河北地区汉族人ACE基因与糖尿病肾病的相关性研究
作者：李 英 张艳玲 丁小颖 于 洁 吴文清 王战建 支忠继 顾连方
单位：
李 英 张艳玲 丁小颖 于 洁 吴文清 王战建 支忠继 顾连方 河北医科大学第三医院内二科，050051
关键词：
中国急救医学991117 糖尿病肾病(DN)是糖尿病的慢性并发症，是糖尿病患者的主要死亡原因之一，其发病机理未完全阐明，许多研究发现，DN的发病有家族聚集性，可能与遗传因素有关[1]。
血管紧张素转换酶(Angiotensin I Converting enzyme，ACE)是肾素-血管紧张素(R-A)系统的关键酶，而机体ACE水平受ACE基因调控，因此国内外学者对ACE基因与DN的关系做了大量研究，但由于种族及生存环境的差异，结果不尽一致。为此，本文通过对河北地区汉簇人ACE基因与DN发病关系的研究，阐明本地区DN发病与ACE基因的相关性，从遗传角度探讨DN的发病机制。
, http://www.100md.com
1 资料与方法
1.1 研究对象
77例IDDM和72例NIDDM选自我院内科住院和门诊患者，均为河北地区汉族人，符合1985年WHO关于IDDM及NIDDM的诊断标准，排除由心、肝及原发肾脏疾病引起蛋白尿者。IDDM组中尿白蛋白排泄率(UAE)>20 μg/min者38例，为DN组，年龄35.9±6.5岁，病程13.9±6.7年，其中男20例，女18例；UAE<20 μg/min者39例，为非DN组，年龄36.1±6.2岁，病程13.6±6.5年，其中男19例，女20例。NIDDM组中，UAE>20 μg/min者40例，为DN组，其中男21例，女19例，年龄62.8±5.6岁，病程12.2±2.4年，UAE<20 μg/min者32例，为非DN组，其中男18例，女14例，年龄62.9±6.1岁，病程12.8±3.1年。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 ACE基因分析
常规酚/氯仿法抽提患者基因DNA，采用Rigat等[2]设计的PCR反应引物，正引物：5′-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3′；负引物：5′-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT-3′(由协和医科大学基础所提供)，D等位基因PCR产物为190 bp，Ⅰ等位基因PCR产物为490 bp，反应体积为25 ul，Taq酶和dNTP为promaga产品。于TC-96 AE型PCK扩增仪上进行扩增反应，首先94℃预变性2分钟，然后30个循环，每个循环94℃变性1分钟，58℃退火2分钟，72℃延伸1.5分钟，最后终末延伸72℃5分钟，反应产物行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，以PBR-322 MSP I DNA为片段长度标志(华美生物工程公司提供)，EB染色，透射式紫外观察台观察结果。
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1.2.2 统计处理
计量资料以
±s表示，组间频率比较用χ2检验，采用poms软件于计算机上完成。
2 结果
经计算，经计算，NIDDM组及IDDM组ACE基因型及等位基因频率符合Hardy-weinberg平衡，具群体代表性。
ACE基因型与IDDM和NIDDM伴DN的关系如表1及表2所示。
表1 糖尿病DN与不伴DN者ACE基因型比较 基因型
IDDM
, 百拇医药 NIDDM
不伴DN
(n=39)
伴DN
(n=38)
不伴DN
(n=32)
伴DN
(n=40)
DD
6
5
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10
DI
10
22
10
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II
23
11
18
8
[注]IDDM组，X2=8.810 P=0.012 P<0.05
NIDDM组，X2=10.154 P=0.006 P<0.01表3 糖尿病伴DN与不伴DN ACE等位基因比较 等位基因
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IDDM
NIDDM
不伴DN
(n=39)
伴DN
(n=38)
不伴DN
(n=32)
伴DN
(n=40)
D
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18
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I
56
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[注]IDDM组，χ2=6.045 P=0.014 P<0.05
NIDDM组，χ2=8.691 P=0.003 P<0.01
结果表明，ACE基因与DN发病有关。
3 讨论
, http://www.100md.com
Hubert等[3]于1991年首先阐明了ACE基因的结构，次年Rigat等[2]报道了ACE基因的PCK扩增方法。
人类ACE基因由26个外显子(EX)和25个内含子(IN)组成，位于17号染色体短臂2区3带。ACE基因的16内含子中插入或缺失一个长度为287 bp的碱基片段，因此ACE基因存在三种基因型，即DD(Deletion)、DI、II(Insertion)，两种等位基因，D、I，人们将这种存在两种以上基因型的现象称基因多态现象。Tiret等于同年对ACE基因与ACF水平的关系做了研究，发现ACE水平的44%受ACE基因调控，DD型ACE水平最高，DI次之，II最低[4]。ACE是R-A系统的关键酶，R-A系统可通过不同机理参与糖尿病血管并发症的发生，因此ACE基因与糖尿病血管并发症的关系受到国内外学者的广泛关注。
Marre等[5]报道了一组IDDM患者中，62例伴DN，62例无DN，发现DN组ACE水平高，Ⅱ型出现频率低，为DN的保护性因素，另有发现，D等位基因是NIDDM发生蛋白尿的危险因素[6]。Sung报道了148例NIDDM患者，70例伴DN，78例无DN，结果表明ACE基因多态性与DN发病无关[7]本研究观察到，无论IDDM还是NIDDM，DN发病与ACE基因I/D多态性均有关联。IDDM组，Ⅱ型在DN组频率著低于非DN组，D等位基因在DN组频率显著高于非DN组，Ⅰ等位基因频率显著低于DN组；NIDDM患者中，DD型及D等位基因在DN组频率显著高于非DN组，Ⅱ型及Ⅰ等位基因频率显著低于非DN组，具统计学意义，说明D等位基因及DD型是DN的危险因素，Ⅰ等位基因及Ⅱ型是DN的保护性因素。与Doi-Y报道相似[8]。关于ACE基因参与DN发病的机制尚未完全阐明，可能是通过调控机体ACE水平间接影响R-A系统，导致肾小球血流动力学改变而致DN。
, 百拇医药
本文发现在河北地区汉族人中ACE基因与DN有明显相关性，为DN的防治提供了区域性科研资料及理论依据。通过对糖尿病患者ACE基因型的检测，可以早期发现DN高危易感人群，给予干预性治疗，防止DN发生或延缓DN进程，降低DN致残率，提高糖尿病患者的生存质量，具有极大社会价值。
基金来源：本课题为河北省科委资助项目(NO 98276193D)
参考文献
[1]Seaquist ER,Goetz FC,Rich S,et al.Familial clustering of diabetic kidney disease,Evidence for genetic susceptibility to diabetic nephropathy.The New England Journal of medicine,1989,320(4):1161-4.
, http://www.100md.com
[2]Rigat B,Hubert C,Corvol P et al.PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene (DCPI) (dipeptidyl carboxypeptidase l),Nucleic Acid Acid Res,1992,20:1433.
[3]Hubert C,Honot A,Corvol P et al,Structure of the angiotensin I converting enzyme gene,J Biol chem,1991,266:15377.
[4]Tiret L,Rigat B,Visvikis S,et al,Evidence,from combined segregation and linkage analysis,That a variant of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels.Am J Hum Genet,1992,51:197-205.
, 百拇医药
[5]Marre M,Bernadet P.Gallois Y,et al,Relationships between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism,plasma levels,and diabetic retinal and renal complications,Diabetes,1994,43(3):384-388.
[6]Ohno T,Kawazu S,Tomono S,et al.Association analyses of the polymorphisms of angiotensin converting enzyme and angiotensinogenes with diabetic nephropathy in Japanese non-insulin-dependent diabeties.Metbolism,1996,45(2):218-222.
[7]Sung-kyu Ha,Jung-kun Seo,Insertion/deletion Polymorphism in ACE gene as a predictor progression of diabetic nephropathy,Kidney Int,1997,60:S-28-S-32.
[8]Doi-Y,Yoshizumi-H,Yoshinari-M,et al.Association between a polymorphism in the angiotensin converting enzyme gene and microvascular complications in Japanese patients with NIDDM,Diabetologia,1996,39(1):97-102.
收稿：1999-05-26
修回：1999-08-20, 百拇医药
单位：
李 英 张艳玲 丁小颖 于 洁 吴文清 王战建 支忠继 顾连方 河北医科大学第三医院内二科，050051
关键词：
中国急救医学991117 糖尿病肾病(DN)是糖尿病的慢性并发症，是糖尿病患者的主要死亡原因之一，其发病机理未完全阐明，许多研究发现，DN的发病有家族聚集性，可能与遗传因素有关[1]。
血管紧张素转换酶(Angiotensin I Converting enzyme，ACE)是肾素-血管紧张素(R-A)系统的关键酶，而机体ACE水平受ACE基因调控，因此国内外学者对ACE基因与DN的关系做了大量研究，但由于种族及生存环境的差异，结果不尽一致。为此，本文通过对河北地区汉簇人ACE基因与DN发病关系的研究，阐明本地区DN发病与ACE基因的相关性，从遗传角度探讨DN的发病机制。
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1 资料与方法
1.1 研究对象
77例IDDM和72例NIDDM选自我院内科住院和门诊患者，均为河北地区汉族人，符合1985年WHO关于IDDM及NIDDM的诊断标准，排除由心、肝及原发肾脏疾病引起蛋白尿者。IDDM组中尿白蛋白排泄率(UAE)>20 μg/min者38例，为DN组，年龄35.9±6.5岁，病程13.9±6.7年，其中男20例，女18例；UAE<20 μg/min者39例，为非DN组，年龄36.1±6.2岁，病程13.6±6.5年，其中男19例，女20例。NIDDM组中，UAE>20 μg/min者40例，为DN组，其中男21例，女19例，年龄62.8±5.6岁，病程12.2±2.4年，UAE<20 μg/min者32例，为非DN组，其中男18例，女14例，年龄62.9±6.1岁，病程12.8±3.1年。
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1.2 方法
1.2.1 ACE基因分析
常规酚/氯仿法抽提患者基因DNA，采用Rigat等[2]设计的PCR反应引物，正引物：5′-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3′；负引物：5′-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT-3′(由协和医科大学基础所提供)，D等位基因PCR产物为190 bp，Ⅰ等位基因PCR产物为490 bp，反应体积为25 ul，Taq酶和dNTP为promaga产品。于TC-96 AE型PCK扩增仪上进行扩增反应，首先94℃预变性2分钟，然后30个循环，每个循环94℃变性1分钟，58℃退火2分钟，72℃延伸1.5分钟，最后终末延伸72℃5分钟，反应产物行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，以PBR-322 MSP I DNA为片段长度标志(华美生物工程公司提供)，EB染色，透射式紫外观察台观察结果。
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1.2.2 统计处理
计量资料以
±s表示，组间频率比较用χ2检验，采用poms软件于计算机上完成。2 结果
经计算，经计算，NIDDM组及IDDM组ACE基因型及等位基因频率符合Hardy-weinberg平衡，具群体代表性。
ACE基因型与IDDM和NIDDM伴DN的关系如表1及表2所示。
表1 糖尿病DN与不伴DN者ACE基因型比较 基因型
IDDM
, 百拇医药 NIDDM
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[注]IDDM组，X2=8.810 P=0.012 P<0.05
NIDDM组，X2=10.154 P=0.006 P<0.01表3 糖尿病伴DN与不伴DN ACE等位基因比较 等位基因
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IDDM
NIDDM
不伴DN
(n=39)
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(n=32)
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[注]IDDM组，χ2=6.045 P=0.014 P<0.05
NIDDM组，χ2=8.691 P=0.003 P<0.01
结果表明，ACE基因与DN发病有关。
3 讨论
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Hubert等[3]于1991年首先阐明了ACE基因的结构，次年Rigat等[2]报道了ACE基因的PCK扩增方法。
人类ACE基因由26个外显子(EX)和25个内含子(IN)组成，位于17号染色体短臂2区3带。ACE基因的16内含子中插入或缺失一个长度为287 bp的碱基片段，因此ACE基因存在三种基因型，即DD(Deletion)、DI、II(Insertion)，两种等位基因，D、I，人们将这种存在两种以上基因型的现象称基因多态现象。Tiret等于同年对ACE基因与ACF水平的关系做了研究，发现ACE水平的44%受ACE基因调控，DD型ACE水平最高，DI次之，II最低[4]。ACE是R-A系统的关键酶，R-A系统可通过不同机理参与糖尿病血管并发症的发生，因此ACE基因与糖尿病血管并发症的关系受到国内外学者的广泛关注。
Marre等[5]报道了一组IDDM患者中，62例伴DN，62例无DN，发现DN组ACE水平高，Ⅱ型出现频率低，为DN的保护性因素，另有发现，D等位基因是NIDDM发生蛋白尿的危险因素[6]。Sung报道了148例NIDDM患者，70例伴DN，78例无DN，结果表明ACE基因多态性与DN发病无关[7]本研究观察到，无论IDDM还是NIDDM，DN发病与ACE基因I/D多态性均有关联。IDDM组，Ⅱ型在DN组频率著低于非DN组，D等位基因在DN组频率显著高于非DN组，Ⅰ等位基因频率显著低于DN组；NIDDM患者中，DD型及D等位基因在DN组频率显著高于非DN组，Ⅱ型及Ⅰ等位基因频率显著低于非DN组，具统计学意义，说明D等位基因及DD型是DN的危险因素，Ⅰ等位基因及Ⅱ型是DN的保护性因素。与Doi-Y报道相似[8]。关于ACE基因参与DN发病的机制尚未完全阐明，可能是通过调控机体ACE水平间接影响R-A系统，导致肾小球血流动力学改变而致DN。
, 百拇医药
本文发现在河北地区汉族人中ACE基因与DN有明显相关性，为DN的防治提供了区域性科研资料及理论依据。通过对糖尿病患者ACE基因型的检测，可以早期发现DN高危易感人群，给予干预性治疗，防止DN发生或延缓DN进程，降低DN致残率，提高糖尿病患者的生存质量，具有极大社会价值。
基金来源：本课题为河北省科委资助项目(NO 98276193D)
参考文献
[1]Seaquist ER,Goetz FC,Rich S,et al.Familial clustering of diabetic kidney disease,Evidence for genetic susceptibility to diabetic nephropathy.The New England Journal of medicine,1989,320(4):1161-4.
, http://www.100md.com
[2]Rigat B,Hubert C,Corvol P et al.PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene (DCPI) (dipeptidyl carboxypeptidase l),Nucleic Acid Acid Res,1992,20:1433.
[3]Hubert C,Honot A,Corvol P et al,Structure of the angiotensin I converting enzyme gene,J Biol chem,1991,266:15377.
[4]Tiret L,Rigat B,Visvikis S,et al,Evidence,from combined segregation and linkage analysis,That a variant of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels.Am J Hum Genet,1992,51:197-205.
, 百拇医药
[5]Marre M,Bernadet P.Gallois Y,et al,Relationships between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism,plasma levels,and diabetic retinal and renal complications,Diabetes,1994,43(3):384-388.
[6]Ohno T,Kawazu S,Tomono S,et al.Association analyses of the polymorphisms of angiotensin converting enzyme and angiotensinogenes with diabetic nephropathy in Japanese non-insulin-dependent diabeties.Metbolism,1996,45(2):218-222.
[7]Sung-kyu Ha,Jung-kun Seo,Insertion/deletion Polymorphism in ACE gene as a predictor progression of diabetic nephropathy,Kidney Int,1997,60:S-28-S-32.
[8]Doi-Y,Yoshizumi-H,Yoshinari-M,et al.Association between a polymorphism in the angiotensin converting enzyme gene and microvascular complications in Japanese patients with NIDDM,Diabetologia,1996,39(1):97-102.
收稿：1999-05-26
修回：1999-08-20, 百拇医药