动脉粥样硬化兔主动脉内皮素A受体原位杂交研究*
作者：荆 清 张国元 秦永文 吴宗贵
单位：第二军医大学长海医院心血管内科，上海，200433；张国元 吴宗贵 第二军医大学长征医院心血管内科
关键词：受体；内皮素；动脉粥样硬化；原位杂交
第二军医大学学报991235 对动脉粥样硬化(AS)的发生机制研究是一个重要的前沿课题，尤其在内皮细胞损伤和内皮功能紊乱、脂质的异常代谢以及生长因子、细胞因子和血管活性因子的作用等方面目前又成为倍受关注的热点[1～3]。本实验通过建立兔AS模型，观察主动脉的内皮素受体A亚型(ETRA)表达改变，并初步探讨ETRA与疾病严重程度的关系。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 胆固醇(荷兰进口分析纯)；鸡蛋黄干粉(上海沪南蛋品公司)；ETRA cDNA探针(美国红十字Winkles博士提供)；血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测试剂盒(上海名典生物工程公司)；oxLDL试剂盒(上海荣盛生物试剂厂)。
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1.2 AS动物模型建立 健康雄性新西兰兔18只，分3组(n=6)，1组为对照组，另2组分别喂以高脂饲料(含2%胆固醇、10%蛋黄粉、6%猪油)4和8周。
1.3 DIG-RNA探针标记(体外转录法) 采用宝灵曼公司DIG RNA标记试剂盒，按所附说明书步骤进行。
1.4 组织原位杂交 主动脉标本离体后，立即在4%多聚甲醛和0.3%饱和苦味酸混合液中固定6～12 h，浸入20%蔗糖PBS至组织块下沉。冰冻切片机切片，厚30 μm，继续后固定4～6 h。切片经预处理，置杂交液(含DIG标记探针500 ng/ml)中，43℃温育12～16 h。漂洗后加入抗DIG-AP抗体(1∶1 000稀释)，室温4 h。漂洗后入NBT-BCIP显色液室温显色3 h。PBS冲洗后，依次乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
1.5 统计学处理 数据用
±s表示，采用方差分析，SNK法两两比较。
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2 结果
2.1 形态学的改变 仅需单纯给家兔喂饲含有高胆固醇高脂肪的饲料，4周时主动脉内膜表面可见少量乳白色脂质条纹形成，显微镜下可见内膜表面不光滑，内膜下有少量的泡沫细胞和脂质沉积，表明形成了高脂血症和早期的AS病变；8周时主动脉管腔缩小，内膜可见大小不等的乳白色斑块，部分可融合成较大的斑块。显微镜下可见斑块中大量泡沫细胞形成和脂质沉积，并可见破裂的斑块。表明形成了典型的AS模型。
2.2 血清脂质浓度的变化 正常对照组兔血清外观清亮，高脂4周组及高脂8周组兔血清呈不同程度乳白色浑浊。各组兔血清脂质变化见表1，经方差分析，各组的TC、TG、LDL-C和oxLDL水平均具有显著差异(P<0.01)。两两比较显示，高脂4周组及高脂8周组TC、TG、LDL-C及oxLDL水平均较对照组明显升高(P<0.01)；高脂8周组TC、LDL-C、TG水平均较高脂4周组升高(分别P<0.01、P<0.05)；对照组、高脂4周组、高脂8周组各组间HDL-C水平差异无统计学意义(P>0.05)。
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表1 高脂家兔血清脂质水平
(n=6,±s) 组别
TC(cB/mmol.L-1)
TG
(cB/mmol.L-1)
HDL-C
(cB/mmol.L-1)
LDL-C
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(cB/mmol.L-1)
oxLDL
(ρB/mg.L-1)
对照组
2.61±0.59
0.79±0.61
0.83±0.53
0.89±0.42
0.30±0.12
高脂4周组
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8.77±1.26**
2.57±0.75**
1.03±0.86
7.16±0.94**
0.65±0.25**
高脂8周组
22.9±1.82**△△
3.89±1.23**△
1.31±0.77
15.7±1.25**△△
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0.77±0.32**
**P<0.01 与对照组比较; △P<0.05, △△P<0.01 与高脂4周组比较
2.3 原位杂交 光镜下可见正常兔主动脉ETRA mRNA表达水平很低，高脂4周组兔主动脉粥样硬化斑块中ETRA mRNA表达水平升高，高脂8周组的表达水平更高(图1)。
图1 高脂4周(A)、8周(B)兔主动脉AS斑块ETRA表达(×400)
3 讨论
Winkles等[4]的临床研究发现，在人颈动脉粥样硬化斑块组织的匀浆中有ET-1和ETRA、ETRB mRNA的表达，但未能明确其与病变严重程度之间的关系。本研究通过对兔主动脉粥样硬化斑块的ETRA mRNA进行原位杂交检测，结果表明正常兔主动脉ETRA mRNA表达水平较低，在主动脉粥样硬化斑块中ETRA mRNA表达水平有所升高，并且粥样硬化病变程度越严重，ETRA mRNA表达水平就越高；在有斑块破裂出血的部位，ETRA mRNA表达水平最高。本研究结果提示，随着AS病变的加重，斑块中ETRA mRNA表达水平也进一步升高，提示AS形成中有ETRA的参与，ETRA的基因表达水平在一定程度上与病变严重性相一致。
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目，批准号39600063
中图分类号 R 543.12 文章编号：0258-879X(1999)12-1038-02 文献标识码：B
作者简介：荆清，男，1965年11月生，博士，主治医师
参考文献
1 Roberts R. Molecular basis of cardiology[M]. Cambridge: Blackwell Scientific Publications, 1993.415～430
2 Lerman A, Holmes DR Jr, Bell MR, et al. Endothelin in coronary endothelial dysfunction and early atherosclerosis in humans[J]. Circulation, 1995, 92(9): 2426
, 百拇医药
3 Zeiher AM, Ihling C, Pistorius K, et al. Increased tissue endothelin immunoreactivity in atherosclerotic lesions associated with acute coronary syndromes[J]. Lancet, 1994, 344(8934): 1405
4 Winkles JA, Alberts GF, Brogi E, et al. Endothelin-1 and endothelin receptor mRNA expression in normal and atherosclerotic human arteries[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1993,191(3):1081
(1999-08-19收稿，1999-10-18修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院心血管内科，上海，200433；张国元 吴宗贵 第二军医大学长征医院心血管内科
关键词：受体；内皮素；动脉粥样硬化；原位杂交
第二军医大学学报991235 对动脉粥样硬化(AS)的发生机制研究是一个重要的前沿课题，尤其在内皮细胞损伤和内皮功能紊乱、脂质的异常代谢以及生长因子、细胞因子和血管活性因子的作用等方面目前又成为倍受关注的热点[1～3]。本实验通过建立兔AS模型，观察主动脉的内皮素受体A亚型(ETRA)表达改变，并初步探讨ETRA与疾病严重程度的关系。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 胆固醇(荷兰进口分析纯)；鸡蛋黄干粉(上海沪南蛋品公司)；ETRA cDNA探针(美国红十字Winkles博士提供)；血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测试剂盒(上海名典生物工程公司)；oxLDL试剂盒(上海荣盛生物试剂厂)。
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1.2 AS动物模型建立 健康雄性新西兰兔18只，分3组(n=6)，1组为对照组，另2组分别喂以高脂饲料(含2%胆固醇、10%蛋黄粉、6%猪油)4和8周。
1.3 DIG-RNA探针标记(体外转录法) 采用宝灵曼公司DIG RNA标记试剂盒，按所附说明书步骤进行。
1.4 组织原位杂交 主动脉标本离体后，立即在4%多聚甲醛和0.3%饱和苦味酸混合液中固定6～12 h，浸入20%蔗糖PBS至组织块下沉。冰冻切片机切片，厚30 μm，继续后固定4～6 h。切片经预处理，置杂交液(含DIG标记探针500 ng/ml)中，43℃温育12～16 h。漂洗后加入抗DIG-AP抗体(1∶1 000稀释)，室温4 h。漂洗后入NBT-BCIP显色液室温显色3 h。PBS冲洗后，依次乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
1.5 统计学处理 数据用
±s表示，采用方差分析，SNK法两两比较。, 百拇医药
2 结果
2.1 形态学的改变 仅需单纯给家兔喂饲含有高胆固醇高脂肪的饲料，4周时主动脉内膜表面可见少量乳白色脂质条纹形成，显微镜下可见内膜表面不光滑，内膜下有少量的泡沫细胞和脂质沉积，表明形成了高脂血症和早期的AS病变；8周时主动脉管腔缩小，内膜可见大小不等的乳白色斑块，部分可融合成较大的斑块。显微镜下可见斑块中大量泡沫细胞形成和脂质沉积，并可见破裂的斑块。表明形成了典型的AS模型。
2.2 血清脂质浓度的变化 正常对照组兔血清外观清亮，高脂4周组及高脂8周组兔血清呈不同程度乳白色浑浊。各组兔血清脂质变化见表1，经方差分析，各组的TC、TG、LDL-C和oxLDL水平均具有显著差异(P<0.01)。两两比较显示，高脂4周组及高脂8周组TC、TG、LDL-C及oxLDL水平均较对照组明显升高(P<0.01)；高脂8周组TC、LDL-C、TG水平均较高脂4周组升高(分别P<0.01、P<0.05)；对照组、高脂4周组、高脂8周组各组间HDL-C水平差异无统计学意义(P>0.05)。
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表1 高脂家兔血清脂质水平
(n=6,
±s) 组别TC(cB/mmol.L-1)
TG
(cB/mmol.L-1)
HDL-C
(cB/mmol.L-1)
LDL-C
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(cB/mmol.L-1)
oxLDL
(ρB/mg.L-1)
对照组
2.61±0.59
0.79±0.61
0.83±0.53
0.89±0.42
0.30±0.12
高脂4周组
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8.77±1.26**
2.57±0.75**
1.03±0.86
7.16±0.94**
0.65±0.25**
高脂8周组
22.9±1.82**△△
3.89±1.23**△
1.31±0.77
15.7±1.25**△△
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0.77±0.32**
**P<0.01 与对照组比较; △P<0.05, △△P<0.01 与高脂4周组比较
2.3 原位杂交 光镜下可见正常兔主动脉ETRA mRNA表达水平很低，高脂4周组兔主动脉粥样硬化斑块中ETRA mRNA表达水平升高，高脂8周组的表达水平更高(图1)。
图1 高脂4周(A)、8周(B)兔主动脉AS斑块ETRA表达(×400)
3 讨论
Winkles等[4]的临床研究发现，在人颈动脉粥样硬化斑块组织的匀浆中有ET-1和ETRA、ETRB mRNA的表达，但未能明确其与病变严重程度之间的关系。本研究通过对兔主动脉粥样硬化斑块的ETRA mRNA进行原位杂交检测，结果表明正常兔主动脉ETRA mRNA表达水平较低，在主动脉粥样硬化斑块中ETRA mRNA表达水平有所升高，并且粥样硬化病变程度越严重，ETRA mRNA表达水平就越高；在有斑块破裂出血的部位，ETRA mRNA表达水平最高。本研究结果提示，随着AS病变的加重，斑块中ETRA mRNA表达水平也进一步升高，提示AS形成中有ETRA的参与，ETRA的基因表达水平在一定程度上与病变严重性相一致。
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*国家自然科学基金资助项目，批准号39600063
中图分类号 R 543.12 文章编号：0258-879X(1999)12-1038-02 文献标识码：B
作者简介：荆清，男，1965年11月生，博士，主治医师
参考文献
1 Roberts R. Molecular basis of cardiology[M]. Cambridge: Blackwell Scientific Publications, 1993.415～430
2 Lerman A, Holmes DR Jr, Bell MR, et al. Endothelin in coronary endothelial dysfunction and early atherosclerosis in humans[J]. Circulation, 1995, 92(9): 2426
, 百拇医药
3 Zeiher AM, Ihling C, Pistorius K, et al. Increased tissue endothelin immunoreactivity in atherosclerotic lesions associated with acute coronary syndromes[J]. Lancet, 1994, 344(8934): 1405
4 Winkles JA, Alberts GF, Brogi E, et al. Endothelin-1 and endothelin receptor mRNA expression in normal and atherosclerotic human arteries[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1993,191(3):1081
(1999-08-19收稿，1999-10-18修回), 百拇医药