HCV-1b型NS5A区准种变异与干扰素疗效关系的研究**
作者：孙南雄 张永祥 韩亚平 刘 婷 范晓峰
单位：孙南雄 张永祥 韩亚平 刘 婷：南京医科大学第一附属医院传染病研究室 邮政编码：210029；范晓峰：Health Science Center，School of Medicine，Saint Louis University
关键词：丙型肝炎病毒NS5A 准种变异 干扰素
江苏医药991207 摘要 目的：研究丙型肝炎病毒基因1b(HCV-1b)NS5A区准种变异与干扰素疗效的关系。方法：选取HCV-1b型慢性丙型肝炎患者20例，在干扰素治疗前作NS5A区准种变异等测定，并比较其与干扰素疗效的关系。结果：10例干扰素治疗有效组的单链构象多肽性(SSCP)大部分表现为2带(6例)，少部分为3带(4例)，平均为2.4带；而10例干扰素治疗无效组的SSCP大部分表现为3带(6例)，少部分为4带(4例)，平均为3.4带。两者比较有极显著差异。结论：干扰素的疗效与NS5A准种变异密切相关，有效组准种变异的程度明显低于无效组，即病人治疗前HCV准种变异较少者，HCV病毒易于被清除。采用SSCP检测HCV-NS5A准种变异以预测丙型肝炎干扰素疗效有一定的实用价值。
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丙型肝炎病毒基因1b型(HCV-1b)是我国HCV的主要基因型[1]。一般认为，干扰素治疗HCV-1b患者的有效率远小于10%，而2型和3型则大于40%[2～4]。Le-Guen等[5]采用单链构象多肽性(SSCP)分析法研究HCV-E2/NS1区的准种变异时发现，此区准种变异与干扰素疗效有相关性。我们在研究HCV-1b型NS5A区是否存在“干扰素敏感决定区”[6，7]的过程中，发现HCV-1b型NS5A区的准种变异与干扰素的疗效存在明显的相关性。兹将结果报告如下。
材料和方法
一、病例选择
研究对象为1997年6月至1998年3月随机选取门诊和住院病人共20例。其中干扰素治疗有效组和无效组各10例。20例中，男14例，女6例。年龄21～65岁，平均为36.7±9.27岁。20例患者从输血到干扰素治疗的时间为3～10年，平均为6.3±2.1年。ALT值升高，抗-HCV和HCV RNA均为阳性，HCV病毒基因分型为1b型，同时排除其它肝炎病毒感染。所有标本均在干扰素治疗前静脉采血，当日分离血清，分装至少4份存-70℃备检。冻融的标本不再保存使用。所有病例均使用干扰能治疗，剂量为300万单位，每周三次，疗程为6个月。疗程结束后凡HCV RNA转阴，ALT值转为正常，并维持至停药6个月者视为干扰素治疗有效，否则均视为干扰素治疗无效。
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二、丙型肝炎病毒的基因分型
HCV病毒基因分型按文献报告的方法进行[8]。
三、NS5A区准种变异的检测
以巢式RT-PCR扩增HCV NS5A区6871-7172区段。扩增引物取自GenBank，编号D10750(HCV-J)。其外引物序列为：
Forward：5′-CAGTGCTCACTTCCATGCTCA-3′
Reverse：5′-ACGGATATTTCCCTCTCATCC-3′
内引物序列为：
Forward：5′-ACCCCTCCCACATTACAGCAG-3′
, http://www.100md.com
Reverse：5′-CCGAAGCGGATCGAAAGAGTCCA-3′
以异硫氰酸胍提取HCV RNA，以AMV逆转酶逆转录为cDNA。产物进行两轮扩增。第二轮PCR产物经纯化后，作SSCP检测。检测方法按文献[5]。
四、血清病毒含量的测定
以“终点稀释PCR法”作血清标本含量测定。所有标本用新鲜小牛血清以10-1～10-6倍稀释，用RT-PCR法进行检测。以阳性最高稀释度的负对数作为该份标本的HCV含量。
结果
干扰素治疗有效组的SSCP大部分表现为2带(6例)，少部分为3带(4例)，平均为2.4带；而干扰素治疗无效组的SSCP大部分表现为3带(6例)，少部分为4带(4例)，平均为3.4带。两者比较有极显著差异(P<0.005)。
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上述资料按干扰素疗效分组的比较见附表。
附表 两组HCV-1b型患者有关资料与干扰素疗效的比较
无效组
(10例)
有效组
(10例)
P值
性别(男/女)
9/1
5/5
>0.05
年龄(岁)
, 百拇医药
37.8±7.44
35.6±10.5
>0.05
ALT值(U/L)
161.0±37.9
141.0±40.0
>0.05
病程(年)
6.5±2.1
5.9±1.9
>0.05
治疗前血清病毒含量△
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4.4±0.6
3.4±0.9
<0.05
SSCP条带数
3.4±0.5
2.4±0.5
<0.01
△单位名称：阳性最高稀释度的负对数
讨论
SSCP法是研究HCV准种变异的主要方法。其原理为等长DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈序列特异性的三维构象。由于核酸序列不同而在凝胶电泳中分为多条带，每条带代表一个准种。SSCP法可以测出HCV群体中大于5%以上的准种。我们的研究显示干扰素的疗效与NS5A准种变异密切相关，有效组准种变异明显低于无效组。这说明病人治疗前HCV准种变异较少者，HCV病毒易于被清除。准种变异较多者，由于干扰素和宿主的免疫压力，诱导干扰素不敏感病毒变异株成为优势株，以逃避宿主的免疫攻击。
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NS5A区的准种变异较E2/NS-1区的准种变异更有临床意义。对HCV-1b型NS5A区的研究源于Enomoto等人的工作[6，7]，并提出HCV NS5A区“干扰素敏感决定区”的概念。有学者比较了病人干扰素治疗后NS5A区准种变异与E2/NS-1区的超可变区(HVR-1)准种变异情况，发现干扰素治疗后4～24小时NS5A区即发生了变化，而E2/NS-1区在4周以后才发生变化。故认为NS5A区为干扰素的作用位点，此区准种变异较E2/NS-1区准种变异对干扰素疗效影响更大，是导致干扰素产生耐受性的主要原因[9]。
多数学者认为治疗前血清病毒含量是预测干扰素疗效的可靠指标。限于条件，我们仅作了HCV的半定量分析，结果表明有效组治疗前血清病毒含量明显低于无效组，支持了多数学者的观点。所不同的是在本组资料中，干扰素有效组有2例治疗前血清病毒含量很高，终点稀释倍数达到了无效组的最大终点稀释倍数。我们认为，治疗前血清病毒含量是影响疗效的一个因素，但还有病毒准种变异以及其它因素的影响。对干扰素疗效的预测还应综合判断。
, 百拇医药
采用SSCP检测HCV-NS5A准种变异以预测丙型肝炎干扰素疗效有一定的实用价值。由于我国的HCV以1b型为主[1，2]，而全疗程的干扰素费用可观。SSCP是一种简便有效的鉴定扩增DNA序列变化的技术。其操作简单，用以预测丙型肝炎干扰素的疗效有一定临床实用价值。
江苏省人事厅留学回国人员科研起动资金资助(276IA9606)
参考文献
[1] 孙南雄，等.实用肝脏病杂志 1998；3(1)：58.
[2] 张永祥，等.国外医学流行病学与传染病学分册 1998；25(2)：53.
[3] Chemello L，et al.N Eng J Med 1994；330：143.
, 百拇医药
[4] Martinot-Peignoux M，et al.Hepatology 1995；22：1050.
[5] Le-Guen B，et al.Hepatology 1997；25：1250.
[6] Enomoto E，et al.J Clin Invest 1995；96：224.
[7] Enomoto E，et al.N Eng J Med 1996；334：77.
[8] 孙南雄，等.江苏医药 1999；25(7)：481.
[9] Castera L，et al.Hepatology 1998；26：288A.
(1999年4月5日收稿 同年6月24日修回), 百拇医药
单位：孙南雄 张永祥 韩亚平 刘 婷：南京医科大学第一附属医院传染病研究室 邮政编码：210029；范晓峰：Health Science Center，School of Medicine，Saint Louis University
关键词：丙型肝炎病毒NS5A 准种变异 干扰素
江苏医药991207 摘要 目的：研究丙型肝炎病毒基因1b(HCV-1b)NS5A区准种变异与干扰素疗效的关系。方法：选取HCV-1b型慢性丙型肝炎患者20例，在干扰素治疗前作NS5A区准种变异等测定，并比较其与干扰素疗效的关系。结果：10例干扰素治疗有效组的单链构象多肽性(SSCP)大部分表现为2带(6例)，少部分为3带(4例)，平均为2.4带；而10例干扰素治疗无效组的SSCP大部分表现为3带(6例)，少部分为4带(4例)，平均为3.4带。两者比较有极显著差异。结论：干扰素的疗效与NS5A准种变异密切相关，有效组准种变异的程度明显低于无效组，即病人治疗前HCV准种变异较少者，HCV病毒易于被清除。采用SSCP检测HCV-NS5A准种变异以预测丙型肝炎干扰素疗效有一定的实用价值。
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丙型肝炎病毒基因1b型(HCV-1b)是我国HCV的主要基因型[1]。一般认为，干扰素治疗HCV-1b患者的有效率远小于10%，而2型和3型则大于40%[2～4]。Le-Guen等[5]采用单链构象多肽性(SSCP)分析法研究HCV-E2/NS1区的准种变异时发现，此区准种变异与干扰素疗效有相关性。我们在研究HCV-1b型NS5A区是否存在“干扰素敏感决定区”[6，7]的过程中，发现HCV-1b型NS5A区的准种变异与干扰素的疗效存在明显的相关性。兹将结果报告如下。
材料和方法
一、病例选择
研究对象为1997年6月至1998年3月随机选取门诊和住院病人共20例。其中干扰素治疗有效组和无效组各10例。20例中，男14例，女6例。年龄21～65岁，平均为36.7±9.27岁。20例患者从输血到干扰素治疗的时间为3～10年，平均为6.3±2.1年。ALT值升高，抗-HCV和HCV RNA均为阳性，HCV病毒基因分型为1b型，同时排除其它肝炎病毒感染。所有标本均在干扰素治疗前静脉采血，当日分离血清，分装至少4份存-70℃备检。冻融的标本不再保存使用。所有病例均使用干扰能治疗，剂量为300万单位，每周三次，疗程为6个月。疗程结束后凡HCV RNA转阴，ALT值转为正常，并维持至停药6个月者视为干扰素治疗有效，否则均视为干扰素治疗无效。
, http://www.100md.com
二、丙型肝炎病毒的基因分型
HCV病毒基因分型按文献报告的方法进行[8]。
三、NS5A区准种变异的检测
以巢式RT-PCR扩增HCV NS5A区6871-7172区段。扩增引物取自GenBank，编号D10750(HCV-J)。其外引物序列为：
Forward：5′-CAGTGCTCACTTCCATGCTCA-3′
Reverse：5′-ACGGATATTTCCCTCTCATCC-3′
内引物序列为：
Forward：5′-ACCCCTCCCACATTACAGCAG-3′
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Reverse：5′-CCGAAGCGGATCGAAAGAGTCCA-3′
以异硫氰酸胍提取HCV RNA，以AMV逆转酶逆转录为cDNA。产物进行两轮扩增。第二轮PCR产物经纯化后，作SSCP检测。检测方法按文献[5]。
四、血清病毒含量的测定
以“终点稀释PCR法”作血清标本含量测定。所有标本用新鲜小牛血清以10-1～10-6倍稀释，用RT-PCR法进行检测。以阳性最高稀释度的负对数作为该份标本的HCV含量。
结果
干扰素治疗有效组的SSCP大部分表现为2带(6例)，少部分为3带(4例)，平均为2.4带；而干扰素治疗无效组的SSCP大部分表现为3带(6例)，少部分为4带(4例)，平均为3.4带。两者比较有极显著差异(P<0.005)。
, http://www.100md.com
上述资料按干扰素疗效分组的比较见附表。
附表 两组HCV-1b型患者有关资料与干扰素疗效的比较
无效组
(10例)
有效组
(10例)
P值
性别(男/女)
9/1
5/5
>0.05
年龄(岁)
, 百拇医药
37.8±7.44
35.6±10.5
>0.05
ALT值(U/L)
161.0±37.9
141.0±40.0
>0.05
病程(年)
6.5±2.1
5.9±1.9
>0.05
治疗前血清病毒含量△
, http://www.100md.com
4.4±0.6
3.4±0.9
<0.05
SSCP条带数
3.4±0.5
2.4±0.5
<0.01
△单位名称：阳性最高稀释度的负对数
讨论
SSCP法是研究HCV准种变异的主要方法。其原理为等长DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈序列特异性的三维构象。由于核酸序列不同而在凝胶电泳中分为多条带，每条带代表一个准种。SSCP法可以测出HCV群体中大于5%以上的准种。我们的研究显示干扰素的疗效与NS5A准种变异密切相关，有效组准种变异明显低于无效组。这说明病人治疗前HCV准种变异较少者，HCV病毒易于被清除。准种变异较多者，由于干扰素和宿主的免疫压力，诱导干扰素不敏感病毒变异株成为优势株，以逃避宿主的免疫攻击。
, http://www.100md.com
NS5A区的准种变异较E2/NS-1区的准种变异更有临床意义。对HCV-1b型NS5A区的研究源于Enomoto等人的工作[6，7]，并提出HCV NS5A区“干扰素敏感决定区”的概念。有学者比较了病人干扰素治疗后NS5A区准种变异与E2/NS-1区的超可变区(HVR-1)准种变异情况，发现干扰素治疗后4～24小时NS5A区即发生了变化，而E2/NS-1区在4周以后才发生变化。故认为NS5A区为干扰素的作用位点，此区准种变异较E2/NS-1区准种变异对干扰素疗效影响更大，是导致干扰素产生耐受性的主要原因[9]。
多数学者认为治疗前血清病毒含量是预测干扰素疗效的可靠指标。限于条件，我们仅作了HCV的半定量分析，结果表明有效组治疗前血清病毒含量明显低于无效组，支持了多数学者的观点。所不同的是在本组资料中，干扰素有效组有2例治疗前血清病毒含量很高，终点稀释倍数达到了无效组的最大终点稀释倍数。我们认为，治疗前血清病毒含量是影响疗效的一个因素，但还有病毒准种变异以及其它因素的影响。对干扰素疗效的预测还应综合判断。
, 百拇医药
采用SSCP检测HCV-NS5A准种变异以预测丙型肝炎干扰素疗效有一定的实用价值。由于我国的HCV以1b型为主[1，2]，而全疗程的干扰素费用可观。SSCP是一种简便有效的鉴定扩增DNA序列变化的技术。其操作简单，用以预测丙型肝炎干扰素的疗效有一定临床实用价值。
江苏省人事厅留学回国人员科研起动资金资助(276IA9606)
参考文献
[1] 孙南雄，等.实用肝脏病杂志 1998；3(1)：58.
[2] 张永祥，等.国外医学流行病学与传染病学分册 1998；25(2)：53.
[3] Chemello L，et al.N Eng J Med 1994；330：143.
, 百拇医药
[4] Martinot-Peignoux M，et al.Hepatology 1995；22：1050.
[5] Le-Guen B，et al.Hepatology 1997；25：1250.
[6] Enomoto E，et al.J Clin Invest 1995；96：224.
[7] Enomoto E，et al.N Eng J Med 1996；334：77.
[8] 孙南雄，等.江苏医药 1999；25(7)：481.
[9] Castera L，et al.Hepatology 1998；26：288A.
(1999年4月5日收稿 同年6月24日修回), 百拇医药