生的防治提供实验依据。方法：以兔右颈外静脉间置于同侧颈总动脉为模型，术后3，7，14，28 d分别获取移植段静脉，在透射电镜下观察其中膜平滑肌细胞超微结构的变化。结果：术后3 d时未见移植段静脉中膜平滑肌细胞增生，7 d时可见增生，14 d时达高峰，可见正在分裂中的平滑肌细胞呈哑铃形，胞质内内质网和线粒体等丰富，核仁明显变大。28 d时增生则以胞外基质形成为主。结论：兔自体静脉移植后7 d时中膜平滑肌细胞开始增生并游移至内膜参与形成新内膜，2周左右增生达高峰，此时为通过抑制平滑肌细胞增生来抑制内膜增生的最佳时机。
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中图分类号 R 654.3 文献标识码：A
Ultrastructure changes of medial smooth muscle cells in rabbit autogenous vein graft
Qu Lefeng，Jing Zaiping，Cao Guisong (Department of Vascular Surgery,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective:To observe ultrastructure changes in autogenous vein graft medial smooth muscle cells in treatment of intimal hyperplasia.Methods:The right external jugular vein of rabbit was interposed between ipsilateral common carotid artery and the vein graft was harvested 3,7,14 and 28 d postoperatively,the ultrastructure of medial smooth muscle cells was observed under electron microscope.Results:There were no special changes of smooth muscle cells at 3rd day.The proliferation changes could be seen on the 7th day,the proliferation peak was on the 14th day and the proliferating smooth muscle cell was dumbbell-like,the cytoplasm was rich of endoplasmic reticulum and mitochondria,the core of nuclear became much larger.On the 28th day,the extracellular matrix dominated.Conclusion:After autogenous grafting,the medial smooth muscle cells begin proliferating and migrating to intima, joining the formation of neointima on the 7th day,the proliferation peak around 14 days hints an optimal opportunity for inhibition of intimal hyperplasia.
, 百拇医药
KEY WORDS autogenous vein graft;vascular smooth muscle cells; ultrastructure;intimal hyperplasia
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(11): 848～850]
自体静脉(如大隐静脉、前臂静脉)在血管搭桥或成形术中的应用已较为普及，但血管内膜增生导致的自体静脉狭窄是此类血管手术中远期疗效差乃至失败的主要原因[1]，而血管平滑肌细胞增生又是血管内膜增生的中心环节。本研究以兔右颈外静脉间置于同侧颈总动脉为模型，在不同的时间点取移植段静脉在透射电镜下观察其中膜平滑肌细胞的超微结构变化，了解其增生情况，为内膜增生的防治提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 雄性新西兰兔12只(购于海军医学研究所实验动物中心)，体质量2.5～3.0 kg。
, http://www.100md.com
1.2 兔自体静脉移植模型的建立 以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉注射麻醉成功后将动物固定于手术台上。剪毛、消毒、铺无菌巾单，颈正中线切口，游离出右侧颈外静脉及颈总动脉，在颈总动脉的上、下两端用无创动脉夹阻断血流后，横断血管，取右侧颈外静脉约2.0 cm间置于同侧颈总动脉之间，以8-0缝线采用间断外翻法行端端吻合，每个吻合口缝8针。检查无出血及吻合口漏血后即缝合伤口。麻醉时及术毕腹腔各注射头孢拉定0.5 g，术后皮下注射肝素6 250 U。动物置于温度适宜的清洁通风环境中饲养。
1.3 原位灌注固定及取材 术后3，7，14，28 d各取3只动物，以3%戊巴比妥钠同法麻醉后打开胸腔，将导管插至左心室主动脉出口处，用4%多聚甲醛溶液进行原位灌注固定。固定充分后取下移植段静脉，固定于2.5%戊二醛中以备电镜制片。
1.4 透射电镜标本制备 移植段静脉在2.5%戊二醛中固定2 h，PBS漂洗3次，修块，1%锇酸固定1 h，PBS漂洗3次，每次10 min，而后乙醇逐级脱水，Poly/Bed 812包埋后超微切片(厚400 nm)，铀染色30 min，铅染色10 min，JEM-100SX透射电镜下观察。
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2 结 果
术后3 d组未见移植段静脉中膜平滑肌细胞增生，平滑肌细胞排列较整齐，其间散在胶原纤维，平滑肌细胞内未见明显变化。
7 d组则见移植静脉中膜平滑肌细胞排列稍紊乱，平滑肌细胞较肥大，周围为胶原纤维等(图1A)。
14 d组见移植静脉中膜平滑肌细胞增生活跃，可见正在分裂中的平滑肌细胞呈哑铃形(图1B)，胞质内内质网呈管状、囊泡状，特别丰富，并可见运输小泡及线粒体，胞核内染色质聚集，核仁明显变大(图1C)。
28 d组见移植静脉中膜平滑肌细胞增生趋于静止，常见较多的胶原纤维等围绕平滑肌细胞(图1D)。
图1 兔自体静脉移植物中膜超微结构变化
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Fig 1 Ultrastructure changes of media in rabbit
autogenous vein graft
A:7th day postoperation (×2 000);B:14th day postoperation
(×2 500);C:14th day postoperation (×15 000);D:28th
day postoperation (×1 000)
3 讨 论
随着生活水平的提高、饮食习惯的改变及老龄化社会的到来，冠心病、动脉硬化闭塞症等血管闭塞性疾病的发病率日趋增高，血管搭桥或成形术是外科治疗这类疾病的主要方法，自体静脉如大隐静脉、臂静脉等则成为首选移植物，但术后半年到两年约一半以上的患者症状复发而需再次手术，失败的主要原因之一是移植物内膜增生导致的管腔再狭窄[1]。研究表明血管平滑肌细胞的增生是移植物内膜增生的中心环节，主要是中膜的平滑肌细胞增生并向内膜游移，但既往的研究多集中在增生的内膜方面，较少见对中膜平滑肌的研究。
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自体静脉在动脉旁路术后的损伤主要是手术操作中的损伤及高压、高速动脉血流的损伤及缺血再灌注损伤。手术中的机械损伤致内皮细胞、中膜平滑肌细胞等直接受损而释放内皮细胞生长因子(EGF)、血小板源性细胞生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGFS)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，同时血小板在受损血管处粘附激活后释放生长因子，从而启动自身修复过程，导致平滑肌细胞增生及胞外基质沉积[2]。移植静脉在动脉血流的冲击下内皮细胞受损，释放多种生长因子，同样，粘附的血小板被激活而释放生长因子，促使平滑肌细胞增生。缺血再灌注也主要是使内皮受损后释放生长因子促使平滑肌细胞增生。
本实验结果显示，自体移植静脉在3 d时中膜平滑肌细胞未见增生，7 d时见平滑肌细胞排列稍紊乱，肥大，周围为胶原纤维等，提示已开始增生。14 d时(图1C)见胞质内内质网丰富，提示合成蛋白质旺盛，在为增生作准备，运输小泡则将内质网合成的蛋白质运送到高尔基体进一步加工修饰，线粒体通过氧化作用产生ATP供能给细胞增生，胞核内染色质聚集，提示染色质可能在复制中，核仁是细胞制造核糖体的装置，核仁变大提示蛋白合成旺盛，以上细胞器的变化均说明细胞处在增生中。最直接的论据是可见到呈哑铃形的平滑肌细胞(图1B)，说明正处在分裂中。至28 d时平滑肌细胞增生趋于静止，胶原纤维等增多。但很多研究[3，4]，包括我们自己的研究(待发表)均发现移植静脉中膜的厚度较自体正常静脉的厚度并无明显增厚，那么中膜增生的平滑肌细胞到哪里去了呢?推测其去向可能系游离至内膜参与新内膜形成了。但目前一直未找到标记中膜平滑肌细胞而示踪其去向的成熟方法，此问题有待进一步研究。
, 百拇医药
总之，本研究提示自体静脉移植后14 d左右中膜平滑肌细胞增生达高峰并向内膜游移，是为通过抑制平滑肌细胞增生来抑制内膜增生的最佳时机，为内膜增生的防治提供了实验依据。
*国家自然科学基金资助项目,批准号39670707
作者简介：曲乐丰，1970年9月生，博士生
参考文献
1 Davies AH,Magee TR,Sheffield E,et al.The aetiology of vien graft stenoses[J].Eur J Vasc Surg,1994,8(4):389
2 Neschis DG,Safford SD,Hanna AK,et al.Antisense basic fibroblast growth factor gene transfer reduces early intimal thickening in a rabbit femoral artery balloon injury model[J].J Vasc Surg,1998,27(1):126
, http://www.100md.com
3 Fulton GJ,Davies MG,Koch WJ,et al.Antisense oligonucleotide to proto-oncogene c-myb inhibits the formation of intimal hyperplasia in experimental vein grafts[J].J Vasc Surg,1997,25(3):453
4 Fulton GJ,Davies MG,Barber L,et al.Localized versus systemic angiotensin Ⅱ receptor inhibition of intimal hyperplasia in experimental vein grafts by the specific angiotensin Ⅱ receptor inhibitor L158,809[J].Surgery,1998,123(2):218
(1999-06-02收稿，1999-09-24修回), 百拇医药