猪耳廓软骨细胞体外培养
作者：李宇 吴利标 许建衡 刘婉秀 孙淑明
单位：汕头大学医学院第一附属医院整形外科(515041)
关键词：组织工程；软骨细胞；体外培养
广东医学991103 【摘要】 目的 为组织工程化软骨修复机体软骨缺损提供实验基础。方法 用消化组织块培养法体外培养猪耳廓软骨细胞。结果 软骨细胞在pH值为7.20，含10%胎牛血清的F12培养基中生长良好，可传代4～5代，细胞数目扩增为原来的10～20倍。结论 消化组织块方法培养软骨细胞是一种可以扩增软骨细胞数目的确实可行的方法。
In vitro culture of pig auricle chondrocytes
Li Yu, Wu Libiao, Xu Jianheng, et al.
, http://www.100md.com
Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital, Medical College, Shantou University, Shantou 515041
【Abstract】 Objective To offer experimental basis for repairing cartilage destruction with tissue engineering cartilage.Methods Pig auricle chondrocyte was cultured in vitro by digestion.Results Chondrocytes grew well in F12 medium with pH 7.20, containing 10% fetal calf serum. These chondrocytes could pass on for 4～5 generations, and their number increased by 10～12 times.Conclusion Culturing chondrocytes by digestion is a reliable and practical way to increase the number of chondrocytes.
, 百拇医药
【Key words】 Tissue engineering Chondrocytes In vitro culture
软骨组织缺损的修复是整形外科丞待解决的难题之一，它不仅需要足够量的软骨组织，而且对其三维形状的要求也很高。传统的方法有自体软骨移植和异体软骨移植，前者由于供体不足，不能满足临床需要；后者因存在免疫排斥反应，而限制了它们的临床应用。80年代后期人们提出了一个新的概念——“组织工程技术”，其基本方法是将体外培养扩增的软骨细胞接种于一种生物相容性良好、并可逐渐降解的生物材料上，形成细胞生物材料复合物，并按特定要求三维塑形，再将其回植入机体软骨缺损部位，形成具有理想形状的新的软骨组织。组织工程技术以其无抗原性、来源不受限制、可按预先设计塑形等特性，将给外科领域特别是整形外科、骨科带来革命性的变化。目前，在裸鼠体内已得到具有特殊形态、功能的组织工程化软骨[1～3]。本文介绍了猪耳廓软骨细胞的培养方法及经验教训，旨在为人软骨细胞的体外培养及组织工程化软骨修复机体软骨缺损，提供和积累必要的实验室基础工作。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验用品
1.1.1 实验器材 直径10 cm的一次性塑料培养皿(德国生产)若干个，50 mL一次性塑料离心管数支(美国生产)，细胞培养器材一套。
1.1.2 实验试剂 0.15%的Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)、F12细胞培养基(美国Sigma公司)、胎牛血清、0.25%的胰蛋白酶(美国Sigma公司)、PBS液、青霉素、链霉素、VitC、谷氨酰胺。
1.2 细胞培养液的制备 将F12试剂粉末一小包溶于1 000 mL的双重蒸馏水，加入VitC 50 mg\,谷氨酰胺300 mg，调pH值为7.20左右，过滤消毒，按100 u/mL、100 μg/mL分别加入青、链霉素，用前加入无菌胎牛血清，使其最终浓度为10%。
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1.3 软骨组织的取材 在无菌操作下切下猪耳廓，仔细剥去皮肤和骨膜，用眼科剪将软骨组织剪成3 mm左右的小方块，置于离心管中，加氯霉素冲洗液冲洗3次，再用PBS液冲洗3次。
1.4 软骨细胞的提取
1.4.1 消化 在上述盛软骨碎块的离心管中加入0.15%Ⅱ型胶原酶，体积约为软骨体积2倍，置于37℃的恒温振荡床中振荡、消化12 h。
1.4.2 收集细胞 将上述悬浊液倒入150目不锈钢滤筛滤去残存组织，2 000 r/min离心5 min，轻轻吸除消化液，加入PBS液，漂洗3次，加入细胞培养液10 mL，振荡混和制成细胞悬液。
1.4.3 计数、检查细胞活力 具体方法参照文献[4]。
1.5 细胞培养方法
, 百拇医药
1.5.1 接种 每个培养皿加入6 mL培养液(含10%的胎牛血清)，加入细胞悬液，每个培养皿接种2×106个细胞，轻微摇动培养皿，使细胞均匀的分布于培养皿中，置入36.5℃，5%CO2温箱培养。
1.5.2 换液 培养第3天细胞已开始分裂生长，此时应更换培养液。具体方法是：用吸管吸去2/3的培养液后再加入等量新的培养液，置温箱继续培养。
1.5.3 传代 吸干培养液，用PBS液轻洗细胞2次，培养皿内加入0.25%的胰蛋白酶，以覆满皿底为限，置温箱2～3 min后，显微镜下观察到细胞质已回缩，细胞间隙增大，少部分细胞已浮于消化液中，即向培养皿里滴入2 mL左右含血清的培养液终止消化，用吸管吸取混和液，反复多次轻吹皿底细胞，使细胞彻底从培养皿底壁脱落，收集细胞混和液，离心，用PBS液漂洗2次，再制成细胞悬液，计数，检查细胞活力，按每个培养皿接种2×106个细胞再培养。
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2 结果
细胞培养到第3天，大部分已贴壁生长；第10天细胞已接近长满培养皿，此时进行传代。随着代数的增加，细胞生长速度越来越慢，细胞传代间隔的时间越来越长，细胞传到4～5代后已开始老化变性。此时收集到的细胞约为原来10～20倍。
3 讨论
软骨组织结构致密，较难消化，消化酶的pH值、浓度及消化时间，对收集到的细胞的量及活力影响较大。另外，软骨细胞在培养、传代、扩增过程中对血清、培养皿以及传代的时机要求较为严格。
3.1 消化酶pH值、浓度及消化时间的确定 消化酶的pH值制约着其活性，消化酶的浓度决定着组织消化时间的长短，过长会降低细胞的生命活力，甚至使细胞死亡，消化时间过短，又收集不到细胞。作者经过对不同浓度、不同消化时间的反复对比，最终采用0.15% pH值为7.4的Ⅱ型胶原酶，在37℃恒温振荡下，消化软骨组织，12 h后收集细胞，测得细胞活力为85%。
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3.2 培养皿和血清的选择 软骨细胞在体外培养时不易贴壁生长，培养皿和血清的质量对其影响极大。本文作者用玻璃培养皿和一次性塑料培养皿(德国生产)，进行培养对照，发现一次性培养皿细胞贴壁时间明显短于玻璃培养皿，细胞分裂指数也明显增大；另外，一次性培养皿避免了刷洗时留下的划痕和残留杂质，有利于实验者观察。故在经济许可的情况下，最好采用一次性塑料培养皿。
血清中含有细胞增殖所需的生长因子和活性物质，培养液中血清的质量在很大程度上影响着细胞的生长。作者用含10%胎牛血清和20%小牛血清的培养液做培养对照，结果发现前者细胞的生长明显优于后者(细胞贴壁时间短于后者，分裂指数大于后者)，但前者的价格较为昂贵。
3.3 细胞传代时消化酶的浓度及消化时机的把握 ①消化酶的浓度、pH值及消化时间对细胞传代极为重要，浓度高则细胞反应快，掌握不好，细胞易死亡，浓度低和pH值不当时细胞消化慢，消化下来的细胞成片，不利计数。本实验采用pH值为8.0、浓度为0.25%的胰蛋白酶，在37℃温箱里消化2 min，取得满意效果。②把握好传代时机，在80%～90%汇合阶段最合适，过早传代细胞产量少，过晚细胞密度太大而出现接触抑制和细胞毒性作用，细胞的健康状态不佳。
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3.4 软骨细胞在体外培养中的特性 软骨细胞在体外经培养一段时间后，细胞极易老化，丧失分泌基质的能力，从而难以从少量的软骨组织培养中获得大量的软骨细胞。目前获得大量软骨细胞只能切取大量的软骨组织，不符合组织工程的要求和目的。如何促进软骨细胞的生长，减慢软骨细胞衰老的速度，是组织工程化修复软骨缺损亟待解决的问题。
*本研究系广东省医学科研基金课题(A199703)
参考文献
1 Vacanti CA. Neo-cartilage generated from chondrocyte isolated from 100-year-old human cartilage. Transplation Proceedings, 1994, 26(6):3434
2 Vacanti CA. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast Reconstr Surg, 1991, 88(2)：245
3 Sims CD. Injectable cartilage using polyethylene oxide polymer substrates. Plast Reconstr Surg, 1996, 98(5): 843
4 鄂 征，主编.组织培养和分子细胞学技术.第2版.北京：北京出版社，1997.87～88, http://www.100md.com
单位：汕头大学医学院第一附属医院整形外科(515041)
关键词：组织工程；软骨细胞；体外培养
广东医学991103 【摘要】 目的 为组织工程化软骨修复机体软骨缺损提供实验基础。方法 用消化组织块培养法体外培养猪耳廓软骨细胞。结果 软骨细胞在pH值为7.20，含10%胎牛血清的F12培养基中生长良好，可传代4～5代，细胞数目扩增为原来的10～20倍。结论 消化组织块方法培养软骨细胞是一种可以扩增软骨细胞数目的确实可行的方法。
In vitro culture of pig auricle chondrocytes
Li Yu, Wu Libiao, Xu Jianheng, et al.
, http://www.100md.com
Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital, Medical College, Shantou University, Shantou 515041
【Abstract】 Objective To offer experimental basis for repairing cartilage destruction with tissue engineering cartilage.Methods Pig auricle chondrocyte was cultured in vitro by digestion.Results Chondrocytes grew well in F12 medium with pH 7.20, containing 10% fetal calf serum. These chondrocytes could pass on for 4～5 generations, and their number increased by 10～12 times.Conclusion Culturing chondrocytes by digestion is a reliable and practical way to increase the number of chondrocytes.
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【Key words】 Tissue engineering Chondrocytes In vitro culture
软骨组织缺损的修复是整形外科丞待解决的难题之一，它不仅需要足够量的软骨组织，而且对其三维形状的要求也很高。传统的方法有自体软骨移植和异体软骨移植，前者由于供体不足，不能满足临床需要；后者因存在免疫排斥反应，而限制了它们的临床应用。80年代后期人们提出了一个新的概念——“组织工程技术”，其基本方法是将体外培养扩增的软骨细胞接种于一种生物相容性良好、并可逐渐降解的生物材料上，形成细胞生物材料复合物，并按特定要求三维塑形，再将其回植入机体软骨缺损部位，形成具有理想形状的新的软骨组织。组织工程技术以其无抗原性、来源不受限制、可按预先设计塑形等特性，将给外科领域特别是整形外科、骨科带来革命性的变化。目前，在裸鼠体内已得到具有特殊形态、功能的组织工程化软骨[1～3]。本文介绍了猪耳廓软骨细胞的培养方法及经验教训，旨在为人软骨细胞的体外培养及组织工程化软骨修复机体软骨缺损，提供和积累必要的实验室基础工作。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验用品
1.1.1 实验器材 直径10 cm的一次性塑料培养皿(德国生产)若干个，50 mL一次性塑料离心管数支(美国生产)，细胞培养器材一套。
1.1.2 实验试剂 0.15%的Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)、F12细胞培养基(美国Sigma公司)、胎牛血清、0.25%的胰蛋白酶(美国Sigma公司)、PBS液、青霉素、链霉素、VitC、谷氨酰胺。
1.2 细胞培养液的制备 将F12试剂粉末一小包溶于1 000 mL的双重蒸馏水，加入VitC 50 mg\,谷氨酰胺300 mg，调pH值为7.20左右，过滤消毒，按100 u/mL、100 μg/mL分别加入青、链霉素，用前加入无菌胎牛血清，使其最终浓度为10%。
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1.3 软骨组织的取材 在无菌操作下切下猪耳廓，仔细剥去皮肤和骨膜，用眼科剪将软骨组织剪成3 mm左右的小方块，置于离心管中，加氯霉素冲洗液冲洗3次，再用PBS液冲洗3次。
1.4 软骨细胞的提取
1.4.1 消化 在上述盛软骨碎块的离心管中加入0.15%Ⅱ型胶原酶，体积约为软骨体积2倍，置于37℃的恒温振荡床中振荡、消化12 h。
1.4.2 收集细胞 将上述悬浊液倒入150目不锈钢滤筛滤去残存组织，2 000 r/min离心5 min，轻轻吸除消化液，加入PBS液，漂洗3次，加入细胞培养液10 mL，振荡混和制成细胞悬液。
1.4.3 计数、检查细胞活力 具体方法参照文献[4]。
1.5 细胞培养方法
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1.5.1 接种 每个培养皿加入6 mL培养液(含10%的胎牛血清)，加入细胞悬液，每个培养皿接种2×106个细胞，轻微摇动培养皿，使细胞均匀的分布于培养皿中，置入36.5℃，5%CO2温箱培养。
1.5.2 换液 培养第3天细胞已开始分裂生长，此时应更换培养液。具体方法是：用吸管吸去2/3的培养液后再加入等量新的培养液，置温箱继续培养。
1.5.3 传代 吸干培养液，用PBS液轻洗细胞2次，培养皿内加入0.25%的胰蛋白酶，以覆满皿底为限，置温箱2～3 min后，显微镜下观察到细胞质已回缩，细胞间隙增大，少部分细胞已浮于消化液中，即向培养皿里滴入2 mL左右含血清的培养液终止消化，用吸管吸取混和液，反复多次轻吹皿底细胞，使细胞彻底从培养皿底壁脱落，收集细胞混和液，离心，用PBS液漂洗2次，再制成细胞悬液，计数，检查细胞活力，按每个培养皿接种2×106个细胞再培养。
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2 结果
细胞培养到第3天，大部分已贴壁生长；第10天细胞已接近长满培养皿，此时进行传代。随着代数的增加，细胞生长速度越来越慢，细胞传代间隔的时间越来越长，细胞传到4～5代后已开始老化变性。此时收集到的细胞约为原来10～20倍。
3 讨论
软骨组织结构致密，较难消化，消化酶的pH值、浓度及消化时间，对收集到的细胞的量及活力影响较大。另外，软骨细胞在培养、传代、扩增过程中对血清、培养皿以及传代的时机要求较为严格。
3.1 消化酶pH值、浓度及消化时间的确定 消化酶的pH值制约着其活性，消化酶的浓度决定着组织消化时间的长短，过长会降低细胞的生命活力，甚至使细胞死亡，消化时间过短，又收集不到细胞。作者经过对不同浓度、不同消化时间的反复对比，最终采用0.15% pH值为7.4的Ⅱ型胶原酶，在37℃恒温振荡下，消化软骨组织，12 h后收集细胞，测得细胞活力为85%。
, 百拇医药
3.2 培养皿和血清的选择 软骨细胞在体外培养时不易贴壁生长，培养皿和血清的质量对其影响极大。本文作者用玻璃培养皿和一次性塑料培养皿(德国生产)，进行培养对照，发现一次性培养皿细胞贴壁时间明显短于玻璃培养皿，细胞分裂指数也明显增大；另外，一次性培养皿避免了刷洗时留下的划痕和残留杂质，有利于实验者观察。故在经济许可的情况下，最好采用一次性塑料培养皿。
血清中含有细胞增殖所需的生长因子和活性物质，培养液中血清的质量在很大程度上影响着细胞的生长。作者用含10%胎牛血清和20%小牛血清的培养液做培养对照，结果发现前者细胞的生长明显优于后者(细胞贴壁时间短于后者，分裂指数大于后者)，但前者的价格较为昂贵。
3.3 细胞传代时消化酶的浓度及消化时机的把握 ①消化酶的浓度、pH值及消化时间对细胞传代极为重要，浓度高则细胞反应快，掌握不好，细胞易死亡，浓度低和pH值不当时细胞消化慢，消化下来的细胞成片，不利计数。本实验采用pH值为8.0、浓度为0.25%的胰蛋白酶，在37℃温箱里消化2 min，取得满意效果。②把握好传代时机，在80%～90%汇合阶段最合适，过早传代细胞产量少，过晚细胞密度太大而出现接触抑制和细胞毒性作用，细胞的健康状态不佳。
, 百拇医药
3.4 软骨细胞在体外培养中的特性 软骨细胞在体外经培养一段时间后，细胞极易老化，丧失分泌基质的能力，从而难以从少量的软骨组织培养中获得大量的软骨细胞。目前获得大量软骨细胞只能切取大量的软骨组织，不符合组织工程的要求和目的。如何促进软骨细胞的生长，减慢软骨细胞衰老的速度，是组织工程化修复软骨缺损亟待解决的问题。
*本研究系广东省医学科研基金课题(A199703)
参考文献
1 Vacanti CA. Neo-cartilage generated from chondrocyte isolated from 100-year-old human cartilage. Transplation Proceedings, 1994, 26(6):3434
2 Vacanti CA. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast Reconstr Surg, 1991, 88(2)：245
3 Sims CD. Injectable cartilage using polyethylene oxide polymer substrates. Plast Reconstr Surg, 1996, 98(5): 843
4 鄂 征，主编.组织培养和分子细胞学技术.第2版.北京：北京出版社，1997.87～88, http://www.100md.com