转导Caspase-1基因对人胃癌细胞药物敏感性的影响
作者：薛绪潮 方国恩 钱其军 华积德
单位：第二军医大学长海医院普通外科，上海，200433；钱其军 第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫和基因治疗研究所
关键词：基因；Caspase-1；胃肿瘤；基因治疗
第二军医大学学报991142 许多研究表明, 化学药物对敏感肿瘤细胞有促凋亡作用[1，2] 。胃癌的发生发展与肿瘤细胞凋亡受抑有关，而且胃癌细胞对化疗药物的敏感性差。Caspase-1基因是哺乳动物细胞促凋亡基因，转染该基因可使肿瘤细胞的增殖受抑，但对化疗药物的敏感性如何尚未见报道。为全面了解转导Caspase-1基因后肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，本实验观察了4种化疗药物对转染Caspase-1基因的胃癌细胞的杀伤作用。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 质粒、逆转录病毒载体构建及转染胃癌细胞株 人Caspase-1-pGEM-1质粒由美国Tocci 博士惠赠, 逆转录病毒载体pLXSN由美国CWBU大学肿瘤免疫基因治疗中心提供, X-108人胃癌细胞株(低分化腺癌)由长海医院自建，包装细胞系PA317由中科院上海生化所提供。逆转录病毒载体构建及鉴定Caspase-1基因转导胃癌细胞、筛选及克隆、培养参见常规方法。
1.2 细胞及培养条件 人胃癌细胞株X-108、 X-108- neo及X-108-Caspase-1分别悬浮在含有15%小牛血清的RPMI 1640完全培养液中，置于5% CO2，37℃湿化孵育箱中培养。
1.3 药品与仪器 阿霉素(ADM)、卡铂(CBP)、丝裂霉素(MMC)、5-氟脲嘧啶(5-Fu)均为市售针剂。每种药物配制成实验药物浓度，-20℃保存。MTT(Sigma 产品)质量浓度为5 mg/ml，二甲基亚枫(DMSO)，北京化工厂产品。酶标仪450型(伯乐公司产品)。
, 百拇医药
1.4 方法 分别取X-108、X-108-neo及X-108-Caspase-1对数生长期细胞用胰酶消化，加入RPMI 1640完全培养液制成浓度为1.0×105/ml细胞悬液,接种于96孔平底细胞培养板中100 μl/孔,分别加入不同浓度的化疗药物10 μl/孔,每个浓度3个复孔,对照5个复孔。置入5% CO2,37℃湿化孵育箱中培养，48 h后加入MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，继续培养4 h，快速翻板后加入DMSO 100 μl/孔，置酶标仪测D(570)值。按杀伤率＝(1-实验组平均D值/对照组平均D值)×100%，计算4种药物对两株细胞的杀伤率。两组LD50比较采用t检验。
2 结 果
药物对X-108、X-108-neo 及X-108-Caspase-1细胞的杀伤率测定见表1。结果表明随着药物质量浓度增加，每个细胞系的杀伤率都有不同程度的升高，ADM、MMC及5-Fu 3种药物对X-108、X-108-neo及X-108-Caspase-1细胞株之间的杀伤率相比较均无统计学意义(P>0.05)。CBP对X-108、X-108-neo及X-108-Caspase-1细胞株的杀伤率随着药物浓度的升高而增加，X-108、X-108-neo之间相比无明显差异(P>0.05)，两者与X-108-Caspase-1细胞株相比较差异显著(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 药物ADM、5-FU、MMC及CBP对胃癌细胞株的杀伤率(%) 药物
质量浓度
(ρB/μg.ml-1)
X-108
X-108-neo
X-108-Caspase-1
±s
LD50±s
LD50±s
, http://www.100md.com
LD50
ADM
0.1
12.4±1.3
1.5 ±0.3
19.8±1.9
1.6±0.4
20.3±2.2
1.4 ±0.2
1.0
45.7±1.3
46.8±2.8
, 百拇医药
50.4±3.4
5.0
57.3±3.2
56.2±2.7
58.6±3.1
10.0
73.1±2.5
68.7±3.1
69.2±4.5
MMC
1.0
30.5±0.4
, 百拇医药
11.2 ±0.5
28.9±1.2
10.5±0.6
31.8±0.6
10.3 ±0.4
5.0
38.2±4.1
38.1±3.7
38.7±3.1
10.0
43.5±0.5
43.2±2.8
, 百拇医药
45.1±2.1
20.0
63.3±1.3
65.4±1.9
64.3±3.2
5-FU
10.0
24.5±2.1
121.0 ±4.1
26.2±1.8
116.0±1.6
28.8±1.5
, 百拇医药
112.8 ±3.2
50.0
36.4±0.2
30.2±0.4
33.7±1.2
100.0
44.6±3.6
45.1±3.0
47.3±2.6
150.0
68.6±3.2
68.3±2.9
, 百拇医药
72.1±3.6
CBP
0.2
0
41.57±2.3**
0
43.5±3.2**
14.8±0.7
11.67±1.4
2
8.3±1.2**
7.9±0.6**
, 百拇医药
29.0±2.1
20
23.4±3.1**
22.9±1.8**
57.5±3.2
80
75.2±2.8**
78.9±4.2**
96.2±3.5
**P<0.01与CBP组的X-108-Caspase-1比较3 讨 论
, http://www.100md.com
胃癌患者首选治疗方法是手术切除，然后给予化疗。但是化疗存在着耐药性，不能达到对肿瘤细胞的全面杀伤，并且不敏感的化疗药物削弱了机体的免疫功能，使患者遭到适得其反的结果，因此提高肿瘤对化疗药物的敏感性及选用敏感的化疗药物对胃癌的进一步治疗显得很重要。我们设想用转基因的手段，把促凋亡基因导入胃癌细胞中，一方面使胃癌细胞的凋亡增加，另一方面提高化疗药物的敏感性。本实验用逆转录病毒pLXSN为载体，将促凋亡基因Caspase-1导入胃癌细胞X-108中，观察化疗药物敏感性的变化，结果表明，转导Caspase-1基因，可使胃癌细胞对化疗药物卡铂的敏感性提高，使其对胃癌细胞的杀伤率增加。
Kondo等[3]研究表明顺铂在体外诱导小鼠及人脑胶质瘤细胞凋亡，证实顺铂促进Caspase-1mRNA过度表达，这种凋亡又能被Caspase-1的特异抑制剂AC-YVAD-CMK及Bcl-2、bcl-xl、CrmA所阻断，从而说明Caspase-1基因介导了顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡。卡铂属于与细胞核DNA直接作用的烷化剂，与顺铂的作用机制相同，通过直接结合细胞核DNA上尿嘧啶及胞嘧啶而造成细胞DNA的损伤，改变细胞的遗传性状，产生诱导凋亡的信号，使Caspase-1基因的表达增加，激活凋亡通路，肿瘤细胞发生凋亡，实现抗肿瘤的作用。本实验还揭示了Caspase-1基因导入胃癌细胞株并不是对每种化疗药物的敏感性都有增高,而是对某一种药物起作用。ADM、5-Fu 、MMC与DDP一样是细胞毒类药物，作用于核酸代谢的不同环节，诱导细胞凋亡，转导Caspase-1基因不能改变肿瘤细胞对ADM、 MMC及5-Fu的敏感性，其作用机制目前尚不太清楚，有待进一步的研究。
, http://www.100md.com
中图分类号 R 735.2 文献标识码：B
作者简介：薛绪潮，男，1963年9月生，硕士，主治医师
参考文献
1 Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease[J]. Science, 1995， 267(5203):1456
2 Dive C , Hickman JA. Drug-target interaction only the first step in the commitment to a programmed cell death[J]? Br J cancer, 1991， 64(1):192
3 Kondo S， Barna BP， Morimura T， et al. Interleukin-1β converting enzyme mediates cisplatin-induced apoptosis in malignant glioma cells. Cancer Res， 1995， 55(24): 6166
(1999-08-10收稿，1999-10-10修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院普通外科，上海，200433；钱其军 第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫和基因治疗研究所
关键词：基因；Caspase-1；胃肿瘤；基因治疗
第二军医大学学报991142 许多研究表明, 化学药物对敏感肿瘤细胞有促凋亡作用[1，2] 。胃癌的发生发展与肿瘤细胞凋亡受抑有关，而且胃癌细胞对化疗药物的敏感性差。Caspase-1基因是哺乳动物细胞促凋亡基因，转染该基因可使肿瘤细胞的增殖受抑，但对化疗药物的敏感性如何尚未见报道。为全面了解转导Caspase-1基因后肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，本实验观察了4种化疗药物对转染Caspase-1基因的胃癌细胞的杀伤作用。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 质粒、逆转录病毒载体构建及转染胃癌细胞株 人Caspase-1-pGEM-1质粒由美国Tocci 博士惠赠, 逆转录病毒载体pLXSN由美国CWBU大学肿瘤免疫基因治疗中心提供, X-108人胃癌细胞株(低分化腺癌)由长海医院自建，包装细胞系PA317由中科院上海生化所提供。逆转录病毒载体构建及鉴定Caspase-1基因转导胃癌细胞、筛选及克隆、培养参见常规方法。
1.2 细胞及培养条件 人胃癌细胞株X-108、 X-108- neo及X-108-Caspase-1分别悬浮在含有15%小牛血清的RPMI 1640完全培养液中，置于5% CO2，37℃湿化孵育箱中培养。
1.3 药品与仪器 阿霉素(ADM)、卡铂(CBP)、丝裂霉素(MMC)、5-氟脲嘧啶(5-Fu)均为市售针剂。每种药物配制成实验药物浓度，-20℃保存。MTT(Sigma 产品)质量浓度为5 mg/ml，二甲基亚枫(DMSO)，北京化工厂产品。酶标仪450型(伯乐公司产品)。
, 百拇医药
1.4 方法 分别取X-108、X-108-neo及X-108-Caspase-1对数生长期细胞用胰酶消化，加入RPMI 1640完全培养液制成浓度为1.0×105/ml细胞悬液,接种于96孔平底细胞培养板中100 μl/孔,分别加入不同浓度的化疗药物10 μl/孔,每个浓度3个复孔,对照5个复孔。置入5% CO2,37℃湿化孵育箱中培养，48 h后加入MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，继续培养4 h，快速翻板后加入DMSO 100 μl/孔，置酶标仪测D(570)值。按杀伤率＝(1-实验组平均D值/对照组平均D值)×100%，计算4种药物对两株细胞的杀伤率。两组LD50比较采用t检验。
2 结 果
药物对X-108、X-108-neo 及X-108-Caspase-1细胞的杀伤率测定见表1。结果表明随着药物质量浓度增加，每个细胞系的杀伤率都有不同程度的升高，ADM、MMC及5-Fu 3种药物对X-108、X-108-neo及X-108-Caspase-1细胞株之间的杀伤率相比较均无统计学意义(P>0.05)。CBP对X-108、X-108-neo及X-108-Caspase-1细胞株的杀伤率随着药物浓度的升高而增加，X-108、X-108-neo之间相比无明显差异(P>0.05)，两者与X-108-Caspase-1细胞株相比较差异显著(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 药物ADM、5-FU、MMC及CBP对胃癌细胞株的杀伤率(%) 药物
质量浓度
(ρB/μg.ml-1)
X-108
X-108-neo
X-108-Caspase-1
±sLD50
±sLD50
±s, http://www.100md.com
LD50
ADM
0.1
12.4±1.3
1.5 ±0.3
19.8±1.9
1.6±0.4
20.3±2.2
1.4 ±0.2
1.0
45.7±1.3
46.8±2.8
, 百拇医药
50.4±3.4
5.0
57.3±3.2
56.2±2.7
58.6±3.1
10.0
73.1±2.5
68.7±3.1
69.2±4.5
MMC
1.0
30.5±0.4
, 百拇医药
11.2 ±0.5
28.9±1.2
10.5±0.6
31.8±0.6
10.3 ±0.4
5.0
38.2±4.1
38.1±3.7
38.7±3.1
10.0
43.5±0.5
43.2±2.8
, 百拇医药
45.1±2.1
20.0
63.3±1.3
65.4±1.9
64.3±3.2
5-FU
10.0
24.5±2.1
121.0 ±4.1
26.2±1.8
116.0±1.6
28.8±1.5
, 百拇医药
112.8 ±3.2
50.0
36.4±0.2
30.2±0.4
33.7±1.2
100.0
44.6±3.6
45.1±3.0
47.3±2.6
150.0
68.6±3.2
68.3±2.9
, 百拇医药
72.1±3.6
CBP
0.2
0
41.57±2.3**
0
43.5±3.2**
14.8±0.7
11.67±1.4
2
8.3±1.2**
7.9±0.6**
, 百拇医药
29.0±2.1
20
23.4±3.1**
22.9±1.8**
57.5±3.2
80
75.2±2.8**
78.9±4.2**
96.2±3.5
**P<0.01与CBP组的X-108-Caspase-1比较3 讨 论
, http://www.100md.com
胃癌患者首选治疗方法是手术切除，然后给予化疗。但是化疗存在着耐药性，不能达到对肿瘤细胞的全面杀伤，并且不敏感的化疗药物削弱了机体的免疫功能，使患者遭到适得其反的结果，因此提高肿瘤对化疗药物的敏感性及选用敏感的化疗药物对胃癌的进一步治疗显得很重要。我们设想用转基因的手段，把促凋亡基因导入胃癌细胞中，一方面使胃癌细胞的凋亡增加，另一方面提高化疗药物的敏感性。本实验用逆转录病毒pLXSN为载体，将促凋亡基因Caspase-1导入胃癌细胞X-108中，观察化疗药物敏感性的变化，结果表明，转导Caspase-1基因，可使胃癌细胞对化疗药物卡铂的敏感性提高，使其对胃癌细胞的杀伤率增加。
Kondo等[3]研究表明顺铂在体外诱导小鼠及人脑胶质瘤细胞凋亡，证实顺铂促进Caspase-1mRNA过度表达，这种凋亡又能被Caspase-1的特异抑制剂AC-YVAD-CMK及Bcl-2、bcl-xl、CrmA所阻断，从而说明Caspase-1基因介导了顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡。卡铂属于与细胞核DNA直接作用的烷化剂，与顺铂的作用机制相同，通过直接结合细胞核DNA上尿嘧啶及胞嘧啶而造成细胞DNA的损伤，改变细胞的遗传性状，产生诱导凋亡的信号，使Caspase-1基因的表达增加，激活凋亡通路，肿瘤细胞发生凋亡，实现抗肿瘤的作用。本实验还揭示了Caspase-1基因导入胃癌细胞株并不是对每种化疗药物的敏感性都有增高,而是对某一种药物起作用。ADM、5-Fu 、MMC与DDP一样是细胞毒类药物，作用于核酸代谢的不同环节，诱导细胞凋亡，转导Caspase-1基因不能改变肿瘤细胞对ADM、 MMC及5-Fu的敏感性，其作用机制目前尚不太清楚，有待进一步的研究。
, http://www.100md.com
中图分类号 R 735.2 文献标识码：B
作者简介：薛绪潮，男，1963年9月生，硕士，主治医师
参考文献
1 Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease[J]. Science, 1995， 267(5203):1456
2 Dive C , Hickman JA. Drug-target interaction only the first step in the commitment to a programmed cell death[J]? Br J cancer, 1991， 64(1):192
3 Kondo S， Barna BP， Morimura T， et al. Interleukin-1β converting enzyme mediates cisplatin-induced apoptosis in malignant glioma cells. Cancer Res， 1995， 55(24): 6166
(1999-08-10收稿，1999-10-10修回), 百拇医药