细胞周期蛋白D1基因表达与非小细胞肺癌生物学行为的关系
作者：谢宝松 李 强 刘忠令
单位：第二军医大学长海医院呼吸内科，上海，200433
关键词：非小细胞肺癌；细胞周期蛋白类；预后
摘要 目的摘要 目的：探讨非小细胞肺癌中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达与肿瘤生物学行为的关系。方法：采用免疫组织化学EnVision二步法对46例非小细胞肺癌手术标本进行cyclin D1 检测，并结合临床随访资料作结果分析。结果：cyclin D1阳性表达率为54.3 % (25/46)，但与年龄、性别、TNM分期、组织类型及组织学分级均无相关性(P>0.05)；临床随访资料显示，在cyclin D1 基因表达阳性的25 例患者中有10例发生远处转移，而cyclin D1表达阴性的21例中，仅1例发生远处转移，二者差别显著(P<0.05)。进一步分析还发现，随着cyclin D1阳性表达程度的增高，发生转移的机率也增大，表达中度阳性(++)的患者其转移发生率明显高于阴性(-)者(P<0.05)，而表达强阳性(+++)者与阴性(-)者比较，其转移发生率差异非常显著(P<0.01)。结论：非小细胞肺癌cyclin D1过度表达与肿瘤是否发生远处转移有关；检测 cyclin D1的表达有助于判断预后并指导治疗。
, 百拇医药
中图分类号 R 734.207 文章编号：0258-879X(1999)12-0980-03 文献标识码：A
Relation between expression of cyclin D1 and biological behavior in non-small cell lung cancer
Xie Baosong, Li Qiang, Liu Zhongling
(Department of Respiratory Diseases, Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective: To investigate the relationship between expression of cyclin D1 and biological behavior in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods: The cyclin D1 was detected by EnVision immunohistochemical method in 46 primary NSCLC. Results: The overexpression rate of cyclin D1 was 54.3%(25/46). There was no statistical correlation between overexpression of cyclin D1 and age, sex, TNM stage, histologic type and grade of tumors (P>0.05). Tumors metastasized in 10 of 25 primary NSCLC overexpressing cyclin D1, but only in one of 21 cases that cyclin D1 negatively expressed (P<0.05). Further study showed that high metastasis probability was positively correlated with strong cyclin D1 overexpression . Tumors with (++) and (+++) staining for cyclin D1 metastasized more than (-) staining tumors (P<0.05 for ++ vs-; P<0.01 for +++ vs -). Conclusion: Overexpression of cyclin D1 is correlated with metastasis of tumors, the detection of cyclin D1 may help to assess prognosis and guide treatment.
, 百拇医药
KEY WORDS lung cancer，non-small cell; cyclins; prognosis
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 980～982]
细胞周期蛋白D1(cyclin D1)基因是新近发现并被公认的原癌基因，定位于染色体11q13[1],其编码的蛋白产物cyclin D1是细胞进入细胞周期合成的第一个细胞周期蛋白，主要在细胞周期G1→S关卡点中发挥正性调控作用，促进细胞增殖。本实验采用免疫组织化学EnVision二步法对46例非小细胞肺癌患者手术标本进行cyclin D1的检测研究，以探讨cyclin D1基因表达与非小细胞肺癌生物学行为间的关系。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 临床资料 收集我院胸外科1990年1月至1994年6月间经病理证实的原发性非小细胞肺癌手术标本46例(术前未经放、化疗)，术后随访均达5年以上。年龄36～69岁，平均(54.8±9.4)岁，男性38人，女性8人。术后5～26个月共有11例发生远处转移(骨转移4例，脑转移3例，肺转移3例，肝转移1例)，其术前临床分期是ⅠB期3 例，ⅡB期1 例，ⅢA期7 例。
1.2 方法
1.2.1 试剂 即用型cyclin D1单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司(系美国Maxim生物公司产品)。EnVision试剂盒购自Dako公司。
1.2.2 免疫组织化学染色 (1)采用微波抗原修复技术，并按EnVision试剂盒说明书进行操作(EnVision二步法)。以已知的乳腺癌切片为阳性对照，用PBS替代一抗为阴性对照。(2)结果判断：以胞核或胞质呈现清晰的棕黄色为阳性。每例标本随机观察5个高倍视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，取平均值。根据阳性细胞数所占的比例分为：阳性细胞数少于5 %或看不到明显的阳性细胞者为阴性，示为“-”；阳性细胞数在5%～20%为弱阳性，示为“+”；阳性细胞数在 20%～50%为中度阳性，示为“++” ； 阳性细胞数大于50%者为强阳性，示为“+++”。
, 百拇医药
1.3 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
2.1 cyclin D1的表达情况 46例非小细胞肺癌患者，25例(54.3%)cyclin D1表达阳性。表达强阳性者胞核、胞质均有大量棕黄色颗粒分布(图1)。
图1 肺腺癌cyclin D1强阳性的免疫组织化学染色
Fig 1 Strong positive cyclin D1 immunostaining of lung adenocarcinoma (EnVision,×200)
, 百拇医药
A: Cytoplasmic staining；B： Nuclear staining
2.2 cyclin D1表达与临床病理特征之间的关系 cyclin D1过度表达与年龄、性别、组织类型、TNM分期及组织学分级均无显著性相关(表1)。
表1 cyclin D1表达与临床病理指
标的相关性分析
Tab 1 Relative analysis of cyclin D1 expression
and clinical and pathologic characteristics
Clinical and pathologic
, 百拇医药
characteristics
n
Cyclin D1
P value
Positive
Negative
Age(year)
≥50
33
18
15
>0.05
, 百拇医药
<50
13
8
5
Sex
Male
38
19
19
>0.05
Female
8
6
, 百拇医药 2
Histology
Adenocarcinoma
29
15
14
>0.05
Squamous carcinoma
8
6
2
Large cell carcinoma
, 百拇医药 4
2
2
Adenosquamous carcinoma
5
2
3
TNM
T1
8
3
5
>0.05
, http://www.100md.com
T2
33
19
14
T3
4
2
2
T4
1
1
0
N0
, 百拇医药
21
11
10
>0.05
N1
11
4
7
N2
9
7
2
N3
, 百拇医药
5
3
2
Cytoplasmic differentiation
Poorly differentiated
9
4
5
>0.05
Moderate differentiated
20
11
, 百拇医药
9
Well differentiated
17
9
8
2.3 cyclin D1阳性表达与远处转移的相关分析 25例cyclin D1阳性表达的患者，10例发生远处转移，而21例表达阴性的患者只有1例发生远处转移，转移率分别为40.0%和4.8%。表明cyclin D1阳性表达与非小细胞肺癌发生远处转移有显著相关性(P<0.05)。
2.4 cyclin D1阳性表达程度与远处转移的关系 随着cyclin D1阳性表达程度的升高，远处转移发生率也随之增加(表2)。统计学分析显示，表达中度阳性(++)的患者其转移发生率明显高于阴性(-)者(P<0.05)，表达强阳性(+++)者与阴性(-)者比较，其转移发生率差异非常显著(P<0.01)，而表达弱阳性(+)者与阴性(-)者之间的转移发生率无显著差异。可见cyclin D1中度以上阳性表达与非小细胞肺癌的远处转移有密切关系。
, http://www.100md.com
表2 Cyclin D1表达强弱与远处转移的关系
Tab 2 Relationship between the degree of cyclin D1
expression and distant metastasis
cyclin D1
n
M
Non-M
M rate(%)
-
21
, 百拇医药
1
20
4.8
+
8
1
7
12.5
++
10
4
6
40.0*
, 百拇医药 +++
7
5
2
71.4**
M： Metastasis；*P<0.05，**P<0.01 vs negative
3 讨论
哺乳类动物细胞周期中存在多个关卡点(check point) 调节各时相间的转换及细胞周期进程 ，其中以G1→S关卡点最为重要。因为细胞一旦从G1期跨入S期，则可以不再依赖外界信息刺激而很快自动完成分裂过程。而在目前已知的细胞周期蛋白中，cyclin D1是调控这一关卡点最关键的蛋白。cyclin D1可通过结合并激活细胞周期相关激酶CDK4或CDK6，引起底物Rb蛋白磷酸化，磷酸化后的Rb蛋白释放与之结合的转录因子E2F,导致DNA开始合成,促使细胞由G1期进入S期。当cyclin D1过度表达时，G1→S期进程加速，造成细胞增殖失控而导致肿瘤的发生[2]。
, http://www.100md.com
本研究结果， 非小细胞肺癌中cyclin D1阳性表达率为54.3%,与国外报道的 50.0%左右相近[3，4],提示cyclin D1过度表达参与了非小细胞肺癌的发生发展过程。
本研究还首次发现，cyclin D1过度表达与非小细胞肺癌是否发生远处转移显著相关(P<0.05)，而且肿瘤发生远处转移的机率与cyclin D1表达强弱有一定相关性, 即随着阳性表达程度的升高，远处转移发生率也随之增加，提示癌细胞的转移与细胞内基因调控有关。进一步分析还发现，11例术后发生远处转移的患者中有9例cyclin D1表达呈中度以上阳性，其中有3例cyclin D1表达呈强阳性者，其术前TNM分期仅为ⅠB期, 但术后2年内却出现了骨转移、脑转移，这表明如果cyclin D1呈现高表达，即使在肺癌早期，也要高度警惕远处转移的可能；同时也提示，在临床工作中遇到这种病例，术后应给予预防性化疗，以清除可能存在的微转移灶，并应加强随访。而cyclin D1过度表达与非小细胞肺癌的TNM分期、组织类型及组织学分级均无相关，因此cyclin D1表达可做为一项独立的预后指标并用于指导治疗。
, 百拇医药
另外，本研究结果还显示，cyclin D1表达弱阳性(+)者与阴性(-)者之间的转移发生率无显著性差异。究其原因可能有两种：(1)cyclin D1的过度表达存在一个由量变到质变的过程，当其达到一定量时，癌细胞的某些生物学特性才会发生改变；(2)样本量还不够大，影响了分组后的结果观察。其确切机制还有待进一步研究分析。
作者简介：谢宝松，男1970年10月生，硕士生
参考文献
1 Motokura T, Bloom T, Kim HG, et al. A novel cyclin encoded by a bcl-linked candidate oncogene[J]. Nature,1991,350(6318):512
2 Hortwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer[J]. Science, 1994, 266(5192):1821
, 百拇医药
3 Mate JL,Ariza A,Aracil C,et al. Cyclin D1 overexpression in non-small-cell lung carcinoma: correlation with Ki-67 labelling index and poor cytoplasmic differentiation[J]. J Pathol,1996, 180(4):395
4 Betticher DC, Heighway J, Hasleton PS, et al. Prognostic significance of CCND1(cyclin D1) overexpression in primary resected non-small-cell lung cancer[J]. Br J Cancer,1996,73 (3):294
(1999-07-15收稿，1999-10-29修回), http://www.100md.com
单位：第二军医大学长海医院呼吸内科，上海，200433
关键词：非小细胞肺癌；细胞周期蛋白类；预后
摘要 目的摘要 目的：探讨非小细胞肺癌中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达与肿瘤生物学行为的关系。方法：采用免疫组织化学EnVision二步法对46例非小细胞肺癌手术标本进行cyclin D1 检测，并结合临床随访资料作结果分析。结果：cyclin D1阳性表达率为54.3 % (25/46)，但与年龄、性别、TNM分期、组织类型及组织学分级均无相关性(P>0.05)；临床随访资料显示，在cyclin D1 基因表达阳性的25 例患者中有10例发生远处转移，而cyclin D1表达阴性的21例中，仅1例发生远处转移，二者差别显著(P<0.05)。进一步分析还发现，随着cyclin D1阳性表达程度的增高，发生转移的机率也增大，表达中度阳性(++)的患者其转移发生率明显高于阴性(-)者(P<0.05)，而表达强阳性(+++)者与阴性(-)者比较，其转移发生率差异非常显著(P<0.01)。结论：非小细胞肺癌cyclin D1过度表达与肿瘤是否发生远处转移有关；检测 cyclin D1的表达有助于判断预后并指导治疗。
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中图分类号 R 734.207 文章编号：0258-879X(1999)12-0980-03 文献标识码：A
Relation between expression of cyclin D1 and biological behavior in non-small cell lung cancer
Xie Baosong, Li Qiang, Liu Zhongling
(Department of Respiratory Diseases, Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective: To investigate the relationship between expression of cyclin D1 and biological behavior in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods: The cyclin D1 was detected by EnVision immunohistochemical method in 46 primary NSCLC. Results: The overexpression rate of cyclin D1 was 54.3%(25/46). There was no statistical correlation between overexpression of cyclin D1 and age, sex, TNM stage, histologic type and grade of tumors (P>0.05). Tumors metastasized in 10 of 25 primary NSCLC overexpressing cyclin D1, but only in one of 21 cases that cyclin D1 negatively expressed (P<0.05). Further study showed that high metastasis probability was positively correlated with strong cyclin D1 overexpression . Tumors with (++) and (+++) staining for cyclin D1 metastasized more than (-) staining tumors (P<0.05 for ++ vs-; P<0.01 for +++ vs -). Conclusion: Overexpression of cyclin D1 is correlated with metastasis of tumors, the detection of cyclin D1 may help to assess prognosis and guide treatment.
, 百拇医药
KEY WORDS lung cancer，non-small cell; cyclins; prognosis
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 980～982]
细胞周期蛋白D1(cyclin D1)基因是新近发现并被公认的原癌基因，定位于染色体11q13[1],其编码的蛋白产物cyclin D1是细胞进入细胞周期合成的第一个细胞周期蛋白，主要在细胞周期G1→S关卡点中发挥正性调控作用，促进细胞增殖。本实验采用免疫组织化学EnVision二步法对46例非小细胞肺癌患者手术标本进行cyclin D1的检测研究，以探讨cyclin D1基因表达与非小细胞肺癌生物学行为间的关系。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 临床资料 收集我院胸外科1990年1月至1994年6月间经病理证实的原发性非小细胞肺癌手术标本46例(术前未经放、化疗)，术后随访均达5年以上。年龄36～69岁，平均(54.8±9.4)岁，男性38人，女性8人。术后5～26个月共有11例发生远处转移(骨转移4例，脑转移3例，肺转移3例，肝转移1例)，其术前临床分期是ⅠB期3 例，ⅡB期1 例，ⅢA期7 例。
1.2 方法
1.2.1 试剂 即用型cyclin D1单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司(系美国Maxim生物公司产品)。EnVision试剂盒购自Dako公司。
1.2.2 免疫组织化学染色 (1)采用微波抗原修复技术，并按EnVision试剂盒说明书进行操作(EnVision二步法)。以已知的乳腺癌切片为阳性对照，用PBS替代一抗为阴性对照。(2)结果判断：以胞核或胞质呈现清晰的棕黄色为阳性。每例标本随机观察5个高倍视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，取平均值。根据阳性细胞数所占的比例分为：阳性细胞数少于5 %或看不到明显的阳性细胞者为阴性，示为“-”；阳性细胞数在5%～20%为弱阳性，示为“+”；阳性细胞数在 20%～50%为中度阳性，示为“++” ； 阳性细胞数大于50%者为强阳性，示为“+++”。
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1.3 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
2.1 cyclin D1的表达情况 46例非小细胞肺癌患者，25例(54.3%)cyclin D1表达阳性。表达强阳性者胞核、胞质均有大量棕黄色颗粒分布(图1)。
图1 肺腺癌cyclin D1强阳性的免疫组织化学染色
Fig 1 Strong positive cyclin D1 immunostaining of lung adenocarcinoma (EnVision,×200)
, 百拇医药
A: Cytoplasmic staining；B： Nuclear staining
2.2 cyclin D1表达与临床病理特征之间的关系 cyclin D1过度表达与年龄、性别、组织类型、TNM分期及组织学分级均无显著性相关(表1)。
表1 cyclin D1表达与临床病理指
标的相关性分析
Tab 1 Relative analysis of cyclin D1 expression
and clinical and pathologic characteristics
Clinical and pathologic
, 百拇医药
characteristics
n
Cyclin D1
P value
Positive
Negative
Age(year)
≥50
33
18
15
>0.05
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<50
13
8
5
Sex
Male
38
19
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>0.05
Female
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Histology
Adenocarcinoma
29
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Squamous carcinoma
8
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Large cell carcinoma
, 百拇医药 4
2
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Adenosquamous carcinoma
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TNM
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T2
33
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T3
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T4
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21
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>0.05
N1
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2
Cytoplasmic differentiation
Poorly differentiated
9
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>0.05
Moderate differentiated
20
11
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Well differentiated
17
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8
2.3 cyclin D1阳性表达与远处转移的相关分析 25例cyclin D1阳性表达的患者，10例发生远处转移，而21例表达阴性的患者只有1例发生远处转移，转移率分别为40.0%和4.8%。表明cyclin D1阳性表达与非小细胞肺癌发生远处转移有显著相关性(P<0.05)。
2.4 cyclin D1阳性表达程度与远处转移的关系 随着cyclin D1阳性表达程度的升高，远处转移发生率也随之增加(表2)。统计学分析显示，表达中度阳性(++)的患者其转移发生率明显高于阴性(-)者(P<0.05)，表达强阳性(+++)者与阴性(-)者比较，其转移发生率差异非常显著(P<0.01)，而表达弱阳性(+)者与阴性(-)者之间的转移发生率无显著差异。可见cyclin D1中度以上阳性表达与非小细胞肺癌的远处转移有密切关系。
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表2 Cyclin D1表达强弱与远处转移的关系
Tab 2 Relationship between the degree of cyclin D1
expression and distant metastasis
cyclin D1
n
M
Non-M
M rate(%)
-
21
, 百拇医药
1
20
4.8
+
8
1
7
12.5
++
10
4
6
40.0*
, 百拇医药 +++
7
5
2
71.4**
M： Metastasis；*P<0.05，**P<0.01 vs negative
3 讨论
哺乳类动物细胞周期中存在多个关卡点(check point) 调节各时相间的转换及细胞周期进程 ，其中以G1→S关卡点最为重要。因为细胞一旦从G1期跨入S期，则可以不再依赖外界信息刺激而很快自动完成分裂过程。而在目前已知的细胞周期蛋白中，cyclin D1是调控这一关卡点最关键的蛋白。cyclin D1可通过结合并激活细胞周期相关激酶CDK4或CDK6，引起底物Rb蛋白磷酸化，磷酸化后的Rb蛋白释放与之结合的转录因子E2F,导致DNA开始合成,促使细胞由G1期进入S期。当cyclin D1过度表达时，G1→S期进程加速，造成细胞增殖失控而导致肿瘤的发生[2]。
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本研究结果， 非小细胞肺癌中cyclin D1阳性表达率为54.3%,与国外报道的 50.0%左右相近[3，4],提示cyclin D1过度表达参与了非小细胞肺癌的发生发展过程。
本研究还首次发现，cyclin D1过度表达与非小细胞肺癌是否发生远处转移显著相关(P<0.05)，而且肿瘤发生远处转移的机率与cyclin D1表达强弱有一定相关性, 即随着阳性表达程度的升高，远处转移发生率也随之增加，提示癌细胞的转移与细胞内基因调控有关。进一步分析还发现，11例术后发生远处转移的患者中有9例cyclin D1表达呈中度以上阳性，其中有3例cyclin D1表达呈强阳性者，其术前TNM分期仅为ⅠB期, 但术后2年内却出现了骨转移、脑转移，这表明如果cyclin D1呈现高表达，即使在肺癌早期，也要高度警惕远处转移的可能；同时也提示，在临床工作中遇到这种病例，术后应给予预防性化疗，以清除可能存在的微转移灶，并应加强随访。而cyclin D1过度表达与非小细胞肺癌的TNM分期、组织类型及组织学分级均无相关，因此cyclin D1表达可做为一项独立的预后指标并用于指导治疗。
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另外，本研究结果还显示，cyclin D1表达弱阳性(+)者与阴性(-)者之间的转移发生率无显著性差异。究其原因可能有两种：(1)cyclin D1的过度表达存在一个由量变到质变的过程，当其达到一定量时，癌细胞的某些生物学特性才会发生改变；(2)样本量还不够大，影响了分组后的结果观察。其确切机制还有待进一步研究分析。
作者简介：谢宝松，男1970年10月生，硕士生
参考文献
1 Motokura T, Bloom T, Kim HG, et al. A novel cyclin encoded by a bcl-linked candidate oncogene[J]. Nature,1991,350(6318):512
2 Hortwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer[J]. Science, 1994, 266(5192):1821
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3 Mate JL,Ariza A,Aracil C,et al. Cyclin D1 overexpression in non-small-cell lung carcinoma: correlation with Ki-67 labelling index and poor cytoplasmic differentiation[J]. J Pathol,1996, 180(4):395
4 Betticher DC, Heighway J, Hasleton PS, et al. Prognostic significance of CCND1(cyclin D1) overexpression in primary resected non-small-cell lung cancer[J]. Br J Cancer,1996,73 (3):294
(1999-07-15收稿，1999-10-29修回), http://www.100md.com