卵巢早衰与细胞因子TNF-α，IFN-γ和IL-2的相关性研究
作者：谢端薇 欧汝强 杨宁 王一峰 陈巧儿 叶嘉玲 韦相才 杨日普 黄最 郭智勇
单位：谢端薇 欧汝强 杨宁 王一峰 陈巧儿 叶嘉玲 韦相才(广东省计划生育科研所(510600))；杨日普 黄最 智勇(广州军区广州总医院(510010))
关键词：卵巢早衰；自身免疫；干扰素γ；白细胞介素2；肿瘤坏死因子α
广东医学991105 【摘要】 目的 探讨细胞因子TNF-α，IFN-γ和IL-2与自身免疫性卵巢早衰(POF)发病关系。方法 以ELISA方法测定卵巢早衰患者血清中抗卵巢抗体(AoAb)水平，以免疫放射和放射免疫测定卵巢早衰患者血清中IFN-γ，IL-2和TNF-α的水平。结果 POF组的AoAb明显高于正常对照组，TNF-α和IL-2较低，IFN-γ明显升高，这些细胞因子的水平与AoAb呈高度显著性正相关，相关系数分别为r=0.89，r=0.93,r=0.86(P均<0.01)。结论 细胞因子在自身免疫性卵巢早衰的发生中起着重要作用。
, 百拇医药
Association between premature ovarian failure and TNF-α, IFN-γ or IL-2
Xie Duanwei, Ou Ruqiang, Yang Ning, et al.
Family Planning Research Institute of Guangdong, Guangzhou 510600
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between premature ovarian failure (POF) and cytokines TNF-α, IFN-γ or IL-2.Methods Serum anti-ovarian antibodies (AoAb) in 20 patients with POF were detected by ELISA. Serum IL-2 and IFN-γ level were measured by immunoradio-metric assay (IRMA) and TNF-α measured by radio-immunoassay (RIA), respectively.Results Patients with POF had higher AoAb and IFN-γ level, and lower TNF-α or IL-2 level than normal controls (all P<0.01). A highly significant positive correlation existed between AoAb and TNF-α, IFN-γ or IL-2, with r=0.89 (P<0.01)，r=0.86(P<0.01)， and r=0.93(P<0.01). Conclusion TNF-α, IFN-γ and IL-2 play an important role in autoimmune POF.
, 百拇医药
【Key words】 Premature ovarian failure Autoimmunity IFN-γ IL-2 TNF-α
卵巢早衰(POF)的发病率育龄妇女为1%，病因多种，其中部分患者与自身免疫有关[1]。目前许多研究均是集中在抗卵巢抗体[2]。近年来发现细胞免疫及免疫细胞分泌的细胞因子在POF的发病中作用甚为重要[3，4]，已经有许多关于POF患者淋巴细胞亚群改变的研究[5]，但对细胞因子的研究不够系统。本文以免疫放射测定(IRMA)和放射免疫测定(RIA)方法分别测定POF患者血清中干扰素γ(IFN-γ)\,白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平，探讨这些细胞因子在卵巢早衰患者与正常对照妇女之间的差异，自身免疫性POF患者与非自身免疫性POF患者之间的差异及这些细胞因子在POF发病中的作用。
, 百拇医药 1 材料与方法
1.1 对象和样品的收集 本研究征集20例年龄由27～40岁的妇女，停经至少0.5 a以上，病程最长者10 a，发病年龄最小17岁。3个月内未用过性激素类药物。血清内分泌检查：FSH>40 IU/L,LH>30 IU/L,E2<25 pg/mL,确诊为POF患者。空腹静脉取血，分离血清于-40℃保存。同时征集了20例年龄相仿，月经周期正常，无炎症性疾病及肿瘤的妇女作正常对照组。
1.2 材料 IL-2和IFN-γ采用比利时MEDGENIX公司IRAM试剂盒，TNF-α采用北京东亚免疫技术研究所RIA试剂盒。阳性参考血清由本实验室自制。
1.3 测定方法
1.3.1 卵巢抗原制备 取多份手术契形切除卵巢的正常组织洗净、剪碎，经匀浆和Triton X-100(德国产品)提取后，以亲和层析法提取卵巢抗原。
, 百拇医药
1.3.2 AoAb的检测 以酶联免疫吸附(ELISA)间接法检测血清中的抗卵巢抗体(AoAb)。以每孔2 μg抗原包被微孔板，并以2%BSA封板，加入阳性参考血清和待测血清，洗涤后加入酶标记的第2抗体和底物，在Bio-tek自动酶标仪测定。把阳性参考血清设定为400 u/mL。以正常对照血清AoAb的
±2s为上限，大于上限值判断为阳性。
1.3.3 血清IFN-γ，IL-2和TNF-α的测定 严格按照说明书进行操作。本批实验测得的3个试剂盒的批内变异系数分别为2.3%，2.5%和1.9%。
1.4 数据处理及统计分析 结果用几何平均值()和标准差(s)表示，并用t检验和u检验进行统计分析，以回归分析法检验TNF-α，IFN-γ和IL-2水平与抗体水平的相关性及细胞因子间的相关性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 卵巢早衰(POF)患者与正常对照组血清中AoAb水平比较 正常对照组血清中AoAb水平为89.02±43.07 u/mL,POF患者为220.04±91.85 u/mL，两组相比差异有显著性(P<0.001)；POF的血清抗体阳性者AoAb水平为272.52±86.84 u/mL，抗体阴性者抗体水平为136.5±27.52 u/mL，两组比较差异有显著性(P<0.001)。
2.2 POF患者血清中TNF-α，IFN-γ和IL-2的水平 POF患者血清中三种细胞因子的水平与正常生育妇女组比较，差异都有显著性。TNF-α，IL-2明显低于正常对照组，IFN-γ明显高于对照组，结果见表1。
表1 卵巢早衰患者血清中TNF-α，IFN-γ和IL-2的水平 (±s) 组别
, 百拇医药
n
TNF-α(pg/mL)
IFN-γ(IU/mL)
IL-2 (IU/mL)
卵巢早衰组
20
1 260±200
0.81±0.32△
0.10±0.05
正常对照组
20
, 百拇医药
1 610±330
0.42±0.18
0.16±0.10
注：与正常对照组比较P<0.001,△P<0.01
2.3 POF抗体阳性者血清中TNF-α，IFN-γ和IL-2水平与抗体阴性组的结果比较 在POF血清AoAb阳性患者血清中TNF-α，IFN-γ和IL-2三种细胞因子的水平都明显高于AoAb阴性妇女，结果见表2。
表2 POF抗体阳性与阴性患者血清中TNF-α，IFN-γ和IL-2比较 (±s) 组别
n
, 百拇医药
TNF-α(pg/mL)
IFN-γ(IU/mL)
IL-2 (IU/mL)
AoAb阳性组
7
1 486±292
0.96±0.30△
0.12±0.06
AoAb阴性组
13
1 190±460
, 百拇医药
0.37±0.26
0.06±0.05
注：与抗卵巢抗体阴性组比较P<0.05,△P<0.001
2.4 细胞因子水平与抗卵巢抗体水平相关性和细胞因子之间相关性分析 在POF患者血清中，TNF-α，IFN-γ和IL-2水平与抗卵巢抗体的水平有高度显著性正相关，相关系数分别为r=0.89(P<0.01)，r=0.86(P<0.01)，r=0.93(P<0.01)。细胞因子之间也有高度正相关，TNF-α与IFN-γ之间，相关系数r=0.71(P<0.05)，IFN-γ和IL-2之间也是正相关，相关系数r=0.87(P<0.01)。
3 讨论
卵巢早衰(POF)与免疫系统紊乱有密切关系，主要表现在机体免疫系统对卵巢的一种自身免疫反应。Kim等报道，在POF患者血清中可测到AoAb，并有淋巴细胞和浆细胞在卵巢的浸润和淋巴细胞亚群的改变[1]，据Luborsky等报道，POF患者抗卵巢抗体的阳性范围为18%～70%[6]。我们研究发现在20例POF患者血清中AoAb阳性为7例，阳性率为35%，卵巢抗原成分有颗粒细胞、黄体细胞、甾体激素产生细胞、卵细胞和内皮细胞等。由于AoAb作用于这些卵巢的特异性靶细胞引起这些细胞的损伤，使卵泡过度闭锁，从而发生POF及不孕。
, http://www.100md.com
我们研究发现IL-2，IFN-γ和TNF-α在POF患者血清中的水平，与正常组进行比较，TNF-α明显低于对照组，与Naz等[4]测定的结果一致，IL-2也低于正常对照组，这一结果的原因有待进一步研究。但这三种细胞因子的变化都与免疫异常有密切关系，分泌的量与抗卵巢抗体水平有密切关系。抗体阳性患者三种细胞因子分泌的量明显高于相对应的抗体阴性患者组。TNF-α，IFN-γ和IL-2在血清中的水平与抗卵巢抗体效价有高度正相关。细胞因子TNF-α与IFN-γ之间，IFN-γ与IL-2之间也有高度相关，在正常情况下，卵泡从始基卵泡发育至成熟卵泡、排卵或闭锁，细胞因子参与了全过程的调控是通过内分泌、旁分泌和(或)自分泌机制实现的[7]，根据Russell的报道[8]，卵泡闭锁是由IFN-γ开始并激活一系列细胞因子而引起。当机体免疫异常时，卵巢抗原激活CD4 T细胞，使CD4的细胞数量增加或功能增强，因此CD4 T细胞表达和分泌细胞因子(IFN-γ)数量增加，这些细胞因子可直接作用于B细胞，促进B细胞增殖、分化和分泌Ig,也可诱导CTL，NK和LAK等多种杀伤细胞分化和效能，导致卵巢的抗原靶细胞损伤或凋亡(如颗粒细胞、甾体激素产生细胞、黄体细胞和卵细胞)。由于卵巢的过度损伤及凋亡，造成卵泡过度闭锁，排卵障碍，最后发生不育及POF。
, 百拇医药
综上所述，部分POF是一种自身免疫性疾病，卵巢抗原可以引起免疫系统产生抗卵巢抗体和免疫细胞及其他细胞产生分泌细胞因子改变，所以，对有自身免疫可能的人，及时进行检查，及时治疗，以防止POF的发生。
*本课题为广东省重点攻关项目(课题号9656)
参考文献
1 Kim JG, Moon SY, Chang YS, et al. Autoimmune premature ovarian failure. J Obstet Gynaecol, 1995, 21(1): 59
2 Wheateroft NJ, Toogood AA, Li TC, et al. Detection of antigens in women with premature ovarian failure. Clin Exp Immunol, 1994, 96:122
, 百拇医药
3 Hoek A, Van KY, De-haan MM, et al. Analysis of peripheral blood lymphocyte subsets, NK cells and delayed type hypersensitivity skin test in patients with premature ovarian failure. Am J Reprod Immunol, 1995, 33(6): 495
4 Naz PK, Thurston D, Santoro N. Circulating tumor necrosis factor (TNF)-alpha in normally cycling women and patients with premature ovarian failure and polycystic ovaries. Am J Reprod Immunol, 1995, 34(3): 170
, 百拇医药 5 杨桂艳，王一理，曹缵孙，等.卵巢早衰患者外周血CD4+Th1/Th2细胞分布研究.生殖医学杂志，1998，7(4)：227
6 Luborsky JL, Visintin I, Boyers S, et al. Ovarian antibodies detected by immunoassy in patient with premature ovarian failure. J Clinic Endocrinol and Metabolism, 1990, 70(1): 69
7 Yamada Y, Saton K. Folliculogenesis and regulating factors. Nippon Rinsho, 1997, 55(11):2822
8 Russell P. The clinicpathological features premature ovarian failure. Verh Dtsch Ges Pathol, 1997, 81:197, http://www.100md.com
单位：谢端薇 欧汝强 杨宁 王一峰 陈巧儿 叶嘉玲 韦相才(广东省计划生育科研所(510600))；杨日普 黄最 智勇(广州军区广州总医院(510010))
关键词：卵巢早衰；自身免疫；干扰素γ；白细胞介素2；肿瘤坏死因子α
广东医学991105 【摘要】 目的 探讨细胞因子TNF-α，IFN-γ和IL-2与自身免疫性卵巢早衰(POF)发病关系。方法 以ELISA方法测定卵巢早衰患者血清中抗卵巢抗体(AoAb)水平，以免疫放射和放射免疫测定卵巢早衰患者血清中IFN-γ，IL-2和TNF-α的水平。结果 POF组的AoAb明显高于正常对照组，TNF-α和IL-2较低，IFN-γ明显升高，这些细胞因子的水平与AoAb呈高度显著性正相关，相关系数分别为r=0.89，r=0.93,r=0.86(P均<0.01)。结论 细胞因子在自身免疫性卵巢早衰的发生中起着重要作用。
, 百拇医药
Association between premature ovarian failure and TNF-α, IFN-γ or IL-2
Xie Duanwei, Ou Ruqiang, Yang Ning, et al.
Family Planning Research Institute of Guangdong, Guangzhou 510600
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between premature ovarian failure (POF) and cytokines TNF-α, IFN-γ or IL-2.Methods Serum anti-ovarian antibodies (AoAb) in 20 patients with POF were detected by ELISA. Serum IL-2 and IFN-γ level were measured by immunoradio-metric assay (IRMA) and TNF-α measured by radio-immunoassay (RIA), respectively.Results Patients with POF had higher AoAb and IFN-γ level, and lower TNF-α or IL-2 level than normal controls (all P<0.01). A highly significant positive correlation existed between AoAb and TNF-α, IFN-γ or IL-2, with r=0.89 (P<0.01)，r=0.86(P<0.01)， and r=0.93(P<0.01). Conclusion TNF-α, IFN-γ and IL-2 play an important role in autoimmune POF.
, 百拇医药
【Key words】 Premature ovarian failure Autoimmunity IFN-γ IL-2 TNF-α
卵巢早衰(POF)的发病率育龄妇女为1%，病因多种，其中部分患者与自身免疫有关[1]。目前许多研究均是集中在抗卵巢抗体[2]。近年来发现细胞免疫及免疫细胞分泌的细胞因子在POF的发病中作用甚为重要[3，4]，已经有许多关于POF患者淋巴细胞亚群改变的研究[5]，但对细胞因子的研究不够系统。本文以免疫放射测定(IRMA)和放射免疫测定(RIA)方法分别测定POF患者血清中干扰素γ(IFN-γ)\,白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平，探讨这些细胞因子在卵巢早衰患者与正常对照妇女之间的差异，自身免疫性POF患者与非自身免疫性POF患者之间的差异及这些细胞因子在POF发病中的作用。
, 百拇医药 1 材料与方法
1.1 对象和样品的收集 本研究征集20例年龄由27～40岁的妇女，停经至少0.5 a以上，病程最长者10 a，发病年龄最小17岁。3个月内未用过性激素类药物。血清内分泌检查：FSH>40 IU/L,LH>30 IU/L,E2<25 pg/mL,确诊为POF患者。空腹静脉取血，分离血清于-40℃保存。同时征集了20例年龄相仿，月经周期正常，无炎症性疾病及肿瘤的妇女作正常对照组。
1.2 材料 IL-2和IFN-γ采用比利时MEDGENIX公司IRAM试剂盒，TNF-α采用北京东亚免疫技术研究所RIA试剂盒。阳性参考血清由本实验室自制。
1.3 测定方法
1.3.1 卵巢抗原制备 取多份手术契形切除卵巢的正常组织洗净、剪碎，经匀浆和Triton X-100(德国产品)提取后，以亲和层析法提取卵巢抗原。
, 百拇医药
1.3.2 AoAb的检测 以酶联免疫吸附(ELISA)间接法检测血清中的抗卵巢抗体(AoAb)。以每孔2 μg抗原包被微孔板，并以2%BSA封板，加入阳性参考血清和待测血清，洗涤后加入酶标记的第2抗体和底物，在Bio-tek自动酶标仪测定。把阳性参考血清设定为400 u/mL。以正常对照血清AoAb的
±2s为上限，大于上限值判断为阳性。1.3.3 血清IFN-γ，IL-2和TNF-α的测定 严格按照说明书进行操作。本批实验测得的3个试剂盒的批内变异系数分别为2.3%，2.5%和1.9%。
1.4 数据处理及统计分析 结果用几何平均值(
)和标准差(s)表示，并用t检验和u检验进行统计分析，以回归分析法检验TNF-α，IFN-γ和IL-2水平与抗体水平的相关性及细胞因子间的相关性。, 百拇医药
2 结果
2.1 卵巢早衰(POF)患者与正常对照组血清中AoAb水平比较 正常对照组血清中AoAb水平为89.02±43.07 u/mL,POF患者为220.04±91.85 u/mL，两组相比差异有显著性(P<0.001)；POF的血清抗体阳性者AoAb水平为272.52±86.84 u/mL，抗体阴性者抗体水平为136.5±27.52 u/mL，两组比较差异有显著性(P<0.001)。
2.2 POF患者血清中TNF-α，IFN-γ和IL-2的水平 POF患者血清中三种细胞因子的水平与正常生育妇女组比较，差异都有显著性。TNF-α，IL-2明显低于正常对照组，IFN-γ明显高于对照组，结果见表1。
表1 卵巢早衰患者血清中TNF-α，IFN-γ和IL-2的水平 (
±s) 组别, 百拇医药
n
TNF-α(pg/mL)
IFN-γ(IU/mL)
IL-2 (IU/mL)
卵巢早衰组
20
1 260±200
0.81±0.32△
0.10±0.05
正常对照组
20
, 百拇医药
1 610±330
0.42±0.18
0.16±0.10
注：与正常对照组比较P<0.001,△P<0.01
2.3 POF抗体阳性者血清中TNF-α，IFN-γ和IL-2水平与抗体阴性组的结果比较 在POF血清AoAb阳性患者血清中TNF-α，IFN-γ和IL-2三种细胞因子的水平都明显高于AoAb阴性妇女，结果见表2。
表2 POF抗体阳性与阴性患者血清中TNF-α，IFN-γ和IL-2比较 (
±s) 组别n
, 百拇医药
TNF-α(pg/mL)
IFN-γ(IU/mL)
IL-2 (IU/mL)
AoAb阳性组
7
1 486±292
0.96±0.30△
0.12±0.06
AoAb阴性组
13
1 190±460
, 百拇医药
0.37±0.26
0.06±0.05
注：与抗卵巢抗体阴性组比较P<0.05,△P<0.001
2.4 细胞因子水平与抗卵巢抗体水平相关性和细胞因子之间相关性分析 在POF患者血清中，TNF-α，IFN-γ和IL-2水平与抗卵巢抗体的水平有高度显著性正相关，相关系数分别为r=0.89(P<0.01)，r=0.86(P<0.01)，r=0.93(P<0.01)。细胞因子之间也有高度正相关，TNF-α与IFN-γ之间，相关系数r=0.71(P<0.05)，IFN-γ和IL-2之间也是正相关，相关系数r=0.87(P<0.01)。
3 讨论
卵巢早衰(POF)与免疫系统紊乱有密切关系，主要表现在机体免疫系统对卵巢的一种自身免疫反应。Kim等报道，在POF患者血清中可测到AoAb，并有淋巴细胞和浆细胞在卵巢的浸润和淋巴细胞亚群的改变[1]，据Luborsky等报道，POF患者抗卵巢抗体的阳性范围为18%～70%[6]。我们研究发现在20例POF患者血清中AoAb阳性为7例，阳性率为35%，卵巢抗原成分有颗粒细胞、黄体细胞、甾体激素产生细胞、卵细胞和内皮细胞等。由于AoAb作用于这些卵巢的特异性靶细胞引起这些细胞的损伤，使卵泡过度闭锁，从而发生POF及不孕。
, http://www.100md.com
我们研究发现IL-2，IFN-γ和TNF-α在POF患者血清中的水平，与正常组进行比较，TNF-α明显低于对照组，与Naz等[4]测定的结果一致，IL-2也低于正常对照组，这一结果的原因有待进一步研究。但这三种细胞因子的变化都与免疫异常有密切关系，分泌的量与抗卵巢抗体水平有密切关系。抗体阳性患者三种细胞因子分泌的量明显高于相对应的抗体阴性患者组。TNF-α，IFN-γ和IL-2在血清中的水平与抗卵巢抗体效价有高度正相关。细胞因子TNF-α与IFN-γ之间，IFN-γ与IL-2之间也有高度相关，在正常情况下，卵泡从始基卵泡发育至成熟卵泡、排卵或闭锁，细胞因子参与了全过程的调控是通过内分泌、旁分泌和(或)自分泌机制实现的[7]，根据Russell的报道[8]，卵泡闭锁是由IFN-γ开始并激活一系列细胞因子而引起。当机体免疫异常时，卵巢抗原激活CD4 T细胞，使CD4的细胞数量增加或功能增强，因此CD4 T细胞表达和分泌细胞因子(IFN-γ)数量增加，这些细胞因子可直接作用于B细胞，促进B细胞增殖、分化和分泌Ig,也可诱导CTL，NK和LAK等多种杀伤细胞分化和效能，导致卵巢的抗原靶细胞损伤或凋亡(如颗粒细胞、甾体激素产生细胞、黄体细胞和卵细胞)。由于卵巢的过度损伤及凋亡，造成卵泡过度闭锁，排卵障碍，最后发生不育及POF。
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综上所述，部分POF是一种自身免疫性疾病，卵巢抗原可以引起免疫系统产生抗卵巢抗体和免疫细胞及其他细胞产生分泌细胞因子改变，所以，对有自身免疫可能的人，及时进行检查，及时治疗，以防止POF的发生。
*本课题为广东省重点攻关项目(课题号9656)
参考文献
1 Kim JG, Moon SY, Chang YS, et al. Autoimmune premature ovarian failure. J Obstet Gynaecol, 1995, 21(1): 59
2 Wheateroft NJ, Toogood AA, Li TC, et al. Detection of antigens in women with premature ovarian failure. Clin Exp Immunol, 1994, 96:122
, 百拇医药
3 Hoek A, Van KY, De-haan MM, et al. Analysis of peripheral blood lymphocyte subsets, NK cells and delayed type hypersensitivity skin test in patients with premature ovarian failure. Am J Reprod Immunol, 1995, 33(6): 495
4 Naz PK, Thurston D, Santoro N. Circulating tumor necrosis factor (TNF)-alpha in normally cycling women and patients with premature ovarian failure and polycystic ovaries. Am J Reprod Immunol, 1995, 34(3): 170
, 百拇医药 5 杨桂艳，王一理，曹缵孙，等.卵巢早衰患者外周血CD4+Th1/Th2细胞分布研究.生殖医学杂志，1998，7(4)：227
6 Luborsky JL, Visintin I, Boyers S, et al. Ovarian antibodies detected by immunoassy in patient with premature ovarian failure. J Clinic Endocrinol and Metabolism, 1990, 70(1): 69
7 Yamada Y, Saton K. Folliculogenesis and regulating factors. Nippon Rinsho, 1997, 55(11):2822
8 Russell P. The clinicpathological features premature ovarian failure. Verh Dtsch Ges Pathol, 1997, 81:197, http://www.100md.com