哮喘豚鼠肺组织PKC的表达及对TXA2释放的影响
作者：吴奎 杨肇亨
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所呼吸内科，重庆 400042
关键词：蛋白激酶C；血栓烷A2；哮喘
提要 目的
提要 目的：探讨蛋白激酶C(PKC)在哮喘发病中的作用。方法：采用卵蛋白雾化吸入致敏哮喘模型，在诱发哮喘24 h后，放射性同位素标记方法测定哮喘豚鼠肺组织总PKC活性及膜活性变化，采用免疫组织化学的方法检测肺组织PKC的表达，体外检测PKC活化剂PMA和抑制剂H-7对肺组织血栓烷A2(TXA2)释放的影响。结果：①哮喘组肺组织PKC活性显著增加；PKC呈强阳性表达；②PMA引起了肺组织TXA2的释放的增加，而H-7则抑制了PMA的效应；③相关分析表明，PKC活性与TXA2的释放量呈显著正相关。结论：PKC的过度表达可能在哮喘发病中起着重要作用，抑制PKC的活性可能是将来哮喘防治的另一条途径。
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中图法分类号 R394.3;R562.25 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(1999)12-0919-04
The expression of protein kinase C in lung tissues and its effects on TXA2 release in asthmatic guinea pigs
WU Kui,YANG Zhao-heng
(Department of Respiratory Disease,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042)
Abstract Objective: To study the role of protein kinase C (PKC) in the pathogenesis of asthma.Methods: Guinea pigs were sensitized by exposing to aerosolized ovalbumin.24 hours after exposure,the activity of PKC in lung tissues was determined,the expression of PKC in the lungs was identified and the quantity of TXA2 release induced by PMA,a PKC activator,and H-7,a specific inhibitor of PKC,was measured.Results: ①The activity and expression of PKC in the asthmatic lung tissues were significantly increased and they were positively correlated to the release of TXA2.②PMA after incubated with lung tissues,promoted the release of TXA2 and H-7 was able to antagonize the effects of PMA after preincubated with lung tissues.Conclusion: Overexpression of PKC may play an important role in the development of asthma.Consequently the inhibition of the activity of PKC may exert therapeutic effects on asthma.
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Key words protein kinase C; asthma; thromboxane A2; guinea pig
蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)是一个在组织中广泛分布的磷酸化酶，静息状态下定位于细胞胞浆中，受到刺激后，它可以转位至胞膜而活化，在细胞分泌、增生、分化等功能中发挥着重要作用[1]。支气管哮喘是有多种炎性细胞参与的气道慢性炎症[2]，炎性细胞释放多种炎性介质引起气道上皮损伤，神经末梢暴露，支气管平滑肌增生肥厚，对刺激的反应性增加，诱发气道高反应性。在以上过程中，PKC起着重要信号转导作用。哮喘时肺组织中多种炎性细胞PKC的表达及活化增加，但肺组织中PKC的活化及其作用的研究较少。本实验采用卵蛋白(OVA)雾化吸入致敏和诱发豚鼠哮喘模型，哮喘发作24 h后以放射性同位素标记方法测定哮喘豚鼠肺组织PKC活性的变化，测定PKC活化剂PMA、抑制剂H-7对豚鼠肺组织炎性介质血栓烷A2(TXA2)释放的影响，并采用免疫组织化学方法，测定肺组织PKC表达及分布，以探讨PKC可能在哮喘发病过程中所起的作用，为寻求哮喘治疗的新途径提供一些可能有效的提示。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂
PMA、H-7、组蛋白H-Ⅲss、PS Sigma公司；γ-32P-ATP(比活度>5 000 Ci/mmol)福瑞公司；APC试剂盒中山公司；抗PKC抗体Pharmigen公司；TXB2放免药盒苏州医学院。
1.2 实验动物模型的制作及处理
1.2.1 哮喘动物模型的制作
20只雄性豚鼠，体重250～300 g，随机分为对照组(C)、哮喘组(A)。A组：参照Huston[3]方法，第1、4、7天将1%的OVA雾化吸入3 min致敏琢鼠，第21～27天用2%的OVA雾化吸入5 min诱发其哮喘发作，诱发后24 h采集标本。C组：用生理盐水替代OVA致敏，诱发同A组。
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1.2.2 标本采集 实验豚鼠麻醉后，开胸暴露心脏，经左心室→主动脉弓灌注生理盐水约200 ml(至从左心房流出的液体基本清亮为止)，同时分离出气管，结扎左肺从根部剪下，置于4%多聚甲醛-PBS缓冲液固定，修整、石蜡包埋后，切5 μm切片。右肺在4℃条件下剪切成1 mm×1 mm大小的碎块，以备PKC提取及TXA2的测定。
1.3 PKC活性的测定[4]
1.3.1 组织样品的制备 胞液和膜性酶液的制备：将剪碎的肺组织，称取0.25 g，进行列操作：(1)以1∶5(W∶V)的缓冲液(内含20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、0.25 mol/L蔗糖、0.5 mmol/L PMSF、2mmol/L EDTA、10 mmol/L EGTA)在冰浴中高速匀浆；(2)700×g离心去核(4℃、15 min)，超声粉碎；(3)上清液经(100000×g)4℃离心1h，上清液即为胞液PKC酶液；(4)①沉淀部分溶解于含有0.5%TritonX-100的上述缓冲液中；②冰浴中搅拌抽提1h；③100000×g、4℃离心1h，上清液为PKC膜性组分。
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1.3.2 PKC活性的测定 采用标记的放射性同位素法进行，总反应体积50 μl，内含终浓度25 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、10 mmol/L MgCl2、0.5 mol/L CaCl2、10 μg PS、10 μg组蛋白H-Ⅲss、10 μl酶制剂、1 μg PMA、加入γ-32P-ATP 0.2 μCi起动反应；对照组用2.5 mmol/L EGTA代替PS、PMA和CaCl2。37℃水浴中准确温育5 min，立即移入2℃～4℃冰浴中，随后加入10 μl 2 mmol/L EDTA终止反应、将液体移于微孔滤膜上，10%三氯乙酸抽滤2 ml×5，烤干后放入装有5 ml闪烁液(ppo 5 g、popop 0.2 g/1 000 ml甲苯)的液闪瓶内，于液闪仪测cpm，酶的活力单位以37℃时每分钟每毫克酶蛋白转移1 μmol磷酸根来表示，其表示单位为fmol/mg.min-1。
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1.3.3 蛋白定量 采用Folin-酚法进行。
1.4 TXA2的放免测定
1.4.1 样品制备
将剪碎的肺组织每只动物称取0.25 g×3，分别放入装有2ml台氏液(NaCl 8.0 g/L，KCl 0.2 g/L,CaCl2 0.2 g/L,NaHCO3 1.0 g/L,MgCl2 0.1 g/L,NaH2PO4 0.05 g/L,Glucose 1.0 g/L)的A、B、C 3只试管中，其中A管中含有100 ng/ml H-7，先37℃孵育5 min，然后A、B 2管加PMA至10 ng/ml，3管同时37℃孵育30 min，吸取上清进行放射免疫测定(由于TXA2代谢迅速，半衰期短，因此测定其稳定的代谢产物TXB2以代替)。
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1.4.2 放免测定根据试剂盒说明书进行。
1.5 PKC免疫组织化学染色
参照文献[5]进行。
观察方法及判断标准：阳性染色显示肺组织细胞及浸润的炎性细胞中出现黄色染色。每张切片由2位观察者独立计数，随机取染色区域4个高倍视野(×400)的阳性细胞平均数，用半定量计分，染色强度用0～3级计分：0：无染色；1：轻度阳性染色；2：中度阳性染色；3：强阳性染色；染色范围根据细胞阳性染色的百分数而分为0～4级；0：无染色；1：<25%细胞染色；2：25～50%细胞染色；3：50～75%细胞染色;4：>75%细胞染色。染色总评分为染色强度+染色范围。
1.6 数据统计学分析
本实验数据采用均数±标准差表示(x±s)。组间比较及相关分析全部用非配对计量资料检验和直线相关分析。P<0.05表示相差或相关显著，P<0.01表示相差或相关非常显著。
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2 结果
2.1 实验动物肺组织中PKC活性的变化
结果表明，哮喘组动物总PKC活性明显高于对照组，且膜PKC活性及所占比例亦较对照组明显上升，见表1。
表1 各组肺组织总PKC及膜PKC活性
(fmol/mg.min-1，n=10)
Tab 1 The activity of total and membrane
PKC in lungtissue (fmol/mg.min-1，n=10)
Group
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tPKC
mPKC
mPKC(%)
Control
101.88±13.55
26.46±5.86
26.41±4.17
Asthma
466.37±110.96*
155.97±40.82*
33.29±3.97#
, 百拇医药
#:P<0.05，*：P<0.01 vs control
2.2 实验动物肺组织PKC的表达水平
实验动物肺组织PKC免疫组化结果镜下显示，哮喘组肺组织见较广泛阳性染色细胞，主要分布于支气管粘膜上皮、粘膜下、气管平滑肌，见图1，肺泡间、甚至肺泡腔内，见图2。高倍镜下见阳性染色PKC定位于胞浆及胞膜，呈棕黄色。正常组实验动物肺组织可见少许染色较浅细胞，见图3，气道粘膜光滑，染色较浅，见图4。肺组织PKC表达的半定量计分结果，见表2。
表2 肺组织PKC的表达(n=10)
Tab 2 The expression of PKC in lung tissue (n=10)
Group
, http://www.100md.com Expression
Control
1.73±0.50
Asthma
4.65±0.59*
*:P<0.01 vs control
图1 哮喘豚鼠支气管腔嗜酸性细胞浸润，浸润细胞及支
气管粘膜、气道平滑肌PKC呈强阳性表达(DAB显色，苏木素复染，×400)
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Fig 1 Infiltration of Eos in bronchial cavity,expression of PKC is strongly positive in infiltrated cells,bronchial mucosa and airway smooth muscle in bronchus of asthmatic guinea pig (DAB stain,Hematoxylin restain,×400)
图2 哮喘豚鼠肺泡内大量炎性细胞浸润，PKC呈阳性表达
(DAB显色，苏木素复染，×400)
Fig 2 Massive infiltration of inflammatory cells in alveolar,positive expression of PKC in alveolus of asthmatic guinea pig (DAB stain,Hematoxylin restain,×400)
, 百拇医药
图3 正常豚鼠肺泡内无炎性细胞浸润，PKC表达呈弱阳性
(DAB显色，苏木素复染,×400)
Fig 3 No inflammatory cells infiltration,PKC expression weak positive in alveolar of normal guinea pig (DAB stain,Hematoxylin restain,×400)
图4 正常豚鼠支气管粘膜光滑，无炎性细胞浸润，PKC表达呈弱阳性
(DAB显色，苏木素复染，×400)
, 百拇医药
Fig 4 Mucosa of bronchus smooth,no inflammatory cell infiltration,PKC expression weak positive in normal guinea pig (DAB stain,Hematoxylin restain,×400)
2.3 PKC对肺组织释放TXA2的作用 放免结果显示，PKC活化剂PMA可以刺激肺组织释放TXA2，而其抑制剂H-7则显著抑制PMA的作用，见表3。
表3 PKC活化剂和抑制剂对TXA2释放的作用(pg/ml,n=10)
Tab 3 The release of TXA2 induced by activator and
, http://www.100md.com inhibitor of PKC(pg/ml，n=10)
Group
PMA
H-7+PMA
Blank control
Control
228.45±53.42#
33.75±4.69**
34.30±5.19
Asthma
391.63±52.43#*
, 百拇医药
63.34±14.21**
60.60±19.47
*：P<0.01 vs control；#：P<0.01 vs H-7+PMA；**：P>0.05 vs without medicine
2.4 相关分析
相关分析表明，PKC活性PMA诱导的TXA2释放量呈显著正相关(γ=0.702;P<0.01)。
3 讨论
本研究采用了同位素标记γ-32P-ATP测定哮喘豚鼠肺组织中PKC活性的变化及其在细胞中定位比例的变化；采用免疫组织化学的方法，检测PKC在肺组织中的表达和分布；并且分别采用PKC活化剂PMA以及抑制剂H-7加PMA处理肺组织，检测对炎症介质TXA2释放的影响。结果表明，哮喘豚鼠肺组织中总PKC活性较正常组显著增高，膜PKC活性所占比例与正常组相比亦显著增高，提示哮喘时PKC活性增加及活化。免疫组化结果表明，正常豚鼠肺组织中见PKC呈弱阳性表达，而哮喘组豚鼠肺组织中支气管粘膜、肺泡、毛细血管、以及肺泡内浸润的炎性细胞中均见PKC呈强阳性表达。PMA导致肺组织释放TXA2增加，而先用H-7预处理后再加PMA则未引起TXA2的释放。
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研究表明，在哮喘发病过程中，炎性细胞出现了PKC活性变化，以及PKC分布比例的变化。Bansal[6]研究发现，哮喘患者淋巴细胞总PKC活性增加，膜PKC活性所占比例亦显著增加，且患者的一秒钟用力呼气量(FEV1)与总PKC活性显著负相关。Bates等[7]的研究表明，哮喘病人的血和BALF低密度嗜酸性粒细胞PKC活性显著增加。本实验结果和Bansal[6]、Bates等[7]的结果相符，表明哮喘动物不仅出现PKC含量增加，同时发生PKC的转位活化。
已知PMA是PKC的高效活化剂，而H-7是PKC的特异性抑制剂，说明是PKC的活化引起了TXA2的释放增加，而PKC的抑制剂则阻抑了TXA2的合成及释放。相关分析表明PKC活性与TXA2的释放量呈显著正相关。PKC活化引起TXA2释放增加的作用的可能机制是促使TXA2的合成增加。因为TXA2的半衰期极短，生成后迅速代谢成为TXB2而灭活。据报道，PKC的活化还可引起cPLA2[8]、COX[9]活性增加。cPLA2活性增加引起花生四烯酸(AA)的生成增加，COX活性增加则促使AA向TXA2转变。既往研究证实，PKC活化可以引起肥大细胞、T淋巴细胞、Eos、中性粒细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞等释放组织胺、白三烯、TXA2，诱发IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-16、INF-α等的表达、分泌增加，诱发炎性细胞脱颗粒、粘附、呼吸暴发。
, 百拇医药
本实验表明，在哮喘豚鼠肺组织中，组织细胞中PKC表达增加，伴PKC的转位活化。PKC的活化进一步引起炎性介质释放增加，而PKC特异性抑制剂H-7阻抑炎性介质的释放，说明PKC在哮喘炎性介质的释放中起着重要作用。
作者简介：吴 奎，男，1971.01.02生，江苏省沛县人，硕士，住院医师，主要从事哮喘发病机制方面的研究，发表论文2篇。电话：(023)68757625
参考文献
[1] Nishizuka Y.Protein kinase 5,Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses[J].FASEB J,1995,9(5):484-494.
[2] 中华医学会呼吸系病学分会.支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案)[J].中华结核和呼吸杂志，1997，20(5)：261-265.
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[3] Huston P A,Church M K,Clay T P,et al.Early and late-phase bronchoconstriction after allergen challenge of non-anesthetized guinea pigs.I.The association of disordered airway physiology to leukocyte infiltration[J].Am Respir Dis,1988,137(3):548-557.
[4] Ooka Y,Kuwata T,Asada A,et al.Regulation of thymocyte lineage commitment by the level of classical protein kinase C activity[J].J Immunol,1997,158(12):5707-5716.
[5] 蔡文琴，王伯.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M].四川科学技术出版社，1994.94-96.
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[6] Bansal S K,Jha A,Jaismal A S,et al.Increased levels of protein kinase C in lymphocyte in asthma: Possible mechanism of regulation[J].Eur Respir J,1997,10(2):308-313.
[7] Bates M.E,Bertics P.J,Calhoun W.J,et al.Increased protein kinase C activity in low density Eosinohils[J].J Immunol,1993,150(10):4486-4493.
[8] Chang E Y,Szallasi Z,Acs P,et al.Functional effects of overexpression of protein kinase C-α,-β,-δ,-ε and -η in the mast cell line RBL-2H3[J].J Immunol,1997,159(6):2624-2632.
[9] Vezza R,Habib A,Li H,et al.Regulation of cyclooxygenase by protein kinase C[J].J Biol Chem,1996,271(47):300028-300033.
收稿日期：1999-01-26；修回日期：1999-07-22, 百拇医药
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所呼吸内科，重庆 400042
关键词：蛋白激酶C；血栓烷A2；哮喘
提要 目的
提要 目的：探讨蛋白激酶C(PKC)在哮喘发病中的作用。方法：采用卵蛋白雾化吸入致敏哮喘模型，在诱发哮喘24 h后，放射性同位素标记方法测定哮喘豚鼠肺组织总PKC活性及膜活性变化，采用免疫组织化学的方法检测肺组织PKC的表达，体外检测PKC活化剂PMA和抑制剂H-7对肺组织血栓烷A2(TXA2)释放的影响。结果：①哮喘组肺组织PKC活性显著增加；PKC呈强阳性表达；②PMA引起了肺组织TXA2的释放的增加，而H-7则抑制了PMA的效应；③相关分析表明，PKC活性与TXA2的释放量呈显著正相关。结论：PKC的过度表达可能在哮喘发病中起着重要作用，抑制PKC的活性可能是将来哮喘防治的另一条途径。
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中图法分类号 R394.3;R562.25 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(1999)12-0919-04
The expression of protein kinase C in lung tissues and its effects on TXA2 release in asthmatic guinea pigs
WU Kui,YANG Zhao-heng
(Department of Respiratory Disease,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042)
Abstract Objective: To study the role of protein kinase C (PKC) in the pathogenesis of asthma.Methods: Guinea pigs were sensitized by exposing to aerosolized ovalbumin.24 hours after exposure,the activity of PKC in lung tissues was determined,the expression of PKC in the lungs was identified and the quantity of TXA2 release induced by PMA,a PKC activator,and H-7,a specific inhibitor of PKC,was measured.Results: ①The activity and expression of PKC in the asthmatic lung tissues were significantly increased and they were positively correlated to the release of TXA2.②PMA after incubated with lung tissues,promoted the release of TXA2 and H-7 was able to antagonize the effects of PMA after preincubated with lung tissues.Conclusion: Overexpression of PKC may play an important role in the development of asthma.Consequently the inhibition of the activity of PKC may exert therapeutic effects on asthma.
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Key words protein kinase C; asthma; thromboxane A2; guinea pig
蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)是一个在组织中广泛分布的磷酸化酶，静息状态下定位于细胞胞浆中，受到刺激后，它可以转位至胞膜而活化，在细胞分泌、增生、分化等功能中发挥着重要作用[1]。支气管哮喘是有多种炎性细胞参与的气道慢性炎症[2]，炎性细胞释放多种炎性介质引起气道上皮损伤，神经末梢暴露，支气管平滑肌增生肥厚，对刺激的反应性增加，诱发气道高反应性。在以上过程中，PKC起着重要信号转导作用。哮喘时肺组织中多种炎性细胞PKC的表达及活化增加，但肺组织中PKC的活化及其作用的研究较少。本实验采用卵蛋白(OVA)雾化吸入致敏和诱发豚鼠哮喘模型，哮喘发作24 h后以放射性同位素标记方法测定哮喘豚鼠肺组织PKC活性的变化，测定PKC活化剂PMA、抑制剂H-7对豚鼠肺组织炎性介质血栓烷A2(TXA2)释放的影响，并采用免疫组织化学方法，测定肺组织PKC表达及分布，以探讨PKC可能在哮喘发病过程中所起的作用，为寻求哮喘治疗的新途径提供一些可能有效的提示。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂
PMA、H-7、组蛋白H-Ⅲss、PS Sigma公司；γ-32P-ATP(比活度>5 000 Ci/mmol)福瑞公司；APC试剂盒中山公司；抗PKC抗体Pharmigen公司；TXB2放免药盒苏州医学院。
1.2 实验动物模型的制作及处理
1.2.1 哮喘动物模型的制作
20只雄性豚鼠，体重250～300 g，随机分为对照组(C)、哮喘组(A)。A组：参照Huston[3]方法，第1、4、7天将1%的OVA雾化吸入3 min致敏琢鼠，第21～27天用2%的OVA雾化吸入5 min诱发其哮喘发作，诱发后24 h采集标本。C组：用生理盐水替代OVA致敏，诱发同A组。
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1.2.2 标本采集 实验豚鼠麻醉后，开胸暴露心脏，经左心室→主动脉弓灌注生理盐水约200 ml(至从左心房流出的液体基本清亮为止)，同时分离出气管，结扎左肺从根部剪下，置于4%多聚甲醛-PBS缓冲液固定，修整、石蜡包埋后，切5 μm切片。右肺在4℃条件下剪切成1 mm×1 mm大小的碎块，以备PKC提取及TXA2的测定。
1.3 PKC活性的测定[4]
1.3.1 组织样品的制备 胞液和膜性酶液的制备：将剪碎的肺组织，称取0.25 g，进行列操作：(1)以1∶5(W∶V)的缓冲液(内含20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、0.25 mol/L蔗糖、0.5 mmol/L PMSF、2mmol/L EDTA、10 mmol/L EGTA)在冰浴中高速匀浆；(2)700×g离心去核(4℃、15 min)，超声粉碎；(3)上清液经(100000×g)4℃离心1h，上清液即为胞液PKC酶液；(4)①沉淀部分溶解于含有0.5%TritonX-100的上述缓冲液中；②冰浴中搅拌抽提1h；③100000×g、4℃离心1h，上清液为PKC膜性组分。
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1.3.2 PKC活性的测定 采用标记的放射性同位素法进行，总反应体积50 μl，内含终浓度25 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、10 mmol/L MgCl2、0.5 mol/L CaCl2、10 μg PS、10 μg组蛋白H-Ⅲss、10 μl酶制剂、1 μg PMA、加入γ-32P-ATP 0.2 μCi起动反应；对照组用2.5 mmol/L EGTA代替PS、PMA和CaCl2。37℃水浴中准确温育5 min，立即移入2℃～4℃冰浴中，随后加入10 μl 2 mmol/L EDTA终止反应、将液体移于微孔滤膜上，10%三氯乙酸抽滤2 ml×5，烤干后放入装有5 ml闪烁液(ppo 5 g、popop 0.2 g/1 000 ml甲苯)的液闪瓶内，于液闪仪测cpm，酶的活力单位以37℃时每分钟每毫克酶蛋白转移1 μmol磷酸根来表示，其表示单位为fmol/mg.min-1。
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1.3.3 蛋白定量 采用Folin-酚法进行。
1.4 TXA2的放免测定
1.4.1 样品制备
将剪碎的肺组织每只动物称取0.25 g×3，分别放入装有2ml台氏液(NaCl 8.0 g/L，KCl 0.2 g/L,CaCl2 0.2 g/L,NaHCO3 1.0 g/L,MgCl2 0.1 g/L,NaH2PO4 0.05 g/L,Glucose 1.0 g/L)的A、B、C 3只试管中，其中A管中含有100 ng/ml H-7，先37℃孵育5 min，然后A、B 2管加PMA至10 ng/ml，3管同时37℃孵育30 min，吸取上清进行放射免疫测定(由于TXA2代谢迅速，半衰期短，因此测定其稳定的代谢产物TXB2以代替)。
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1.4.2 放免测定根据试剂盒说明书进行。
1.5 PKC免疫组织化学染色
参照文献[5]进行。
观察方法及判断标准：阳性染色显示肺组织细胞及浸润的炎性细胞中出现黄色染色。每张切片由2位观察者独立计数，随机取染色区域4个高倍视野(×400)的阳性细胞平均数，用半定量计分，染色强度用0～3级计分：0：无染色；1：轻度阳性染色；2：中度阳性染色；3：强阳性染色；染色范围根据细胞阳性染色的百分数而分为0～4级；0：无染色；1：<25%细胞染色；2：25～50%细胞染色；3：50～75%细胞染色;4：>75%细胞染色。染色总评分为染色强度+染色范围。
1.6 数据统计学分析
本实验数据采用均数±标准差表示(x±s)。组间比较及相关分析全部用非配对计量资料检验和直线相关分析。P<0.05表示相差或相关显著，P<0.01表示相差或相关非常显著。
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2 结果
2.1 实验动物肺组织中PKC活性的变化
结果表明，哮喘组动物总PKC活性明显高于对照组，且膜PKC活性及所占比例亦较对照组明显上升，见表1。
表1 各组肺组织总PKC及膜PKC活性
(fmol/mg.min-1，n=10)
Tab 1 The activity of total and membrane
PKC in lungtissue (fmol/mg.min-1，n=10)
Group
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tPKC
mPKC
mPKC(%)
Control
101.88±13.55
26.46±5.86
26.41±4.17
Asthma
466.37±110.96*
155.97±40.82*
33.29±3.97#
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#:P<0.05，*：P<0.01 vs control
2.2 实验动物肺组织PKC的表达水平
实验动物肺组织PKC免疫组化结果镜下显示，哮喘组肺组织见较广泛阳性染色细胞，主要分布于支气管粘膜上皮、粘膜下、气管平滑肌，见图1，肺泡间、甚至肺泡腔内，见图2。高倍镜下见阳性染色PKC定位于胞浆及胞膜，呈棕黄色。正常组实验动物肺组织可见少许染色较浅细胞，见图3，气道粘膜光滑，染色较浅，见图4。肺组织PKC表达的半定量计分结果，见表2。
表2 肺组织PKC的表达(n=10)
Tab 2 The expression of PKC in lung tissue (n=10)
Group
, http://www.100md.com Expression
Control
1.73±0.50
Asthma
4.65±0.59*
*:P<0.01 vs control
图1 哮喘豚鼠支气管腔嗜酸性细胞浸润，浸润细胞及支
气管粘膜、气道平滑肌PKC呈强阳性表达(DAB显色，苏木素复染，×400)
, http://www.100md.com
Fig 1 Infiltration of Eos in bronchial cavity,expression of PKC is strongly positive in infiltrated cells,bronchial mucosa and airway smooth muscle in bronchus of asthmatic guinea pig (DAB stain,Hematoxylin restain,×400)
图2 哮喘豚鼠肺泡内大量炎性细胞浸润，PKC呈阳性表达
(DAB显色，苏木素复染，×400)
Fig 2 Massive infiltration of inflammatory cells in alveolar,positive expression of PKC in alveolus of asthmatic guinea pig (DAB stain,Hematoxylin restain,×400)
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图3 正常豚鼠肺泡内无炎性细胞浸润，PKC表达呈弱阳性
(DAB显色，苏木素复染,×400)
Fig 3 No inflammatory cells infiltration,PKC expression weak positive in alveolar of normal guinea pig (DAB stain,Hematoxylin restain,×400)
图4 正常豚鼠支气管粘膜光滑，无炎性细胞浸润，PKC表达呈弱阳性
(DAB显色，苏木素复染，×400)
, 百拇医药
Fig 4 Mucosa of bronchus smooth,no inflammatory cell infiltration,PKC expression weak positive in normal guinea pig (DAB stain,Hematoxylin restain,×400)
2.3 PKC对肺组织释放TXA2的作用 放免结果显示，PKC活化剂PMA可以刺激肺组织释放TXA2，而其抑制剂H-7则显著抑制PMA的作用，见表3。
表3 PKC活化剂和抑制剂对TXA2释放的作用(pg/ml,n=10)
Tab 3 The release of TXA2 induced by activator and
, http://www.100md.com inhibitor of PKC(pg/ml，n=10)
Group
PMA
H-7+PMA
Blank control
Control
228.45±53.42#
33.75±4.69**
34.30±5.19
Asthma
391.63±52.43#*
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63.34±14.21**
60.60±19.47
*：P<0.01 vs control；#：P<0.01 vs H-7+PMA；**：P>0.05 vs without medicine
2.4 相关分析
相关分析表明，PKC活性PMA诱导的TXA2释放量呈显著正相关(γ=0.702;P<0.01)。
3 讨论
本研究采用了同位素标记γ-32P-ATP测定哮喘豚鼠肺组织中PKC活性的变化及其在细胞中定位比例的变化；采用免疫组织化学的方法，检测PKC在肺组织中的表达和分布；并且分别采用PKC活化剂PMA以及抑制剂H-7加PMA处理肺组织，检测对炎症介质TXA2释放的影响。结果表明，哮喘豚鼠肺组织中总PKC活性较正常组显著增高，膜PKC活性所占比例与正常组相比亦显著增高，提示哮喘时PKC活性增加及活化。免疫组化结果表明，正常豚鼠肺组织中见PKC呈弱阳性表达，而哮喘组豚鼠肺组织中支气管粘膜、肺泡、毛细血管、以及肺泡内浸润的炎性细胞中均见PKC呈强阳性表达。PMA导致肺组织释放TXA2增加，而先用H-7预处理后再加PMA则未引起TXA2的释放。
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研究表明，在哮喘发病过程中，炎性细胞出现了PKC活性变化，以及PKC分布比例的变化。Bansal[6]研究发现，哮喘患者淋巴细胞总PKC活性增加，膜PKC活性所占比例亦显著增加，且患者的一秒钟用力呼气量(FEV1)与总PKC活性显著负相关。Bates等[7]的研究表明，哮喘病人的血和BALF低密度嗜酸性粒细胞PKC活性显著增加。本实验结果和Bansal[6]、Bates等[7]的结果相符，表明哮喘动物不仅出现PKC含量增加，同时发生PKC的转位活化。
已知PMA是PKC的高效活化剂，而H-7是PKC的特异性抑制剂，说明是PKC的活化引起了TXA2的释放增加，而PKC的抑制剂则阻抑了TXA2的合成及释放。相关分析表明PKC活性与TXA2的释放量呈显著正相关。PKC活化引起TXA2释放增加的作用的可能机制是促使TXA2的合成增加。因为TXA2的半衰期极短，生成后迅速代谢成为TXB2而灭活。据报道，PKC的活化还可引起cPLA2[8]、COX[9]活性增加。cPLA2活性增加引起花生四烯酸(AA)的生成增加，COX活性增加则促使AA向TXA2转变。既往研究证实，PKC活化可以引起肥大细胞、T淋巴细胞、Eos、中性粒细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞等释放组织胺、白三烯、TXA2，诱发IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-16、INF-α等的表达、分泌增加，诱发炎性细胞脱颗粒、粘附、呼吸暴发。
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本实验表明，在哮喘豚鼠肺组织中，组织细胞中PKC表达增加，伴PKC的转位活化。PKC的活化进一步引起炎性介质释放增加，而PKC特异性抑制剂H-7阻抑炎性介质的释放，说明PKC在哮喘炎性介质的释放中起着重要作用。
作者简介：吴 奎，男，1971.01.02生，江苏省沛县人，硕士，住院医师，主要从事哮喘发病机制方面的研究，发表论文2篇。电话：(023)68757625
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收稿日期：1999-01-26；修回日期：1999-07-22, 百拇医药