25例原发性肝细胞性肝癌中P16基因失活的研究
作者：黄建钊 沈文律 李波 罗义刚 廖少希 张文 程娘
单位：黄建钊 沈文律 李波：第三军医大学附属西南医院普通外科，重庆 400038；华西医科大学附属一院：罗义刚：普通外科；廖少希 张文：临床分子生物学研究中心；程娘：病理科，成都 610000
关键词：肝癌；P16基因；聚合酶链反应；免疫组织化学
第三军医大学学报991110
提要 目的：调查P16基因是否与原发性肝细胞性肝癌(PHCC)的发生有关。方法：采用多重PCR分析法、单链构象多态性(Single strand conformation polymorphism,SSCP)分析法及以PCR为基础的甲基化分析法对25例原发性肝细胞性肝癌(PHCC)标本及其相应的非肿瘤肝组织标本中P16基因的缺失、点突变及甲基化情况进行检测。用免疫组织化学法对35例(包括前述已作基因检测的25例)原发性HCC肿瘤标本及其相应的非肿瘤组织标本中P16蛋白的表达情况进行了调查。结果：25例HCC肿瘤标本中，3例有P16基因缺失，其中2例为纯合子缺失，1例为半合子缺失。另发现1例P16基因无缺失者有D9s162缺失。无P16基因缺失的22例肿瘤标本中均未发现有P16基因点突变存在。肿瘤标本中基因的甲基化发生率为24%(6/25)，而全部非肿瘤组织均未出现P16基因甲基化。在35例HCC肿瘤标本中发现P16蛋白表达缺失16例(45.7%)，而全部非瘤组织P16蛋白均表达阳性。P16蛋白表达缺失与肿瘤的病理分级有关，分级高者(Ⅲ、Ⅳ级)比分级低者更易发生(P<0.01)。在25例作了P16基因检测的肿瘤中，3例有P16基因缺失及6例有P16基因甲基化者，全部表现P16蛋白表达缺失，另有3例未检出P16基因异常者也发现有P16蛋白表达缺失。结论：P16基因的失活与P16蛋白表达的丧失与原发性肝细胞性肝癌的发生及发展有关。
, 百拇医药
中图法分类号 R394；R735.7 文献标识码 A
Study of inactivation of P16 gene in 25 cases of primary hepatocellular carcinoma
HUANG Jian-zhao,SHEN Wen-lü,LI Bo,LUO Yi-gang,LAO Shao-xi,ZHANG Wen,CHENG Niang
(Department of General Surgery,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400038)
Abstract Objective: To determine whether P16 is involved in the genesis of hepatocellular carcinoma (PHCC).Methods: Specimens of PHCC and noncarcinomatous liver tissues were collected from 25 cases of PHCC.The deletion of P16 gene exon 1 and exon 2 was identified with comparative multiplex PCR,the point mutation of P16 gene exon 2 was examined with single strand conformational polymorphism (SSCP) and the status of P16 gene methylation was screened with PCR based methylation analysis.In addition,35 specimens of paraffin embedded PHCC tissue including the surrounding noncarcinomatous liver tissues were examined for P16 protein expression with immunohistochemical analysis.Results: 2 homozygous deletions and 1 hemizygous deletion were found in the 25 PHCC specimens.In the remaining 22 specimens,no point mutation was found.Hypermethylation occurred in 24% (6/25) of the cases and the surrounding noncarcinomatous were always unmethylated at the P16 locus.Loss of P16 protein expression occurred in 45.7% (16/25) of the cases and all the noncarcinomatous liver tissues were P16 staining positive.In the 25 cases of PHCC examined for P16 gene,3 cases showed P16 gene deletion and 6 cases were found to have methylation of P16 gene.And all the 25 cases were absent for P16 protein expression.Conclusion: Inactivation of P16 gene may play and important role in the genesis of primary PHCC.
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Key words hepatocellular carcinoma; P16 gene; polymerase chain reaction; immunohistochemistry
现已知道，P16基因的异常改变发生在许多肿瘤中，包括黑色素瘤，胰腺癌，食管磷状细胞癌，脑肿瘤及造血系统肿瘤等[1，2]。P16基因的失活机制较多，包括基因缺失，点突变及5′CpG岛高甲基化[1，3]，不管其失活机制如何，最终将表现为P16蛋白表达缺失。因为P16蛋白在细胞周期中起负性调节作用，P16基因的失活可能是导致细胞生长失控并癌变的主要因素之一。虽然已有几个研究小组报道了P16基因在HCC中的作用地位。然而不同国家的报道结果差异较大[4，5]。本文报道中国西南地区人群中原发性肝细胞性肝癌中P16基因的状况与P16蛋白的表达。
1 材料与方法
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1.1 组织标本
35例原发性肝细胞性肝癌(Primary hepatocellular carcinoma,PHCC)肿瘤标本及其相应的非瘤肝组织标本均为华西医科大学外科手术切除标本。按Edmonson与Steiner标准进行分级，其中Ⅰ级3例，Ⅱ级17例，Ⅲ级11例，Ⅳ级4例。全部标本均用免疫组织化学法作P16蛋白表达的检测，其中25例用作P16基因异常改变的检查，DNA的提取按标准方法进行。
1.2 比较多重PCR分析
将P16基因第1与第2外显子分别与用作内对照的微卫星多态性双核苷酸重复序列D9S162同时扩增，引物的设计参照文献[6]，其序列及PCR产物片断大小如下：
P16第1外显子 5′GAAGAAAGAGGAGGGGCTG3′
, 百拇医药 5′GCGCTACCTGATTCCAATTC3′
(340 bp)
P16第2外显子 5′GGAAATTGGAAACTGGAAGC3′
5′TCTGAGCTTTGGAAGCTCT3′
(509 bp)
D9S162 5′GCAATGACCAGTTAAGGTTC3′
5′AATTCCCACAACAAATCTCC3′
(172～196 bp)
PCR反应体积为25 μl，反应混合物含10 mmol/L Tris(pH8.3)，1.5 mmol/L MAgcl2，50 mmol/L KCl,200 μmol/L dNTPs,5% DMSO;1.0 UTaq聚合酶(BoeringerMannheim，德国)，1 μmol/L引物，100 ng DNA模板。PCR反应条件为，95℃预变性5 min后，按如下参数循环，95℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，循环30次后，72℃再延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用Bio-Rad公司的GS-250 Molecular analysis程序使PCR产物条带在计算机上显像并计算P16与D9S162条带密度比。若肿瘤组织中该密度比为用作对照的非肿瘤肝组织的10%以下或50%以下，则分别判为P16基因纯合子缺失或半合子缺失。
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1.3 SSCP分析
对未发现P16基因缺失的肿瘤标本作SSCP分析，检测P16基因第2外显子突变(许多肿瘤中P16基因突变95%以上发生在第二外显子)。PCR反应条件同前，PCR产物经10 U限制性内切酶SmaⅠ(Boeringer Mannhiem,德国)25℃消化8h，取6μl消化产物加入15 μl变性缓冲液中，96℃变性10 min，冰上骤冷。行非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，室温1.5 W过夜。采用银染法显示凝胶中DNA单链条带。
1.4 以PCR为基础的甲基化分析
参照已发表的文献，采用PCR法检测位于5′CpG岛(富含GC的区域)内P16基因第1外显子的甲基化情况，先用甲基敏感的限制性内切酶SmaⅠ消化1μg基因组DNA。SmaⅠ在P16基因第1外显子内有1个酶切位点，当该位点未甲基化时，将被SmaⅠ切断。用10 U SmaⅠ在25℃消化8h后，再用10 U SmaⅠ消化过夜，以保证模板的彻底消化。以消化好的基因组DNA作模板，按前述方法同时扩增P16基因第1外显子与内对照D9S162(不含SmaⅠ酶切位点)。PCR产物行1.8%琼脂糖凝胶电泳。
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1.5 免疫组化分析
采用免疫组化LSAB法，对35例肿瘤标本及其相应的非肿瘤标本中P16蛋白的表达进行检测。标本经福尔马林固定，石膜包埋，4μm切片，铺在0.02% poly-1-lpsine打底的载玻片上。
免疫组化染色按药盒说明书进行，第一抗体为兔抗人P16多克隆抗体(SantaCaruz公司)，稀释度1∶100。以PBS代替-抗设立阴性对照，用已知的P16蛋白表达阳性的乳癌组织作阳性对照。显微镜下观察，以阳性着色细胞数<10%为阴性。
2 结果
2.1 P16基因的缺失频率
在25例肿瘤标本中，共发现3例P16基因第1外显子与第2外显子缺失，缺失率为12%。其中纯合子缺失2例，半合子缺失1例。1例未发现P16基因缺失的肿瘤标本显示D9S162缺失。图1显示一组有代表性的DNA样品中P16基因第2外显子与D9S162多重PCR扩增的结果。6、8泳道肿瘤标本P16基因第2外显子密度明显减低，几至消失。判为纯合子缺失。图2显示1例肿瘤组织中P16基因半合子缺失。
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图1 多重PCR扩增结果
2、4、6、8道：肿瘤组织标本；1、3、5、7道：对应的非癌肝组织标本；M：分子量参照物；6、8道：P16基因第2外显子纯合子缺失
Fig 1 Result of multiplex polymerase chain reaction
Lanes 2,4,6,8 tumor sample; Lanes 1,3,5,7 sample of correspondant non-tumor liver tissue; M: PCR Markers; Lanes 6,8 homozygous deletions of P16 gene exon 2
图2 多重PCR扩增结果
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T：肿瘤标本；N：相应的非癌肝组织标本；图示肿瘤组织P16基因第2外显子半合子缺失
Fig 2 Results of multiplex polymerase chain reaction
T:Tumor sample; N:sample of non-tumor liver tissue;Tumor sample showed hemizygous deletion of P16 gene exon 2
2.2 P16基因突变分析
对未发现P16基因缺失的22例肿瘤标本作P16基因第2外显子的突变检查。PCR产物经限制性内切酶SmaⅠ切成252 bp与257 bp两个片断后，作SSCP凝胶分析。全部标本中均未发现有异常泳动的单链DNA条带。即未发现有突变存在，见图3。
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图3 SSCP分析结果
1、3、5道：肿瘤标本；2、4、6道：相应的非肿瘤组织标本；M：分子量参照物(PBR 322/Hae Ⅲ Markers，华美生物工程公司)；SS DNA：单链DNA
Fig 3 Results of single strand conformational
polymorphism analysis
Lanes 1,3,5 tumor sample; Lanes 2,4,6 sample of correspondant non-tumor liver tissue; M:PCR Markers; ssDNA: Single strand DNA
2.3 P16基因甲基化情况
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采用多重PCR法对P16基因5′CpG岛甲基化进行分析。若P16基因第1外显子被甲基化，则不会被SmaⅠ切断，而出现PCR扩增产物，本组肿瘤标本中有6例出现甲基化，占24%(6/25)。而全部非肿瘤标本中则未发现有甲基化存在。图4显示4例肿瘤标本中P16基因出现甲基化(泳道2，6，8，10)。
图4 P16基因甲基化情况
2、4、6、8、10道：癌组织标本；1、3、5、7、9道：相应的非癌肝组织标本；M：PCR分子量参照物Markers。2、6、8、10道：P16基因甲基化
Fig 4 Analysis of P16 gene methylation
Lanes 2,4,6,8,10 tumor sample; Lanes 1,3,5,7,9 sample of correspondant non-tumor liver tissue; M:PCR Markers; Lanes 2,6,8,10 methylation of P16 gene
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2.4 P16蛋白表达的检测
我们对全部35例肿瘤标本及其相应的非瘤肝组织标本中P16蛋白表达情况进行了检测。16例肿瘤标本出现P16蛋白表达缺失，缺失率为45.7%，见图5。而全部非瘤组织中P16蛋白表达均为阳性，见图6。
图5 PHCC肿瘤组织中P16蛋白表达阴性 (该例肿瘤组织中P16基因有甲基化) (S-P染色×400)
Fig 5 Negative expression of P16 protein in the tumor sample
(In this case the P16 gene showed methylation (S-P stain×400)
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图6 同一病例非瘤肝组织中P16蛋白表达阳性 (S-P染色×400)
Fig 6 Possitive expression of P16 protein in the non tumor liver tissue sample of the same case (S-P analysis×400)
在25例作了P16基因异常改变检查的肿瘤标本中，3例有P16基因缺失及6例有P16基因甲基化者，P16蛋白表达均为阴性。另有3例未发现P16基因异常改变的肿瘤标本也出现P16蛋白表达缺失。
P16蛋白表达缺失与患者年龄、性别、肿瘤大小及HBsAg是否阳性无明显关系，但与肿瘤的病理分级有关，分级高者(Ⅲ、Ⅳ级)，比分级低者(Ⅰ、Ⅱ级)更易发生，相差非常显著(P<0.01,资料未列出)。
3 讨论
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本研究对原发性肝细胞性肝癌中P16基因的状态进行了分析，包括基因缺失、突变与甲基化情况。P16基因的缺失在膀胱癌，乳腺癌及前列腺癌中被认为是主要的失活机制。本研究发现3例PHCCs肿瘤标本中P16基因第1外显子与第2外显子缺失，缺失率为12%(3/25)。Qin等在24例PHCCs肿瘤标本中发现2例有P16基因第2外显子缺失(8.3%)[4]。瑞典的一个研究小组发现19例PPHCCs中有4例(21%)出现P16基因杂合子缺失[7]。然而，Biden等在23例澳大利亚人PHCCs中未发现有P16基因缺失[8]，Kaino等在5例日本人PHCC细胞标中也未发现有P16基因缺失[5]。我们的结果及其它研究者报道的结果的差异可能与不同地区PHCC的致癌因素不同有关。另外，我们尚在1例未发现P16基因缺失的肿瘤中发现9p21区标记点D9S162缺失。其它研究者也在PHCCs中发现9p21-22区许多微卫星标记点有杂合子缺失[8]。提示9p21-22区可能尚有其它的抑癌基因参与PHCCs的发生与发展。
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突变作为P16基因的失活方式在PHCCs中似乎较为少见。Qin等报道24例PHCCs中有8例(33.3%)出现P16基因第2外显子突变外[8]，然而在本研究及其它许多研究中均未发现有P16基因突变[5，8，9]。
P16与P15基因5′CpG岛高甲基化常伴随其mRNA表达缺失[3]。P16基因的甲基化不仅发生在纯合子缺失较为常见的一些肿瘤，如乳癌及肾细胞癌中，而且在P16基因纯合子缺失罕见的肿瘤，如结肠癌及前列腺癌中也有发现[3]。我们对P16基因第1外显子内的SmaⅠ位点的甲基化情况作了检查，发现在无P16基因缺失的22例肿瘤中有6例出现甲基化，而非肿瘤标本则无甲基化出现。这提示，甲基化作为P16基因失活的另一方式，在PHCCs的发生与发展中可能起重要作用。
新近的研究表明，P16基因的失活尚可由其它失活机制引起，如转录水平出错[10]或转录后出错[9]。不管P16基因的失活机制如何，其结果均表现为P16蛋白表达缺失。本研究用免疫组织化学法对P16蛋白的表达情况作了检测，在35例肿瘤标本中检出16例P16蛋白表达缺失，缺失率为45.7%，而非肿瘤组织P16蛋白均为阳性。P16蛋白表达缺失在分级高的肿瘤组织中比分级低的肿瘤组织中更易见到。表明P16蛋白表达的缺失在PHCCs的发展中可能起重要作用，且与肿瘤的恶性表型有关。另外，在直径≤5 cm的8例早期小肝癌中发现3例(37.5%)有P16蛋白表达缺失，提示P16的失活可能参与PHCCs的早期发生。由多重PCR法检出的P16基因缺失及甲基化与用免疫组化法发现的P16蛋白表达缺失是密切相关的。本研究中，有P16基因异常改变的肿瘤标本，其P16蛋白表达也为阴性。然而在3例未发现P16基因异常改变的肿瘤标本，其P16蛋白表达缺失，机制尚不清楚。虽然P16SmaⅠ位点在许多肿瘤中是常见的甲基化位点。但不排除这3例肿瘤标本中出现其它位点甲基化的可能。当然，也可能有其它的失活机制，如转录水平或转录后出错与这3例肿瘤组织P16蛋白表达缺失有关。
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基金项目：华西医科大学博士点基金
作者简介：黄建钊，男，35岁，主治医师，讲师，博士
参考文献
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[3] Herman J G,Merlo A,Mao L,et al.Inactivation of the CDKN2/P16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers[J].Cancer Res,1995,55(20):4525-4530.
[4] Qin L,Tang Z,Liu K,et al.Alterations of CKDN2 (P16 MTS1) exon 2 in human hepatocellular carcinoma[J].Oncol Rep,1997,3(3):405-408
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收稿日期：1998-10-05；修回日期：1999-05-14, 百拇医药
单位：黄建钊 沈文律 李波：第三军医大学附属西南医院普通外科，重庆 400038；华西医科大学附属一院：罗义刚：普通外科；廖少希 张文：临床分子生物学研究中心；程娘：病理科，成都 610000
关键词：肝癌；P16基因；聚合酶链反应；免疫组织化学
第三军医大学学报991110
提要 目的：调查P16基因是否与原发性肝细胞性肝癌(PHCC)的发生有关。方法：采用多重PCR分析法、单链构象多态性(Single strand conformation polymorphism,SSCP)分析法及以PCR为基础的甲基化分析法对25例原发性肝细胞性肝癌(PHCC)标本及其相应的非肿瘤肝组织标本中P16基因的缺失、点突变及甲基化情况进行检测。用免疫组织化学法对35例(包括前述已作基因检测的25例)原发性HCC肿瘤标本及其相应的非肿瘤组织标本中P16蛋白的表达情况进行了调查。结果：25例HCC肿瘤标本中，3例有P16基因缺失，其中2例为纯合子缺失，1例为半合子缺失。另发现1例P16基因无缺失者有D9s162缺失。无P16基因缺失的22例肿瘤标本中均未发现有P16基因点突变存在。肿瘤标本中基因的甲基化发生率为24%(6/25)，而全部非肿瘤组织均未出现P16基因甲基化。在35例HCC肿瘤标本中发现P16蛋白表达缺失16例(45.7%)，而全部非瘤组织P16蛋白均表达阳性。P16蛋白表达缺失与肿瘤的病理分级有关，分级高者(Ⅲ、Ⅳ级)比分级低者更易发生(P<0.01)。在25例作了P16基因检测的肿瘤中，3例有P16基因缺失及6例有P16基因甲基化者，全部表现P16蛋白表达缺失，另有3例未检出P16基因异常者也发现有P16蛋白表达缺失。结论：P16基因的失活与P16蛋白表达的丧失与原发性肝细胞性肝癌的发生及发展有关。
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中图法分类号 R394；R735.7 文献标识码 A
Study of inactivation of P16 gene in 25 cases of primary hepatocellular carcinoma
HUANG Jian-zhao,SHEN Wen-lü,LI Bo,LUO Yi-gang,LAO Shao-xi,ZHANG Wen,CHENG Niang
(Department of General Surgery,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400038)
Abstract Objective: To determine whether P16 is involved in the genesis of hepatocellular carcinoma (PHCC).Methods: Specimens of PHCC and noncarcinomatous liver tissues were collected from 25 cases of PHCC.The deletion of P16 gene exon 1 and exon 2 was identified with comparative multiplex PCR,the point mutation of P16 gene exon 2 was examined with single strand conformational polymorphism (SSCP) and the status of P16 gene methylation was screened with PCR based methylation analysis.In addition,35 specimens of paraffin embedded PHCC tissue including the surrounding noncarcinomatous liver tissues were examined for P16 protein expression with immunohistochemical analysis.Results: 2 homozygous deletions and 1 hemizygous deletion were found in the 25 PHCC specimens.In the remaining 22 specimens,no point mutation was found.Hypermethylation occurred in 24% (6/25) of the cases and the surrounding noncarcinomatous were always unmethylated at the P16 locus.Loss of P16 protein expression occurred in 45.7% (16/25) of the cases and all the noncarcinomatous liver tissues were P16 staining positive.In the 25 cases of PHCC examined for P16 gene,3 cases showed P16 gene deletion and 6 cases were found to have methylation of P16 gene.And all the 25 cases were absent for P16 protein expression.Conclusion: Inactivation of P16 gene may play and important role in the genesis of primary PHCC.
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Key words hepatocellular carcinoma; P16 gene; polymerase chain reaction; immunohistochemistry
现已知道，P16基因的异常改变发生在许多肿瘤中，包括黑色素瘤，胰腺癌，食管磷状细胞癌，脑肿瘤及造血系统肿瘤等[1，2]。P16基因的失活机制较多，包括基因缺失，点突变及5′CpG岛高甲基化[1，3]，不管其失活机制如何，最终将表现为P16蛋白表达缺失。因为P16蛋白在细胞周期中起负性调节作用，P16基因的失活可能是导致细胞生长失控并癌变的主要因素之一。虽然已有几个研究小组报道了P16基因在HCC中的作用地位。然而不同国家的报道结果差异较大[4，5]。本文报道中国西南地区人群中原发性肝细胞性肝癌中P16基因的状况与P16蛋白的表达。
1 材料与方法
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1.1 组织标本
35例原发性肝细胞性肝癌(Primary hepatocellular carcinoma,PHCC)肿瘤标本及其相应的非瘤肝组织标本均为华西医科大学外科手术切除标本。按Edmonson与Steiner标准进行分级，其中Ⅰ级3例，Ⅱ级17例，Ⅲ级11例，Ⅳ级4例。全部标本均用免疫组织化学法作P16蛋白表达的检测，其中25例用作P16基因异常改变的检查，DNA的提取按标准方法进行。
1.2 比较多重PCR分析
将P16基因第1与第2外显子分别与用作内对照的微卫星多态性双核苷酸重复序列D9S162同时扩增，引物的设计参照文献[6]，其序列及PCR产物片断大小如下：
P16第1外显子 5′GAAGAAAGAGGAGGGGCTG3′
, 百拇医药 5′GCGCTACCTGATTCCAATTC3′
(340 bp)
P16第2外显子 5′GGAAATTGGAAACTGGAAGC3′
5′TCTGAGCTTTGGAAGCTCT3′
(509 bp)
D9S162 5′GCAATGACCAGTTAAGGTTC3′
5′AATTCCCACAACAAATCTCC3′
(172～196 bp)
PCR反应体积为25 μl，反应混合物含10 mmol/L Tris(pH8.3)，1.5 mmol/L MAgcl2，50 mmol/L KCl,200 μmol/L dNTPs,5% DMSO;1.0 UTaq聚合酶(BoeringerMannheim，德国)，1 μmol/L引物，100 ng DNA模板。PCR反应条件为，95℃预变性5 min后，按如下参数循环，95℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，循环30次后，72℃再延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用Bio-Rad公司的GS-250 Molecular analysis程序使PCR产物条带在计算机上显像并计算P16与D9S162条带密度比。若肿瘤组织中该密度比为用作对照的非肿瘤肝组织的10%以下或50%以下，则分别判为P16基因纯合子缺失或半合子缺失。
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1.3 SSCP分析
对未发现P16基因缺失的肿瘤标本作SSCP分析，检测P16基因第2外显子突变(许多肿瘤中P16基因突变95%以上发生在第二外显子)。PCR反应条件同前，PCR产物经10 U限制性内切酶SmaⅠ(Boeringer Mannhiem,德国)25℃消化8h，取6μl消化产物加入15 μl变性缓冲液中，96℃变性10 min，冰上骤冷。行非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，室温1.5 W过夜。采用银染法显示凝胶中DNA单链条带。
1.4 以PCR为基础的甲基化分析
参照已发表的文献，采用PCR法检测位于5′CpG岛(富含GC的区域)内P16基因第1外显子的甲基化情况，先用甲基敏感的限制性内切酶SmaⅠ消化1μg基因组DNA。SmaⅠ在P16基因第1外显子内有1个酶切位点，当该位点未甲基化时，将被SmaⅠ切断。用10 U SmaⅠ在25℃消化8h后，再用10 U SmaⅠ消化过夜，以保证模板的彻底消化。以消化好的基因组DNA作模板，按前述方法同时扩增P16基因第1外显子与内对照D9S162(不含SmaⅠ酶切位点)。PCR产物行1.8%琼脂糖凝胶电泳。
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1.5 免疫组化分析
采用免疫组化LSAB法，对35例肿瘤标本及其相应的非肿瘤标本中P16蛋白的表达进行检测。标本经福尔马林固定，石膜包埋，4μm切片，铺在0.02% poly-1-lpsine打底的载玻片上。
免疫组化染色按药盒说明书进行，第一抗体为兔抗人P16多克隆抗体(SantaCaruz公司)，稀释度1∶100。以PBS代替-抗设立阴性对照，用已知的P16蛋白表达阳性的乳癌组织作阳性对照。显微镜下观察，以阳性着色细胞数<10%为阴性。
2 结果
2.1 P16基因的缺失频率
在25例肿瘤标本中，共发现3例P16基因第1外显子与第2外显子缺失，缺失率为12%。其中纯合子缺失2例，半合子缺失1例。1例未发现P16基因缺失的肿瘤标本显示D9S162缺失。图1显示一组有代表性的DNA样品中P16基因第2外显子与D9S162多重PCR扩增的结果。6、8泳道肿瘤标本P16基因第2外显子密度明显减低，几至消失。判为纯合子缺失。图2显示1例肿瘤组织中P16基因半合子缺失。
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图1 多重PCR扩增结果
2、4、6、8道：肿瘤组织标本；1、3、5、7道：对应的非癌肝组织标本；M：分子量参照物；6、8道：P16基因第2外显子纯合子缺失
Fig 1 Result of multiplex polymerase chain reaction
Lanes 2,4,6,8 tumor sample; Lanes 1,3,5,7 sample of correspondant non-tumor liver tissue; M: PCR Markers; Lanes 6,8 homozygous deletions of P16 gene exon 2
图2 多重PCR扩增结果
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T：肿瘤标本；N：相应的非癌肝组织标本；图示肿瘤组织P16基因第2外显子半合子缺失
Fig 2 Results of multiplex polymerase chain reaction
T:Tumor sample; N:sample of non-tumor liver tissue;Tumor sample showed hemizygous deletion of P16 gene exon 2
2.2 P16基因突变分析
对未发现P16基因缺失的22例肿瘤标本作P16基因第2外显子的突变检查。PCR产物经限制性内切酶SmaⅠ切成252 bp与257 bp两个片断后，作SSCP凝胶分析。全部标本中均未发现有异常泳动的单链DNA条带。即未发现有突变存在，见图3。
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图3 SSCP分析结果
1、3、5道：肿瘤标本；2、4、6道：相应的非肿瘤组织标本；M：分子量参照物(PBR 322/Hae Ⅲ Markers，华美生物工程公司)；SS DNA：单链DNA
Fig 3 Results of single strand conformational
polymorphism analysis
Lanes 1,3,5 tumor sample; Lanes 2,4,6 sample of correspondant non-tumor liver tissue; M:PCR Markers; ssDNA: Single strand DNA
2.3 P16基因甲基化情况
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采用多重PCR法对P16基因5′CpG岛甲基化进行分析。若P16基因第1外显子被甲基化，则不会被SmaⅠ切断，而出现PCR扩增产物，本组肿瘤标本中有6例出现甲基化，占24%(6/25)。而全部非肿瘤标本中则未发现有甲基化存在。图4显示4例肿瘤标本中P16基因出现甲基化(泳道2，6，8，10)。
图4 P16基因甲基化情况
2、4、6、8、10道：癌组织标本；1、3、5、7、9道：相应的非癌肝组织标本；M：PCR分子量参照物Markers。2、6、8、10道：P16基因甲基化
Fig 4 Analysis of P16 gene methylation
Lanes 2,4,6,8,10 tumor sample; Lanes 1,3,5,7,9 sample of correspondant non-tumor liver tissue; M:PCR Markers; Lanes 2,6,8,10 methylation of P16 gene
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2.4 P16蛋白表达的检测
我们对全部35例肿瘤标本及其相应的非瘤肝组织标本中P16蛋白表达情况进行了检测。16例肿瘤标本出现P16蛋白表达缺失，缺失率为45.7%，见图5。而全部非瘤组织中P16蛋白表达均为阳性，见图6。
图5 PHCC肿瘤组织中P16蛋白表达阴性 (该例肿瘤组织中P16基因有甲基化) (S-P染色×400)
Fig 5 Negative expression of P16 protein in the tumor sample
(In this case the P16 gene showed methylation (S-P stain×400)
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图6 同一病例非瘤肝组织中P16蛋白表达阳性 (S-P染色×400)
Fig 6 Possitive expression of P16 protein in the non tumor liver tissue sample of the same case (S-P analysis×400)
在25例作了P16基因异常改变检查的肿瘤标本中，3例有P16基因缺失及6例有P16基因甲基化者，P16蛋白表达均为阴性。另有3例未发现P16基因异常改变的肿瘤标本也出现P16蛋白表达缺失。
P16蛋白表达缺失与患者年龄、性别、肿瘤大小及HBsAg是否阳性无明显关系，但与肿瘤的病理分级有关，分级高者(Ⅲ、Ⅳ级)，比分级低者(Ⅰ、Ⅱ级)更易发生，相差非常显著(P<0.01,资料未列出)。
3 讨论
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本研究对原发性肝细胞性肝癌中P16基因的状态进行了分析，包括基因缺失、突变与甲基化情况。P16基因的缺失在膀胱癌，乳腺癌及前列腺癌中被认为是主要的失活机制。本研究发现3例PHCCs肿瘤标本中P16基因第1外显子与第2外显子缺失，缺失率为12%(3/25)。Qin等在24例PHCCs肿瘤标本中发现2例有P16基因第2外显子缺失(8.3%)[4]。瑞典的一个研究小组发现19例PPHCCs中有4例(21%)出现P16基因杂合子缺失[7]。然而，Biden等在23例澳大利亚人PHCCs中未发现有P16基因缺失[8]，Kaino等在5例日本人PHCC细胞标中也未发现有P16基因缺失[5]。我们的结果及其它研究者报道的结果的差异可能与不同地区PHCC的致癌因素不同有关。另外，我们尚在1例未发现P16基因缺失的肿瘤中发现9p21区标记点D9S162缺失。其它研究者也在PHCCs中发现9p21-22区许多微卫星标记点有杂合子缺失[8]。提示9p21-22区可能尚有其它的抑癌基因参与PHCCs的发生与发展。
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突变作为P16基因的失活方式在PHCCs中似乎较为少见。Qin等报道24例PHCCs中有8例(33.3%)出现P16基因第2外显子突变外[8]，然而在本研究及其它许多研究中均未发现有P16基因突变[5，8，9]。
P16与P15基因5′CpG岛高甲基化常伴随其mRNA表达缺失[3]。P16基因的甲基化不仅发生在纯合子缺失较为常见的一些肿瘤，如乳癌及肾细胞癌中，而且在P16基因纯合子缺失罕见的肿瘤，如结肠癌及前列腺癌中也有发现[3]。我们对P16基因第1外显子内的SmaⅠ位点的甲基化情况作了检查，发现在无P16基因缺失的22例肿瘤中有6例出现甲基化，而非肿瘤标本则无甲基化出现。这提示，甲基化作为P16基因失活的另一方式，在PHCCs的发生与发展中可能起重要作用。
新近的研究表明，P16基因的失活尚可由其它失活机制引起，如转录水平出错[10]或转录后出错[9]。不管P16基因的失活机制如何，其结果均表现为P16蛋白表达缺失。本研究用免疫组织化学法对P16蛋白的表达情况作了检测，在35例肿瘤标本中检出16例P16蛋白表达缺失，缺失率为45.7%，而非肿瘤组织P16蛋白均为阳性。P16蛋白表达缺失在分级高的肿瘤组织中比分级低的肿瘤组织中更易见到。表明P16蛋白表达的缺失在PHCCs的发展中可能起重要作用，且与肿瘤的恶性表型有关。另外，在直径≤5 cm的8例早期小肝癌中发现3例(37.5%)有P16蛋白表达缺失，提示P16的失活可能参与PHCCs的早期发生。由多重PCR法检出的P16基因缺失及甲基化与用免疫组化法发现的P16蛋白表达缺失是密切相关的。本研究中，有P16基因异常改变的肿瘤标本，其P16蛋白表达也为阴性。然而在3例未发现P16基因异常改变的肿瘤标本，其P16蛋白表达缺失，机制尚不清楚。虽然P16SmaⅠ位点在许多肿瘤中是常见的甲基化位点。但不排除这3例肿瘤标本中出现其它位点甲基化的可能。当然，也可能有其它的失活机制，如转录水平或转录后出错与这3例肿瘤组织P16蛋白表达缺失有关。
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基金项目：华西医科大学博士点基金
作者简介：黄建钊，男，35岁，主治医师，讲师，博士
参考文献
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收稿日期：1998-10-05；修回日期：1999-05-14, 百拇医药