异种抗体IgM对培养豚鼠心脏微血管内皮细胞的作用*
作者：陈和忠 邹良建 张宝仁 郝家骅 朱家麟
单位：第二军医大学长海医院胸心外科，上海，200433
关键词：抗体；IgM；心脏移植；超急性排斥反应
第二军医大学学报991206 摘要 目的：了解大鼠体内天然抗体IgM在非协调性异种心脏移植超急性排斥反应中的作用。方法：以培养豚鼠心脏微血管内皮细胞为异种心脏移植的细胞实验模型，通过补体结合实验、免疫组化等方法研究大鼠抗体IgM对该细胞的作用，了解异种抗体IgM在异种移植超急性排斥反应中的作用机制。结果：在该模型中，大鼠抗体IgM可与豚鼠心脏微血管内皮细胞结合并能激活补体，产生对该细胞的损伤，而经小鼠抗大鼠IgM处理后的大鼠血清，对豚鼠心脏微血管内皮细胞的损伤作用明显减轻。结论：在该实验模型中，异种天然抗体IgM是激活补体引起超急性排斥反应的重要因素。
中图分类号 R 654.2 文章编号：0258-879X(1999)12-0953-03 文献标识码：A
, http://www.100md.com
Effect of rat xenoreactive antibody IgM on guinea pig cardiac microvascular endothelial cells
Chen Hezhong, Zou Liangjian, Zhang Baoren, Hao Jiahua，Zhu Jialin
(Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai， 200433)
ABSTRACT Objective: To evaluate the role of xenoreactive nature IgM in hyperacute rejection (HAR) in cardiac xenotransplantation model from guinea pig to rat. Methods: The cultured guinea pig cardiac microvascular cells served as experimental model. The effect of xenoreactive nature IgM on HAR was evaluated by immunohistochemical method and complement fixation test. Results: In this model, the IgM of rat serum, a pure rat IgM, was conjugated with the guinea pig cardiac microvascular endothelial cells. That conjugation activated complement and induced toxicity to guinea pig cardiac microvascular endothelial cells. The toxicity of the treated rat serum to the guinea pig cardiac microvascular endothelial cells decreased obviously. Conclusion: In this experimental model, the xenoreactive nature antibody IgM plays an important role in hyperacute rejection.
, 百拇医药
KEY WORDS IgM, antibodies; heart transplantation; hyperacute reaction
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 953～955]
非协调性异种心脏移植(discordant cardiac xenotransplantation)中，天然抗体是引起超急性排斥反应的始动环节[1,2]。在这一过程中，天然抗体中IgM、IgG、IgE及IgA何者起主要作用，尚无定论。本研究用培养豚鼠心脏微血管内皮细胞，建立豚鼠至大鼠非协调性异种心脏移植的细胞实验模型，了解大鼠天然抗体IgM在非协调性异种心脏移植超急性排斥反应中的作用。
1 材料和方法
1.1 动物和主要试剂 雄性豚鼠9只(体质量150～250 g)，雄性SD大鼠10只(体质量250～300 g)，均为第二军医大学实验动物中心提供；大鼠纯品IgM，华美生物工程公司产品；小鼠抗大鼠IgM抗体(mouse anti-rat IgM)，Sigma公司产品；二抗(rabbit anti-mouse IgG)，华美生物工程公司产品。
, 百拇医药
1.2 豚鼠心脏微血管内皮细胞的分离与培养 参照Nishida等[3]方法培养豚鼠的心脏微血管内皮细胞。取豚鼠3只，断头处死，无菌条件下取出心脏，剪除主动脉、肺动脉及心脏表面之大血管，灭活心脏内外膜间皮细胞，将心脏剪切成1 mm3大小组织块，0.1%胶原酶及0.25%胰蛋白酶消化，收集上清，离心，所得沉淀用5%小牛血清悬浮，200目铜网过滤，去除组织残渣，调整细胞数至104～105个/ml，接种于15%胎牛血清培养液中，置CO2培养箱培养，原代细胞8～12 d传代，免疫组织化学法检测Ⅷ因子阳性者鉴定为内皮细胞，鉴定后内皮细胞用于实验。
1.3 培养豚鼠心脏微血管内皮细胞与大鼠IgM结合的观察
1.3.1 实验分组 (1)空白对照组：更换无血清培养液，加入D-Hank液2 ml，孵育3 h；(2)大鼠IgM组：更换无血清培养液，加入100 μg/ml纯品大鼠IgM 2 ml，孵育3 h；(3)大鼠血清组：更换无血清培养液，加入自制大鼠血清2 ml，孵育3 h；(4)处理后大鼠血清组：更换无血清培养液，加入小鼠抗大鼠IgM处理大鼠血清2 ml，孵育3 h。
, 百拇医药
1.3.2 培养豚鼠心脏微血管内皮细胞与大鼠IgM的结合 采用免疫组织化学ABC法[4]检测。
1.4 大鼠IgM对培养豚鼠心脏微血管内皮细胞毒性的观察
1.4.1 实验分组 (1)空白对照组：更换无血清培养液，加入D-Hank液2 ml，补体2 U，孵育2 h；(2)大鼠IgM组：更换无血清培养液，加入纯品IgM 2 ml，补体2 U，孵育2 h；(3)大鼠血清组：更换无血清培养液，加入大鼠血清2 ml，补体2 U，孵育2 h；(4)处理后大鼠血清组：更换无血清培养液，加入小鼠抗大鼠IgM处理后血清2 ml，补体2 U，孵育2 h。
1.4.2 豚鼠心脏微血管内皮细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的测定 培养豚鼠心脏微血管内皮细胞经过上述各组处理后，分别在孵育0，15，30，45 min及1，2 h时取培养液50 μl，用生化比色法[5]测定其LDH活性。
, 百拇医药
1.4.3 豚鼠心脏微血管内皮细胞锥虫蓝摄取率的测定 上述各组细胞处理后，分别用0.25%胰蛋白酶消化(37℃，5 min)，将贴壁生长的豚鼠心脏微血管内皮细胞分离下来，制成细胞悬液，以0.4%锥虫蓝1∶9染色，按白细胞计数法计数蓝染细胞。
1.5 统计学方法 实验数据均以
±s表示，显著性检验采用非配对资料t检验， P<0.05为有显著差异性界限。
2 结果
2.1 大鼠抗体IgM同豚鼠心脏微血管内皮细胞的结合 无论是纯品大鼠IgM或大鼠血清加入培养豚鼠心脏微血管内皮细胞孵化培养，与对照组相比较，免疫组织化学染色均呈阳性(图1，图见封三)，对照组及小鼠抗大鼠IgM处理大鼠血清组免疫组化结果为阴性。
, 百拇医药
图1 各实验级免疫组化结果(×200)
Fig1 The results of immunohistochemistry in different groups(×200)
2.2 大鼠抗体IgM对豚鼠心脏微血管内皮细胞的毒性作用
2.2.1 各处理组培养液中LDH的活性改变 结果显示：纯品大鼠IgM及大鼠血清组LDH明显上升，且以作用后15与30 min上升较高，1 h，2 h未出现再度升高；而经小鼠抗大鼠IgM处理后的大鼠血清组及对照组的LDH水平无明显变化(表1)。说明前两者对豚鼠心脏微血管内皮细胞有明显的损伤作用，而后两者对豚鼠心脏微血管内皮细胞则无明显损伤作用。
表1 不同时段内皮细胞培养液中LDH水平
Tab 1 The LDH level of endothelial cell cultured
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fluid at different time
(n=6,±s，z/U.L-1) Group
Incubative time
15 min
30 min
45 min
1 h
2 h
A
2.2±0.5
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2.7±0.7
3.1±1.2
3.2±1.1
2.8±1.1
B
6.9±2.3*
8.3±3.1*
7.4±2.7*
8.2±3.9*
8.7±4.1*
C
, 百拇医药
5.3±1.8*
6.9±2.5*
8.4±2.8*
8.1±3.1*
8.9±4.3*
D
1.9±0.6
2.7±1.2
3.4±1.1
2.8±1.3
3.1±1.6
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A：Control; B:Pure IgM; C: Rat serum; D: Treated serum；
*P<0.05 vs group A
2.2.2 各处理组豚鼠心脏微血管内皮细胞对锥虫蓝摄取率的变化 豚鼠心脏微血管内皮细胞正常培养时锥虫蓝摄取率为(2.3±1.1)%，于培养豚鼠心脏微血管内皮细胞中加入纯品IgM、大鼠血清及经小鼠抗大鼠IgM处理后大鼠血清，再加入补体，豚鼠心脏微血管内皮细胞对锥虫蓝摄取率分别为(15.7±4.8)%、(14.5±3.4)%及(3.7±1.3)%。结果表明，纯品IgM及大鼠血清对豚鼠心脏微血管内皮细胞有明显的损伤作用，而经过小鼠抗大鼠IgM处理后血清对豚鼠心脏微血管内皮细胞损伤作用则明显减轻。
3 讨论
细胞培养技术已被广泛用作异种移植的实验研究模型，将微血管内皮细胞用作异种心脏移植的实验研究尚未见报道。既往文献报道[6～9]用作异种移植实验研究的细胞多取材于主动脉内皮细胞，但异种移植超急性排斥反应(HAR)的病理变化多发生在供体器官的微血管内，可见供体器官微血管的内皮细胞是异种抗体或补体的直接作用部位；加之，大血管内皮细胞同微血管内皮细胞有许多不同生理特性[10]，故我们认为用培养心脏微血管内皮细胞来作为异种移植的研究模型，能更为直接地反映异种心脏移植超急性排斥反应的机制。
, 百拇医药
本实验将纯品大鼠抗体IgM及大鼠血清加入培养的豚鼠心脏微血管内皮细胞后，免疫组化染色可以观察到IgM同豚鼠心脏微血管内皮细胞的结合，说明在豚鼠至大鼠的异种移植模型中，大鼠体内存在有抗豚鼠心脏微血管内皮细胞的抗体IgM。进一步实验表明该种结合可以激活补体，产生对豚鼠心脏微血管内皮细胞的损伤，而利用小鼠抗大鼠IgM处理后的大鼠血清，对豚鼠心脏微血管内皮细胞的损伤作用明显减轻，提示：在异种心脏移植超急性排斥反应的细胞培养实验模型中，天然抗体IgM是激活补体引起HAR的重要因素。血清中除去IgM后，即可清除血清对豚鼠心脏微血管内皮细胞的损害，说明血清中IgM以外的因素在该实验模型中未能引起补体的激活，即在该模型中，血清中除抗体IgM以外的因素未发现有诱导产生HAR的能力。
*国家自然科学基金资助项目，批准号，39400130
作者简介：陈和忠，男，1965年11月生，博士，主治医师
参考文献
, 百拇医药
1 Auchincloss H. Xenogeneic transplantation[J].Transplantation， 1988，45(1):1
2 Platt JL, Vercellotti GM, Salmasso AP, et al. Transplantation of discordant xenografts: a review of progress[J]. Immunol Today， 1990， 11(12):450
3 Nishida M, Carley WW, Gerritsen ME, et al. Isolation and characterization of human and rat cardiac microvascular endothelial cells[J]. Am J Physiol，1993，264(2): H639
4 倪灿荣，王 江. 亲合免疫细胞组织化学技术.见：倪灿荣主编. 免疫组织化学实验新技术及应用[M]. 北京: 北京科学技术出版社, 1993.128～129
, 百拇医药
5 李建武. 生物化学实验原理和方法[M]. 北京: 北京大学出版社， 1994.115～117
6 Soares M, Lu XS, Havaux， et al. In vivo IgM depletion by anti-monoclonal antibody therapy——the role of IgM in hyperacute vascular rejection of discordant xenografts[J]. Transplantation, 1994,57(6):1003
7 Gambiez L, Salame E, Chereau C, et al. The role of natural IgM in the hyperacute rejection of discordant heart xenografts[J]. Transplantation， 1992， 54(4): 577
, 百拇医药
8 Xu H, Oluwole SF, Edwards NM, et al. In vitro evaluation of neonatal human immunity against pig[J]. J Thorac Cardiovasc Surg， 1996， 111(5): 920
9 Xu H, Edwards NM, Chen JM, et al. Age-related development of human anti-pig xenoantibody[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1995, 110(4): 1023
10 盛民立. 血管内皮细胞与疾病[M]. 上海: 上海医科大学出版社， 1993.15～16
(1999-05-17收稿，1999-10-25修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院胸心外科，上海，200433
关键词：抗体；IgM；心脏移植；超急性排斥反应
第二军医大学学报991206 摘要 目的：了解大鼠体内天然抗体IgM在非协调性异种心脏移植超急性排斥反应中的作用。方法：以培养豚鼠心脏微血管内皮细胞为异种心脏移植的细胞实验模型，通过补体结合实验、免疫组化等方法研究大鼠抗体IgM对该细胞的作用，了解异种抗体IgM在异种移植超急性排斥反应中的作用机制。结果：在该模型中，大鼠抗体IgM可与豚鼠心脏微血管内皮细胞结合并能激活补体，产生对该细胞的损伤，而经小鼠抗大鼠IgM处理后的大鼠血清，对豚鼠心脏微血管内皮细胞的损伤作用明显减轻。结论：在该实验模型中，异种天然抗体IgM是激活补体引起超急性排斥反应的重要因素。
中图分类号 R 654.2 文章编号：0258-879X(1999)12-0953-03 文献标识码：A
, http://www.100md.com
Effect of rat xenoreactive antibody IgM on guinea pig cardiac microvascular endothelial cells
Chen Hezhong, Zou Liangjian, Zhang Baoren, Hao Jiahua，Zhu Jialin
(Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai， 200433)
ABSTRACT Objective: To evaluate the role of xenoreactive nature IgM in hyperacute rejection (HAR) in cardiac xenotransplantation model from guinea pig to rat. Methods: The cultured guinea pig cardiac microvascular cells served as experimental model. The effect of xenoreactive nature IgM on HAR was evaluated by immunohistochemical method and complement fixation test. Results: In this model, the IgM of rat serum, a pure rat IgM, was conjugated with the guinea pig cardiac microvascular endothelial cells. That conjugation activated complement and induced toxicity to guinea pig cardiac microvascular endothelial cells. The toxicity of the treated rat serum to the guinea pig cardiac microvascular endothelial cells decreased obviously. Conclusion: In this experimental model, the xenoreactive nature antibody IgM plays an important role in hyperacute rejection.
, 百拇医药
KEY WORDS IgM, antibodies; heart transplantation; hyperacute reaction
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 953～955]
非协调性异种心脏移植(discordant cardiac xenotransplantation)中，天然抗体是引起超急性排斥反应的始动环节[1,2]。在这一过程中，天然抗体中IgM、IgG、IgE及IgA何者起主要作用，尚无定论。本研究用培养豚鼠心脏微血管内皮细胞，建立豚鼠至大鼠非协调性异种心脏移植的细胞实验模型，了解大鼠天然抗体IgM在非协调性异种心脏移植超急性排斥反应中的作用。
1 材料和方法
1.1 动物和主要试剂 雄性豚鼠9只(体质量150～250 g)，雄性SD大鼠10只(体质量250～300 g)，均为第二军医大学实验动物中心提供；大鼠纯品IgM，华美生物工程公司产品；小鼠抗大鼠IgM抗体(mouse anti-rat IgM)，Sigma公司产品；二抗(rabbit anti-mouse IgG)，华美生物工程公司产品。
, 百拇医药
1.2 豚鼠心脏微血管内皮细胞的分离与培养 参照Nishida等[3]方法培养豚鼠的心脏微血管内皮细胞。取豚鼠3只，断头处死，无菌条件下取出心脏，剪除主动脉、肺动脉及心脏表面之大血管，灭活心脏内外膜间皮细胞，将心脏剪切成1 mm3大小组织块，0.1%胶原酶及0.25%胰蛋白酶消化，收集上清，离心，所得沉淀用5%小牛血清悬浮，200目铜网过滤，去除组织残渣，调整细胞数至104～105个/ml，接种于15%胎牛血清培养液中，置CO2培养箱培养，原代细胞8～12 d传代，免疫组织化学法检测Ⅷ因子阳性者鉴定为内皮细胞，鉴定后内皮细胞用于实验。
1.3 培养豚鼠心脏微血管内皮细胞与大鼠IgM结合的观察
1.3.1 实验分组 (1)空白对照组：更换无血清培养液，加入D-Hank液2 ml，孵育3 h；(2)大鼠IgM组：更换无血清培养液，加入100 μg/ml纯品大鼠IgM 2 ml，孵育3 h；(3)大鼠血清组：更换无血清培养液，加入自制大鼠血清2 ml，孵育3 h；(4)处理后大鼠血清组：更换无血清培养液，加入小鼠抗大鼠IgM处理大鼠血清2 ml，孵育3 h。
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1.3.2 培养豚鼠心脏微血管内皮细胞与大鼠IgM的结合 采用免疫组织化学ABC法[4]检测。
1.4 大鼠IgM对培养豚鼠心脏微血管内皮细胞毒性的观察
1.4.1 实验分组 (1)空白对照组：更换无血清培养液，加入D-Hank液2 ml，补体2 U，孵育2 h；(2)大鼠IgM组：更换无血清培养液，加入纯品IgM 2 ml，补体2 U，孵育2 h；(3)大鼠血清组：更换无血清培养液，加入大鼠血清2 ml，补体2 U，孵育2 h；(4)处理后大鼠血清组：更换无血清培养液，加入小鼠抗大鼠IgM处理后血清2 ml，补体2 U，孵育2 h。
1.4.2 豚鼠心脏微血管内皮细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的测定 培养豚鼠心脏微血管内皮细胞经过上述各组处理后，分别在孵育0，15，30，45 min及1，2 h时取培养液50 μl，用生化比色法[5]测定其LDH活性。
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1.4.3 豚鼠心脏微血管内皮细胞锥虫蓝摄取率的测定 上述各组细胞处理后，分别用0.25%胰蛋白酶消化(37℃，5 min)，将贴壁生长的豚鼠心脏微血管内皮细胞分离下来，制成细胞悬液，以0.4%锥虫蓝1∶9染色，按白细胞计数法计数蓝染细胞。
1.5 统计学方法 实验数据均以
±s表示，显著性检验采用非配对资料t检验， P<0.05为有显著差异性界限。2 结果
2.1 大鼠抗体IgM同豚鼠心脏微血管内皮细胞的结合 无论是纯品大鼠IgM或大鼠血清加入培养豚鼠心脏微血管内皮细胞孵化培养，与对照组相比较，免疫组织化学染色均呈阳性(图1，图见封三)，对照组及小鼠抗大鼠IgM处理大鼠血清组免疫组化结果为阴性。
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图1 各实验级免疫组化结果(×200)
Fig1 The results of immunohistochemistry in different groups(×200)
2.2 大鼠抗体IgM对豚鼠心脏微血管内皮细胞的毒性作用
2.2.1 各处理组培养液中LDH的活性改变 结果显示：纯品大鼠IgM及大鼠血清组LDH明显上升，且以作用后15与30 min上升较高，1 h，2 h未出现再度升高；而经小鼠抗大鼠IgM处理后的大鼠血清组及对照组的LDH水平无明显变化(表1)。说明前两者对豚鼠心脏微血管内皮细胞有明显的损伤作用，而后两者对豚鼠心脏微血管内皮细胞则无明显损伤作用。
表1 不同时段内皮细胞培养液中LDH水平
Tab 1 The LDH level of endothelial cell cultured
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fluid at different time
(n=6,
±s，z/U.L-1) GroupIncubative time
15 min
30 min
45 min
1 h
2 h
A
2.2±0.5
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2.7±0.7
3.1±1.2
3.2±1.1
2.8±1.1
B
6.9±2.3*
8.3±3.1*
7.4±2.7*
8.2±3.9*
8.7±4.1*
C
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5.3±1.8*
6.9±2.5*
8.4±2.8*
8.1±3.1*
8.9±4.3*
D
1.9±0.6
2.7±1.2
3.4±1.1
2.8±1.3
3.1±1.6
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A：Control; B:Pure IgM; C: Rat serum; D: Treated serum；
*P<0.05 vs group A
2.2.2 各处理组豚鼠心脏微血管内皮细胞对锥虫蓝摄取率的变化 豚鼠心脏微血管内皮细胞正常培养时锥虫蓝摄取率为(2.3±1.1)%，于培养豚鼠心脏微血管内皮细胞中加入纯品IgM、大鼠血清及经小鼠抗大鼠IgM处理后大鼠血清，再加入补体，豚鼠心脏微血管内皮细胞对锥虫蓝摄取率分别为(15.7±4.8)%、(14.5±3.4)%及(3.7±1.3)%。结果表明，纯品IgM及大鼠血清对豚鼠心脏微血管内皮细胞有明显的损伤作用，而经过小鼠抗大鼠IgM处理后血清对豚鼠心脏微血管内皮细胞损伤作用则明显减轻。
3 讨论
细胞培养技术已被广泛用作异种移植的实验研究模型，将微血管内皮细胞用作异种心脏移植的实验研究尚未见报道。既往文献报道[6～9]用作异种移植实验研究的细胞多取材于主动脉内皮细胞，但异种移植超急性排斥反应(HAR)的病理变化多发生在供体器官的微血管内，可见供体器官微血管的内皮细胞是异种抗体或补体的直接作用部位；加之，大血管内皮细胞同微血管内皮细胞有许多不同生理特性[10]，故我们认为用培养心脏微血管内皮细胞来作为异种移植的研究模型，能更为直接地反映异种心脏移植超急性排斥反应的机制。
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本实验将纯品大鼠抗体IgM及大鼠血清加入培养的豚鼠心脏微血管内皮细胞后，免疫组化染色可以观察到IgM同豚鼠心脏微血管内皮细胞的结合，说明在豚鼠至大鼠的异种移植模型中，大鼠体内存在有抗豚鼠心脏微血管内皮细胞的抗体IgM。进一步实验表明该种结合可以激活补体，产生对豚鼠心脏微血管内皮细胞的损伤，而利用小鼠抗大鼠IgM处理后的大鼠血清，对豚鼠心脏微血管内皮细胞的损伤作用明显减轻，提示：在异种心脏移植超急性排斥反应的细胞培养实验模型中，天然抗体IgM是激活补体引起HAR的重要因素。血清中除去IgM后，即可清除血清对豚鼠心脏微血管内皮细胞的损害，说明血清中IgM以外的因素在该实验模型中未能引起补体的激活，即在该模型中，血清中除抗体IgM以外的因素未发现有诱导产生HAR的能力。
*国家自然科学基金资助项目，批准号，39400130
作者简介：陈和忠，男，1965年11月生，博士，主治医师
参考文献
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1 Auchincloss H. Xenogeneic transplantation[J].Transplantation， 1988，45(1):1
2 Platt JL, Vercellotti GM, Salmasso AP, et al. Transplantation of discordant xenografts: a review of progress[J]. Immunol Today， 1990， 11(12):450
3 Nishida M, Carley WW, Gerritsen ME, et al. Isolation and characterization of human and rat cardiac microvascular endothelial cells[J]. Am J Physiol，1993，264(2): H639
4 倪灿荣，王 江. 亲合免疫细胞组织化学技术.见：倪灿荣主编. 免疫组织化学实验新技术及应用[M]. 北京: 北京科学技术出版社, 1993.128～129
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5 李建武. 生物化学实验原理和方法[M]. 北京: 北京大学出版社， 1994.115～117
6 Soares M, Lu XS, Havaux， et al. In vivo IgM depletion by anti-monoclonal antibody therapy——the role of IgM in hyperacute vascular rejection of discordant xenografts[J]. Transplantation, 1994,57(6):1003
7 Gambiez L, Salame E, Chereau C, et al. The role of natural IgM in the hyperacute rejection of discordant heart xenografts[J]. Transplantation， 1992， 54(4): 577
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8 Xu H, Oluwole SF, Edwards NM, et al. In vitro evaluation of neonatal human immunity against pig[J]. J Thorac Cardiovasc Surg， 1996， 111(5): 920
9 Xu H, Edwards NM, Chen JM, et al. Age-related development of human anti-pig xenoantibody[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1995, 110(4): 1023
10 盛民立. 血管内皮细胞与疾病[M]. 上海: 上海医科大学出版社， 1993.15～16
(1999-05-17收稿，1999-10-25修回), 百拇医药