重组人肿瘤坏死因子对人结肠癌SW-480细胞的体内作用
作者：黄显凯 张胜本 饶本强
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042
关键词：肿瘤坏死因子；结肠肿瘤；SW-480细胞
第三军医大学学报991105
提要 目的：探讨TNF抗大肠癌的作用及其机制。方法：建立人结肠腺癌裸小鼠移植瘤模型，观察rhTNF对人结肠腺癌SW-480裸小鼠移植瘤重量、组织学和超微结构及细胞周期动力学的影响。结果：rhTNF对人结肠腺癌裸小鼠移植瘤具有抑制作用，抑瘤作用呈剂量依赖性；结肠癌细胞围绕血管出现片状坏死，并有大量炎细胞浸润；rhTNF能明显抑制结肠癌细胞从G0/G1期过渡到S和G2M期，使细胞增殖指数显著降低，DNA抑制率呈剂量依赖性。结论：rhTNF对大肠癌生长具有抑制作用，可能与rhTNF诱导的炎症反应及血管损伤有关；rhTNF能特异性抑制大肠癌细胞从G0/G1期向S和G2M期过渡，进而抑制DNA合成。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R730.3；R735.35 文献标识码 A
Effects of recombinant human TNF on transplanted human colonic carcinoma in nude mice
HUANG Xian-kai, ZHANG Sheng-ben, RAO Ben-qiang
(Department of General Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)
Abstract Objective：To study the effects of recombinant human tumor necrosis factor (rhTNF) on transplanted human colonic carcinoma in nude mice. Methods: Human colonic carcinoma cell line SW480 was transplanted to the body of nude mice. The effects of rhTNF on the growth, histomorphology and cytodynamics of the transplanted colonic carcinoma were obsered. Results: rhTNF inhibited the growth of the transplanted colonic carcinoma in a dosage-dependent manner. Partial necrosis of the carcinomatous cells occurred in the surroundings of tumor vessels with the infiltration of large numbers of inflammatory cells in the necrotic foci. rhTNF stopped the cells cycle progress from G0/G1 phase to S and G2M phases and reduced the proliferative index and DNA content of the carcinomatous cells. Conclusion: rhTNF exerts inhibition on the growth of the transplanted human colonic carcinoma possibly through the following mechanisms: ①To induce inflammatory reaction and vascular damage and ② To interfere with the cell cycle.
, 百拇医药
Key words TNF;colonic carcinoma cell line SW480; colorectal neoplasm; nude mouse
本文观察重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)对人结肠癌裸小鼠移植瘤的作用，旨在阐明TNF对大肠癌的作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 人结肠腺癌裸小鼠移植瘤模型的建立
人结肠高分化腺癌细胞株SW-480由重庆医科大学病生教研室提供。第三军医大学实验动物中心提供BALB/c-nu/nu无胸腺裸小鼠。鼠龄5～7周，体重(20±2)g，雌雄不拘，实验时按无菌原则操作。初代移植瘤采用对数生长期SW-480细胞消化后，调整细胞浓度至4×106/ml，取0.2 ml接种于裸小鼠腹部或颈背部皮下。初代肿瘤长至1 cm×1 cm×1 cm时，选择接种成功的裸小鼠拉颈处死，无菌剥离瘤体，用含双抗的Hanks液洗两次，剪成1～2 mm大小瘤块，经套管针接种于裸小鼠上述部位进行传代。传代5次，每次接种裸小鼠2～3只。
, 百拇医药
1.2 rhTNF对人结肠腺癌SW-480裸小鼠移植瘤的作用
1.2.1 实验分组 将传代后稳定生长的人结肠腺癌移植瘤按前述方法接种于裸小鼠，共30只，随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和腹腔注射组，每组6只。肿瘤长至5～8 mm时，按表1实验，采用瘤内注射(i.t)和腹腔注射(i.p)隔日给药，共10次，末次用药后24 h处死裸小鼠。
表1 药品用量及途径
Tab 1 Dose and route of use of rhTNF Group
Drug(/time)
Method
Control
, 百拇医药 saline 1 ml
i.t
Low dose
rhTNF 500 u
i.t
Mid dose
rhTNF 2 000 u
i.t
High dose
rhTNF 10 000 u
i.t
Peritoneum
, 百拇医药
rhTNF 10 000 u
i.p
1.2.2 瘤重变化 处死裸小鼠剥取肿瘤后，清除脂肪等非肿瘤组织，称量瘤重，按公式计算瘤重抑瘤率：
1.2.3 组织学和超微结构改变 每组均取4只裸小鼠，剥离移植瘤，10%福尔马林固定，石腊包埋，常规切片作HE染色，光镜观察。同时切取3～4块1 mm大小的第五代移植瘤组织，3%戊二醛和1%OsO4固定，丙酮脱水，Epon-812包埋，超薄切片(500～700A)，铀-铅双染色，300 X型透射电子显微镜(SEM)下观察。
1.2.4 细胞周期动力学变化[1] 获取第6代肿瘤组织，Hanks液冲洗3次，将肿瘤剪切成1 mm碎块，Hanks液冲洗2次，消化液(0.25%胰蛋白酶与0.05%胶原酶1∶1)37°C消化20～30 min。800 r离心5～8 min，Hanks液漂洗2～3 min。300目钢筛网除去未充分消化的组织，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至1×10/ml，70%乙醇固定。选用碘化丙啶(PI)DNA染色法，PBS液洗去固定液，加入PI一步染液1 ml，室温放置30 min，流式细胞仪测定。以70 mV的氩离子激光器为激发光源，激发波长为488 nm。测定DNA、蛋白质的荧光强度后，收集10 000个细胞的数据进行分析和处理。采用Barlogie细胞同期分析法，将处于不同时期的细胞分为三部分：G0/G1期、S期、G2M期细胞。每组选取1只裸小鼠移植瘤，按公式计算细胞增殖指数(proliferation index,PI)和DNA抑制率。
, 百拇医药
1.3 统计学处理
数据值均以x±s表示，按需要进行χ2检验或t检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异非常显著。
2 结果
2.1 移植瘤生长情况
初代移植瘤接种成功2只，第二代以后接种成功率100%，至第6代以后肿瘤生长速度稳定。潜伏期7～8d，第二周末直径可达0.5～0.6 cm，第三周起肿瘤生长加快，至第5周末直径平均可达1.9～2.2 cm，此时表面呈结节状，个别肿瘤表面有破溃及出血。
2.2 rhTNF对移植瘤增长的抑制作用
rhTNF瘤内注射或腹腔注射对人结肠腺癌裸小鼠移植瘤具有抑制作用，结果见表2。
, 百拇医药
表2 rhTNF处理后肿瘤重量变化
Tab 2 Effects of rhTNF on weight of transplant tumors
Weight(g)
Inhibition(%)
Control
2.19±0.19
-
Low dose
2.21±0.16
-
Mide dose
, 百拇医药
1.81±0.10**##
17.1±3.6**##
High dose
1.52±0.10**
32.0±3.7**
Peritoneum
1.82±0.06**##
17.2±3.0**##
**：P<0.01 vs Control;##：P<0.01 vs High dose 2.3 rhTNF处理人结肠腺癌裸小鼠移植瘤的组织学变化
, http://www.100md.com
对照组仅见点状、小片状坏死，rhTNF处理组除低剂量组外均出现片状坏死区，坏死范围与剂量相关，中剂量组局灶性坏死多见；高剂量组细胞松散，可见大片状坏死区。坏死瘤细胞多沿血管周围分布，血管结构不清，坏死区有大量炎性细胞浸润，见图1。
图1 rhTNF高剂量组，肿瘤组织坏死，坏死区可见大量炎细胞浸润，血管结构不清(HE×200)
Fig 1 In high dose group of rhTNF, tumorous tissue necrosed, great number of inflammatory cells invaded, and strucure of blood vessel was neclear (HE×200)
2.4 rhTNF处理人结肠腺癌裸小鼠移植瘤的超微结构改变
, http://www.100md.com
对照组细胞连接紧密，具有人结肠高分化腺癌的超微结构特征，rhTNF治疗组可观察到炎性细胞对肿瘤细胞的攻击相；肿瘤细胞坏死、溶解，髓鞘样结构形成，见图2、3。
图2 肿瘤细胞受炎细胞攻击，炎细胞内可见嗜酸性颗粒及溶酶体 (TEM×4 000)
Fig 2 The tumoaous cells were attacked,acidophil pellets and lysosomes were
seen in the inflammatory cells (TEM×4 000)
图3 瘤细胞核溶解、坏死，核膜消失，髓鞘样变 (TEM×5 000)
, 百拇医药
Fig 3 The tumoaous cell nuclear dissolved and necrosed, cell membrane disappeared
and change of similar myelinization was seen (TEM×5 000)
2.5 rhTNF处理人结肠腺癌裸小鼠移植瘤的细胞动力学变化
rhTNF治疗除低剂量组外，中剂量及高剂量组S+G2M期细胞均明显低于对照组，而G0/G1期细胞则高于对照组；增殖指数与对照组相比，高剂量组、中剂量组、腹腔注射组均显著降低(P<0.01)。DNA抑制率高剂量、中剂量、腹腔注射组分别为57.9%、43.7%、43.7%，见表3。
表3 移植瘤细胞动力学分析
, 百拇医药
Tab 3 Cytodynamic analyse of transplant tumors
G0/G1
S
G2/M
PI(%)
DNA inhibition
(%)
Control
58.5
15.5
16.1
, 百拇医药
31.6
-
Low dose
66.2
16.1
17.8
33.9
-
Mide dose
82.2
14.2
3.6
17.8* *
, http://www.100md.com
43.7# #
High dose
86.7
11.1
2.2
13.3* *
57.9
Peritoneum
82.2
15.1
2.7
17.8* *
, 百拇医药
43.7#
**：P<0.01 vs Control;＃：P<0.05,##：P<0.01 vs High dose
3 讨论
3.1 rhTNF对大肠癌细胞的抑制作用
肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)是近年来研究较多的一种新型细胞因子，因其具有杀伤多种肿瘤细胞而不损伤正常组织细胞而倍受青睐，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物因子之一，许多实验已证实TNF在体外有杀伤大肠癌细胞的作用。
本实验结果显示，rhTNF在低剂量时，对人结肠癌SW-480裸小鼠移植瘤没有抑制作用；中高剂量时抑瘤率分别为18.3%及33.7%。说明rhTNF对SW-480移植瘤呈低度敏感。我们过去体外观察rhTNF在500～30 000 u/ml时对SW-480细胞仅有抑制作用，60 000 u/ml的浓度对SW-480细胞的杀伤率才28%[2]，与本实验结果相似。增加剂量可以提高rhTNF对人结肠腺癌SW-480移植瘤的抑制率，说明rhTNF对大肠癌的抑制作用在一定剂量范围内呈剂量依赖性。腹腔给药与瘤内给药疗效有显著性差异，瘤内给药的治疗效果好。Marligit等[3]用rhTNF经肝动脉插管灌注治疗结肠癌肝转移化疗无效患者，连续用药15 d，部分患者血浆CEA水平下降，瘤体缩小，表明rhTNF局部给药具有一定的抗大肠肿瘤作用，而且局部用药患者对rhTNF的耐受程度明显高于静脉给药的数倍。结果均提示rhTNF的瘤内应用是较适宜的给药途径。
, 百拇医药
3.2 rhTNF抑制大肠癌移植瘤的形态学变化及意义
组织学观察发现rhTNF作用于移植瘤的形态学变化有两个显著的特点：一是肿瘤细胞坏死区常围绕血管分布，血管有出血、坏死现象；二是肿瘤坏死区有大量的炎性细胞浸润，超微结构可较清晰地观察到淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞对大肠癌细胞的攻击相。提示血管系统的损伤可能是TNF产生抗肿瘤作用的重要机制之一。
3.3 rhTNF对大肠癌移植瘤作用的细胞动力学变化及其临床意义
细胞动力学测定用于测定肿瘤细胞DNA相对含量，分析肿瘤细胞周期是一个理想的手段。本实验应用FCM分析rhTNF治疗大肠癌移植瘤的细胞动力学变化和DNA抑制率，旨在阐明rhTNF在体内对大肠癌细胞核酸代谢的影响。结果表明：rhTNF对大肠癌细胞的DNA合成有明显的影响，即使中剂量rhTNF对DNA抑制率也达43.7%。进一步对细胞动力学变化进行分析，rhTNF主要抑制大肠癌细胞从G0/G1期向S期和G2M期过渡，致使大肠癌细胞的S+G2M期比例显著低于对照组，而G0/G1期则高于对照组，S+G2M期细胞在整个肿瘤细胞周期中的比例即增殖指数(PI)反映的是肿瘤细胞增殖能力，rhTNF作用后，能使肿瘤细胞的增殖能力下降，从而起到抑瘤作用。分析rhTNF对肿瘤细胞周期及DNA合成的影响，对临床联合应用化疗药物具有一定指导意义。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270656)
Foundation item: National Natural Science Foundation of China(39270656)
作者简介：黄显凯，男，44岁，副教授，博士
参考文献
[1] 张胜本，张连阳 主编.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性[M].成都：四川科学技术出版社，1995.91-95.
[2] 张胜本，周晓武，张连阳.重组人肿瘤坏死因子对人结肠癌SW-480细胞在体外杀伤作用的研究[J].第三军医大学学报，1995，17(1)：19-23.
[3] Marlight M D, Glora mM, Alexander A, et al. Regional Biologic therapy:Hepaticarterial infusion of recombinant human tulmor necrosis factor in patients withliver metastases[J]. Cancer,1992,69(2):557-563
收稿日期：1999-01-07；修回日期：1999-09-01, 百拇医药
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042
关键词：肿瘤坏死因子；结肠肿瘤；SW-480细胞
第三军医大学学报991105
提要 目的：探讨TNF抗大肠癌的作用及其机制。方法：建立人结肠腺癌裸小鼠移植瘤模型，观察rhTNF对人结肠腺癌SW-480裸小鼠移植瘤重量、组织学和超微结构及细胞周期动力学的影响。结果：rhTNF对人结肠腺癌裸小鼠移植瘤具有抑制作用，抑瘤作用呈剂量依赖性；结肠癌细胞围绕血管出现片状坏死，并有大量炎细胞浸润；rhTNF能明显抑制结肠癌细胞从G0/G1期过渡到S和G2M期，使细胞增殖指数显著降低，DNA抑制率呈剂量依赖性。结论：rhTNF对大肠癌生长具有抑制作用，可能与rhTNF诱导的炎症反应及血管损伤有关；rhTNF能特异性抑制大肠癌细胞从G0/G1期向S和G2M期过渡，进而抑制DNA合成。
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中图法分类号 R730.3；R735.35 文献标识码 A
Effects of recombinant human TNF on transplanted human colonic carcinoma in nude mice
HUANG Xian-kai, ZHANG Sheng-ben, RAO Ben-qiang
(Department of General Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)
Abstract Objective：To study the effects of recombinant human tumor necrosis factor (rhTNF) on transplanted human colonic carcinoma in nude mice. Methods: Human colonic carcinoma cell line SW480 was transplanted to the body of nude mice. The effects of rhTNF on the growth, histomorphology and cytodynamics of the transplanted colonic carcinoma were obsered. Results: rhTNF inhibited the growth of the transplanted colonic carcinoma in a dosage-dependent manner. Partial necrosis of the carcinomatous cells occurred in the surroundings of tumor vessels with the infiltration of large numbers of inflammatory cells in the necrotic foci. rhTNF stopped the cells cycle progress from G0/G1 phase to S and G2M phases and reduced the proliferative index and DNA content of the carcinomatous cells. Conclusion: rhTNF exerts inhibition on the growth of the transplanted human colonic carcinoma possibly through the following mechanisms: ①To induce inflammatory reaction and vascular damage and ② To interfere with the cell cycle.
, 百拇医药
Key words TNF;colonic carcinoma cell line SW480; colorectal neoplasm; nude mouse
本文观察重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)对人结肠癌裸小鼠移植瘤的作用，旨在阐明TNF对大肠癌的作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 人结肠腺癌裸小鼠移植瘤模型的建立
人结肠高分化腺癌细胞株SW-480由重庆医科大学病生教研室提供。第三军医大学实验动物中心提供BALB/c-nu/nu无胸腺裸小鼠。鼠龄5～7周，体重(20±2)g，雌雄不拘，实验时按无菌原则操作。初代移植瘤采用对数生长期SW-480细胞消化后，调整细胞浓度至4×106/ml，取0.2 ml接种于裸小鼠腹部或颈背部皮下。初代肿瘤长至1 cm×1 cm×1 cm时，选择接种成功的裸小鼠拉颈处死，无菌剥离瘤体，用含双抗的Hanks液洗两次，剪成1～2 mm大小瘤块，经套管针接种于裸小鼠上述部位进行传代。传代5次，每次接种裸小鼠2～3只。
, 百拇医药
1.2 rhTNF对人结肠腺癌SW-480裸小鼠移植瘤的作用
1.2.1 实验分组 将传代后稳定生长的人结肠腺癌移植瘤按前述方法接种于裸小鼠，共30只，随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和腹腔注射组，每组6只。肿瘤长至5～8 mm时，按表1实验，采用瘤内注射(i.t)和腹腔注射(i.p)隔日给药，共10次，末次用药后24 h处死裸小鼠。
表1 药品用量及途径
Tab 1 Dose and route of use of rhTNF Group
Drug(/time)
Method
Control
, 百拇医药 saline 1 ml
i.t
Low dose
rhTNF 500 u
i.t
Mid dose
rhTNF 2 000 u
i.t
High dose
rhTNF 10 000 u
i.t
Peritoneum
, 百拇医药
rhTNF 10 000 u
i.p
1.2.2 瘤重变化 处死裸小鼠剥取肿瘤后，清除脂肪等非肿瘤组织，称量瘤重，按公式计算瘤重抑瘤率：
1.2.3 组织学和超微结构改变 每组均取4只裸小鼠，剥离移植瘤，10%福尔马林固定，石腊包埋，常规切片作HE染色，光镜观察。同时切取3～4块1 mm大小的第五代移植瘤组织，3%戊二醛和1%OsO4固定，丙酮脱水，Epon-812包埋，超薄切片(500～700A)，铀-铅双染色，300 X型透射电子显微镜(SEM)下观察。
1.2.4 细胞周期动力学变化[1] 获取第6代肿瘤组织，Hanks液冲洗3次，将肿瘤剪切成1 mm碎块，Hanks液冲洗2次，消化液(0.25%胰蛋白酶与0.05%胶原酶1∶1)37°C消化20～30 min。800 r离心5～8 min，Hanks液漂洗2～3 min。300目钢筛网除去未充分消化的组织，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至1×10/ml，70%乙醇固定。选用碘化丙啶(PI)DNA染色法，PBS液洗去固定液，加入PI一步染液1 ml，室温放置30 min，流式细胞仪测定。以70 mV的氩离子激光器为激发光源，激发波长为488 nm。测定DNA、蛋白质的荧光强度后，收集10 000个细胞的数据进行分析和处理。采用Barlogie细胞同期分析法，将处于不同时期的细胞分为三部分：G0/G1期、S期、G2M期细胞。每组选取1只裸小鼠移植瘤，按公式计算细胞增殖指数(proliferation index,PI)和DNA抑制率。
, 百拇医药
1.3 统计学处理
数据值均以x±s表示，按需要进行χ2检验或t检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异非常显著。
2 结果
2.1 移植瘤生长情况
初代移植瘤接种成功2只，第二代以后接种成功率100%，至第6代以后肿瘤生长速度稳定。潜伏期7～8d，第二周末直径可达0.5～0.6 cm，第三周起肿瘤生长加快，至第5周末直径平均可达1.9～2.2 cm，此时表面呈结节状，个别肿瘤表面有破溃及出血。
2.2 rhTNF对移植瘤增长的抑制作用
rhTNF瘤内注射或腹腔注射对人结肠腺癌裸小鼠移植瘤具有抑制作用，结果见表2。
, 百拇医药
表2 rhTNF处理后肿瘤重量变化
Tab 2 Effects of rhTNF on weight of transplant tumors
Weight(g)
Inhibition(%)
Control
2.19±0.19
-
Low dose
2.21±0.16
-
Mide dose
, 百拇医药
1.81±0.10**##
17.1±3.6**##
High dose
1.52±0.10**
32.0±3.7**
Peritoneum
1.82±0.06**##
17.2±3.0**##
**：P<0.01 vs Control;##：P<0.01 vs High dose 2.3 rhTNF处理人结肠腺癌裸小鼠移植瘤的组织学变化
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对照组仅见点状、小片状坏死，rhTNF处理组除低剂量组外均出现片状坏死区，坏死范围与剂量相关，中剂量组局灶性坏死多见；高剂量组细胞松散，可见大片状坏死区。坏死瘤细胞多沿血管周围分布，血管结构不清，坏死区有大量炎性细胞浸润，见图1。
图1 rhTNF高剂量组，肿瘤组织坏死，坏死区可见大量炎细胞浸润，血管结构不清(HE×200)
Fig 1 In high dose group of rhTNF, tumorous tissue necrosed, great number of inflammatory cells invaded, and strucure of blood vessel was neclear (HE×200)
2.4 rhTNF处理人结肠腺癌裸小鼠移植瘤的超微结构改变
, http://www.100md.com
对照组细胞连接紧密，具有人结肠高分化腺癌的超微结构特征，rhTNF治疗组可观察到炎性细胞对肿瘤细胞的攻击相；肿瘤细胞坏死、溶解，髓鞘样结构形成，见图2、3。
图2 肿瘤细胞受炎细胞攻击，炎细胞内可见嗜酸性颗粒及溶酶体 (TEM×4 000)
Fig 2 The tumoaous cells were attacked,acidophil pellets and lysosomes were
seen in the inflammatory cells (TEM×4 000)
图3 瘤细胞核溶解、坏死，核膜消失，髓鞘样变 (TEM×5 000)
, 百拇医药
Fig 3 The tumoaous cell nuclear dissolved and necrosed, cell membrane disappeared
and change of similar myelinization was seen (TEM×5 000)
2.5 rhTNF处理人结肠腺癌裸小鼠移植瘤的细胞动力学变化
rhTNF治疗除低剂量组外，中剂量及高剂量组S+G2M期细胞均明显低于对照组，而G0/G1期细胞则高于对照组；增殖指数与对照组相比，高剂量组、中剂量组、腹腔注射组均显著降低(P<0.01)。DNA抑制率高剂量、中剂量、腹腔注射组分别为57.9%、43.7%、43.7%，见表3。
表3 移植瘤细胞动力学分析
, 百拇医药
Tab 3 Cytodynamic analyse of transplant tumors
G0/G1
S
G2/M
PI(%)
DNA inhibition
(%)
Control
58.5
15.5
16.1
, 百拇医药
31.6
-
Low dose
66.2
16.1
17.8
33.9
-
Mide dose
82.2
14.2
3.6
17.8* *
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43.7# #
High dose
86.7
11.1
2.2
13.3* *
57.9
Peritoneum
82.2
15.1
2.7
17.8* *
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43.7#
**：P<0.01 vs Control;＃：P<0.05,##：P<0.01 vs High dose
3 讨论
3.1 rhTNF对大肠癌细胞的抑制作用
肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)是近年来研究较多的一种新型细胞因子，因其具有杀伤多种肿瘤细胞而不损伤正常组织细胞而倍受青睐，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物因子之一，许多实验已证实TNF在体外有杀伤大肠癌细胞的作用。
本实验结果显示，rhTNF在低剂量时，对人结肠癌SW-480裸小鼠移植瘤没有抑制作用；中高剂量时抑瘤率分别为18.3%及33.7%。说明rhTNF对SW-480移植瘤呈低度敏感。我们过去体外观察rhTNF在500～30 000 u/ml时对SW-480细胞仅有抑制作用，60 000 u/ml的浓度对SW-480细胞的杀伤率才28%[2]，与本实验结果相似。增加剂量可以提高rhTNF对人结肠腺癌SW-480移植瘤的抑制率，说明rhTNF对大肠癌的抑制作用在一定剂量范围内呈剂量依赖性。腹腔给药与瘤内给药疗效有显著性差异，瘤内给药的治疗效果好。Marligit等[3]用rhTNF经肝动脉插管灌注治疗结肠癌肝转移化疗无效患者，连续用药15 d，部分患者血浆CEA水平下降，瘤体缩小，表明rhTNF局部给药具有一定的抗大肠肿瘤作用，而且局部用药患者对rhTNF的耐受程度明显高于静脉给药的数倍。结果均提示rhTNF的瘤内应用是较适宜的给药途径。
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3.2 rhTNF抑制大肠癌移植瘤的形态学变化及意义
组织学观察发现rhTNF作用于移植瘤的形态学变化有两个显著的特点：一是肿瘤细胞坏死区常围绕血管分布，血管有出血、坏死现象；二是肿瘤坏死区有大量的炎性细胞浸润，超微结构可较清晰地观察到淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞对大肠癌细胞的攻击相。提示血管系统的损伤可能是TNF产生抗肿瘤作用的重要机制之一。
3.3 rhTNF对大肠癌移植瘤作用的细胞动力学变化及其临床意义
细胞动力学测定用于测定肿瘤细胞DNA相对含量，分析肿瘤细胞周期是一个理想的手段。本实验应用FCM分析rhTNF治疗大肠癌移植瘤的细胞动力学变化和DNA抑制率，旨在阐明rhTNF在体内对大肠癌细胞核酸代谢的影响。结果表明：rhTNF对大肠癌细胞的DNA合成有明显的影响，即使中剂量rhTNF对DNA抑制率也达43.7%。进一步对细胞动力学变化进行分析，rhTNF主要抑制大肠癌细胞从G0/G1期向S期和G2M期过渡，致使大肠癌细胞的S+G2M期比例显著低于对照组，而G0/G1期则高于对照组，S+G2M期细胞在整个肿瘤细胞周期中的比例即增殖指数(PI)反映的是肿瘤细胞增殖能力，rhTNF作用后，能使肿瘤细胞的增殖能力下降，从而起到抑瘤作用。分析rhTNF对肿瘤细胞周期及DNA合成的影响，对临床联合应用化疗药物具有一定指导意义。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270656)
Foundation item: National Natural Science Foundation of China(39270656)
作者简介：黄显凯，男，44岁，副教授，博士
参考文献
[1] 张胜本，张连阳 主编.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性[M].成都：四川科学技术出版社，1995.91-95.
[2] 张胜本，周晓武，张连阳.重组人肿瘤坏死因子对人结肠癌SW-480细胞在体外杀伤作用的研究[J].第三军医大学学报，1995，17(1)：19-23.
[3] Marlight M D, Glora mM, Alexander A, et al. Regional Biologic therapy:Hepaticarterial infusion of recombinant human tulmor necrosis factor in patients withliver metastases[J]. Cancer,1992,69(2):557-563
收稿日期：1999-01-07；修回日期：1999-09-01, 百拇医药