输血传播病毒在原发性肝癌患者中的感染状况研究
作者：姚春斓 周元平 李建国 卢建溪 彭晓谋 高志良
单位：中山医科大学附属第三医院传染科(510630)
关键词：原发性肝癌；输血传播病毒；巢式聚合酶链反应
广东医学991106 【摘要】 目的 了解新型肝炎病毒输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)在原发性肝癌(PLC)患者中的感染状况。方法 在TTV长的ORF保守区设计引物，建立巢式聚合酶链反应(PCR)技术，检测了151例原发性肝癌患者血清中TTV DNA。结果 151例原发性肝癌患者中有28例TTV DNA阳性，阳性率为18.5%；而同时检测125例正常人血清只有3例TTV阳性，阳性率为2.4%。结论 TTV在原发性肝癌患者中存在，TTV PCR诊断技术对慢性肝炎向肝癌发展具有重要意义。
Prevalence of transfusion transmitted virus infection in patients with primary liver cancer
, 百拇医药
Yao Chunlan, Zhou Yuanping, Li Jianguo, et al.
Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630
【Abstract】 Objective To investigate the prevalence of transfusion transmitted virus (TTV) in patients with primary liver cancer (PLC).Methods A nested polymerase chain reaction (PCR) assay with primers from ORF1 of TTV genome was established to detect TTV DNA in sera of 151 PLC patients and 125 controls.Results 28 of 151 (18.5%) PLC patients and 3 of 125 (2.4%) controls were positive for TTV DNA (P<0.005).Conclusion Prevalence of TTV DNA in the patients with PLC is significantly higher than that in controls. The nested PCR assay of TTV DNA is a useful technique for studying relationship between TTV infection and PLC.
, 百拇医药
【Key words】 Primary liver cancer Transfusion transmitted virus Nested polymerase chain reaction
输血传播病毒(transfusion transmittted virus, TTV)是一种新发现的与肝炎相关的单链DNA病毒[1，2]，为了解原发性肝癌(PLC)患者中TTV感染状况，我们应用聚合酶链反应(PCR)技术检测了广州地区151例PLC患者以及125例健康人血清中的TTV DNA，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 151例病人血清采自中山医科大学附属肿瘤医院住院的PLC病人。经手术取材病理确诊为PLC。125例正常人血清采自1998年中山医科大学附属第三医院的职工体检，血清标本用消毒离心管分装，在-20℃下保存。
, 百拇医药
1.2 血清肝炎标志物的检测 HBsAg、HBeAg、抗-HBc、抗-HCV-IgG、采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，试剂均为卫生部核准产品，按说明书操作并诊断结果。HCV及HGV采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测。
1.3 TTV引物及主要试剂 根据Okamoto等[2]报道的TTV基因序列，采用Goldkey软件，在TTV长的ORF保守区设计2对套式引物，委托中山医科大学达安基因诊断中心合成。引物序如下。
T1 5′GCAGCGCAATAGGATATGT 3′，T2 5′TGACTGTCGTAAAGCCTCTA 3′，T3 5′CATACATGAATGCCAGGC 3′，T4 5′GTACTTCAAGCTGGTGAAAT3′，T1与T2为外引物，T3和T4为内引物。TaqDNA聚合酶、dNTPs和Marker均为美国生命技术公司产品。
, 百拇医药 1.4 TTV DNA的检测 采用热变性法从50 μL血清标本中提取DNA。第1次PCR：反应体积20 μL，含模板5 μL、1×反应缓冲液、dNTPs各200 μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U，引物T1和T2各20 pmol,90℃预变性2 min，94℃ 40 s,55℃ 40 s，72℃ 60 s 35个循环，72℃延伸7 min。第2次PCR：反应体积20 μL，含第1次PCR产物3 μL，1×反应缓冲液、dNTPs各200 μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U，引物T3和T4各20 pmol, 94℃预变性1 min，94℃ 30 s, 55℃ 40 s, 72℃ 50 s 30个循环，72℃延伸7 min。取第2次PCR产物10 μL经2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。除严格按Kwok防污染要求外，每次PCR均设阳性和阴性对照。
2 结果
2.1 PCR产物的结果 所有阳性标本均经两次实验证实，扩增产物为197 bp,与预期大小一致。见图1。
, 百拇医药
图1 TTV DNA nPCR检测电泳结果
1 DNA分子量标志(100 bp ladder)，2 阳性对照， 3 阴性对照，4～8 待检标本(4，5，6，8为阳性结果，7为阴性结果)
2.2 PLC患者及正常人群TTV感染结果 151例PLC患者中，血清TTV阳性为28例，阳性率为18.5%。125正常人血清TTV阳性3例，阳性率为2.4%，结果见表1。
表1 肝癌患者与正常人TTV感染比较
例数
TTV阳性[例(%)]
PLC
151
, 百拇医药 28(18.5)
正常人
125
3(2.40)
两组比较χ2＝17.87，P<0.01
2.3 PLC患者TTV与其他肝炎病毒感染状况 我们将151例PLC患者对其他病毒性肝炎的感染作了分析，HBV感染率最高，HCV，HGV感染率与TTV感染率基本接近。结果如表2。
表2 PLC患者TTV与其他肝炎病毒感染状况
例数
阳性[例(%)]
TTV
, 百拇医药
151
28(18.5)
HBV
151
135(89.4)
HCV
151
19(12.6)
HGV
151
22(14.6)
3 讨论
1997年底由日本学者采用代表性差异分析法(representional difference analysis, RDA)克隆鉴定的又一种新的肝炎相关病毒。它是引起病毒性肝炎的病原中唯一的单链DNA病毒，目前尚未确定TTV属DNA病毒中的哪一种。
, http://www.100md.com
国内对TTV的研究刚刚起步，对TTV在中国的流行情况和致病性目前尚不十分清楚。本研究显示，151例PLC患者阳性28例，阳性率为8.5%，与PLC患者中的HCV，HGV感染率基本接近。正常人中也存在TTV感染，PLC与正常人TTV感染比较具有统计学差异(P<0.01)。据国外学者的研究[3]表明TTV在献血员中的携带率为1%～16%，国内亦有经血传播病毒(TTV)的报道[4]。HGV，HBV和HCV的传播途径及流行情况类似，主要通过输血、血制品和注射途径感染。是否TTV，HGV，HCV与HBV均有协同的致癌作用?从本文研究来说，没有证据表明TTV在PLC发生中起着重要作用，只是PLC病人TTV感染率明显高于正常人群。
*受广东省科委自然科学基金资助(项目编号：96154)
高志良 课题负责人
参考文献
, 百拇医药
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unkown etiology. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241:92
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of transfusion transmitted virus (TTV) associated with posttransfusiom hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research, 1998, 10:1
3 Pritchard DI, Arnot DE, Piley EM, et al. Global distribution of transfusion transmitted virus. NEJM, 1998, 339(11): 776
4 马为民，周伯平，王火生，等.一种新的可经输血传播病毒(TTV)的分子流行病学研究.中华肝脏病杂志，1998, 9(3)：167, 百拇医药
单位：中山医科大学附属第三医院传染科(510630)
关键词：原发性肝癌；输血传播病毒；巢式聚合酶链反应
广东医学991106 【摘要】 目的 了解新型肝炎病毒输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)在原发性肝癌(PLC)患者中的感染状况。方法 在TTV长的ORF保守区设计引物，建立巢式聚合酶链反应(PCR)技术，检测了151例原发性肝癌患者血清中TTV DNA。结果 151例原发性肝癌患者中有28例TTV DNA阳性，阳性率为18.5%；而同时检测125例正常人血清只有3例TTV阳性，阳性率为2.4%。结论 TTV在原发性肝癌患者中存在，TTV PCR诊断技术对慢性肝炎向肝癌发展具有重要意义。
Prevalence of transfusion transmitted virus infection in patients with primary liver cancer
, 百拇医药
Yao Chunlan, Zhou Yuanping, Li Jianguo, et al.
Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630
【Abstract】 Objective To investigate the prevalence of transfusion transmitted virus (TTV) in patients with primary liver cancer (PLC).Methods A nested polymerase chain reaction (PCR) assay with primers from ORF1 of TTV genome was established to detect TTV DNA in sera of 151 PLC patients and 125 controls.Results 28 of 151 (18.5%) PLC patients and 3 of 125 (2.4%) controls were positive for TTV DNA (P<0.005).Conclusion Prevalence of TTV DNA in the patients with PLC is significantly higher than that in controls. The nested PCR assay of TTV DNA is a useful technique for studying relationship between TTV infection and PLC.
, 百拇医药
【Key words】 Primary liver cancer Transfusion transmitted virus Nested polymerase chain reaction
输血传播病毒(transfusion transmittted virus, TTV)是一种新发现的与肝炎相关的单链DNA病毒[1，2]，为了解原发性肝癌(PLC)患者中TTV感染状况，我们应用聚合酶链反应(PCR)技术检测了广州地区151例PLC患者以及125例健康人血清中的TTV DNA，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 151例病人血清采自中山医科大学附属肿瘤医院住院的PLC病人。经手术取材病理确诊为PLC。125例正常人血清采自1998年中山医科大学附属第三医院的职工体检，血清标本用消毒离心管分装，在-20℃下保存。
, 百拇医药
1.2 血清肝炎标志物的检测 HBsAg、HBeAg、抗-HBc、抗-HCV-IgG、采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，试剂均为卫生部核准产品，按说明书操作并诊断结果。HCV及HGV采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测。
1.3 TTV引物及主要试剂 根据Okamoto等[2]报道的TTV基因序列，采用Goldkey软件，在TTV长的ORF保守区设计2对套式引物，委托中山医科大学达安基因诊断中心合成。引物序如下。
T1 5′GCAGCGCAATAGGATATGT 3′，T2 5′TGACTGTCGTAAAGCCTCTA 3′，T3 5′CATACATGAATGCCAGGC 3′，T4 5′GTACTTCAAGCTGGTGAAAT3′，T1与T2为外引物，T3和T4为内引物。TaqDNA聚合酶、dNTPs和Marker均为美国生命技术公司产品。
, 百拇医药 1.4 TTV DNA的检测 采用热变性法从50 μL血清标本中提取DNA。第1次PCR：反应体积20 μL，含模板5 μL、1×反应缓冲液、dNTPs各200 μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U，引物T1和T2各20 pmol,90℃预变性2 min，94℃ 40 s,55℃ 40 s，72℃ 60 s 35个循环，72℃延伸7 min。第2次PCR：反应体积20 μL，含第1次PCR产物3 μL，1×反应缓冲液、dNTPs各200 μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U，引物T3和T4各20 pmol, 94℃预变性1 min，94℃ 30 s, 55℃ 40 s, 72℃ 50 s 30个循环，72℃延伸7 min。取第2次PCR产物10 μL经2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。除严格按Kwok防污染要求外，每次PCR均设阳性和阴性对照。
2 结果
2.1 PCR产物的结果 所有阳性标本均经两次实验证实，扩增产物为197 bp,与预期大小一致。见图1。
, 百拇医药
图1 TTV DNA nPCR检测电泳结果
1 DNA分子量标志(100 bp ladder)，2 阳性对照， 3 阴性对照，4～8 待检标本(4，5，6，8为阳性结果，7为阴性结果)
2.2 PLC患者及正常人群TTV感染结果 151例PLC患者中，血清TTV阳性为28例，阳性率为18.5%。125正常人血清TTV阳性3例，阳性率为2.4%，结果见表1。
表1 肝癌患者与正常人TTV感染比较
例数
TTV阳性[例(%)]
PLC
151
, 百拇医药 28(18.5)
正常人
125
3(2.40)
两组比较χ2＝17.87，P<0.01
2.3 PLC患者TTV与其他肝炎病毒感染状况 我们将151例PLC患者对其他病毒性肝炎的感染作了分析，HBV感染率最高，HCV，HGV感染率与TTV感染率基本接近。结果如表2。
表2 PLC患者TTV与其他肝炎病毒感染状况
例数
阳性[例(%)]
TTV
, 百拇医药
151
28(18.5)
HBV
151
135(89.4)
HCV
151
19(12.6)
HGV
151
22(14.6)
3 讨论
1997年底由日本学者采用代表性差异分析法(representional difference analysis, RDA)克隆鉴定的又一种新的肝炎相关病毒。它是引起病毒性肝炎的病原中唯一的单链DNA病毒，目前尚未确定TTV属DNA病毒中的哪一种。
, http://www.100md.com
国内对TTV的研究刚刚起步，对TTV在中国的流行情况和致病性目前尚不十分清楚。本研究显示，151例PLC患者阳性28例，阳性率为8.5%，与PLC患者中的HCV，HGV感染率基本接近。正常人中也存在TTV感染，PLC与正常人TTV感染比较具有统计学差异(P<0.01)。据国外学者的研究[3]表明TTV在献血员中的携带率为1%～16%，国内亦有经血传播病毒(TTV)的报道[4]。HGV，HBV和HCV的传播途径及流行情况类似，主要通过输血、血制品和注射途径感染。是否TTV，HGV，HCV与HBV均有协同的致癌作用?从本文研究来说，没有证据表明TTV在PLC发生中起着重要作用，只是PLC病人TTV感染率明显高于正常人群。
*受广东省科委自然科学基金资助(项目编号：96154)
高志良 课题负责人
参考文献
, 百拇医药
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unkown etiology. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241:92
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of transfusion transmitted virus (TTV) associated with posttransfusiom hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research, 1998, 10:1
3 Pritchard DI, Arnot DE, Piley EM, et al. Global distribution of transfusion transmitted virus. NEJM, 1998, 339(11): 776
4 马为民，周伯平，王火生，等.一种新的可经输血传播病毒(TTV)的分子流行病学研究.中华肝脏病杂志，1998, 9(3)：167, 百拇医药