应用多元线性回归与多元逐步回归模型研究骨肉瘤的预后影响因素
作者：郭乔楠 陈意生
单位：第三军医大学基础医学部病理学教研室，重庆 400038
关键词：骨肉瘤；多元回归；预后
第三军医大学学报991208
提要 目的：探讨骨肉瘤的性别、年龄、肿瘤部位、病理分型、肿瘤大小、核丝分裂像计数、DNA图像分析、AgNORs计数、PCNA分级、KiS1分级、肥大细胞计数共11个观察指标与骨肉瘤预后的关系。方法：单因素分析：Kaplan-Meier生存曲线法，Log-rank检验法。多因素分析：多元线性回归法，多元逐步回归法。结果：经多元回归获得预后预测方程，其总F=12.575，r=0.7134，P<0.0001。逐步回归检验显示6个明显的骨肉瘤预后影响因素，其作用强度依次为DNA图像分析、AgNORs计数、肿瘤大小、年龄、性别、肿瘤部位。结论：几项骨肉瘤细胞增殖活性指标对骨肉瘤预后的判断有一定的应用价值。
, 百拇医药
中图法分类号 R195.1;R738.1 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(1999)12-0893-03
Analysis of prognostic factors of human osteosarcoma with multivariate regression
GUO Qiao-nan,CHEN Yi-sheng
(Department of Pathology, Third Military Medical University, Chongqing 400038)
Abstract Objective: To analyze the prognostic significance of sex,age,tumor site,tumor size,mitotic count,DNA content AgNORs count,PCNA grading,KiS1 grading and mast cell count for osteosarcoma with multivariate regression. Methods: Univariate analysis including Kaplan-Meier survival curve and Log-rank test and multivariate analysis including multivariate linear regression and multivariate partial regression were used.Results: A significant regression equation was obtained as following:F=12.575. r=0.7134 and P<0.0001. Partial regression revealed that the most useful prognostic factors for osteosarcoma were DNA ploidy and DI value,tumor size, tumor site,KiS1 grading and AgNORs count.Conclusion:Certain indices denoting the activity of cellular proliferation of osteosarcoma are useful to its prognosis.
, 百拇医药
Key words osteosarcoma;multivariate regression;prognosis
迄今为止，对骨肉瘤的治疗方法尚不够理想。其病死率及致残率皆较高[1，2]。因而对骨肉瘤预后影响因素的研究更显重要。我们应用多元线性回归及多元逐步回归检验对影响骨肉瘤预后的11项指标进行了分析，报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
收集1978～1994年间我校附一、二院及重庆市肿瘤医院骨肉瘤患者共96例，均为有完整随访资料的存档蜡块。
1.2 方法
1.2.1 组织学观察及分型标准
, 百拇医药
采用WHO 1993年骨肿瘤分型标准。核丝分裂像计数为每10个高倍视野(40×10)中核分裂像。
1.2.2 细胞核DNA染色及图像分析方法
DNA染色采用Feulgen染色法。应用CMIAS真彩色图像分析系统，综合采用图像分割及交互分割方法。以同切片中的间质细胞或淋巴细胞作为二倍体DNA含量的对照值，测定结果以DNA含量为横坐标，细胞数为纵坐标，自动绘出每个标本细胞核DNA含量直方图，并绘出每例的2倍体，3倍体，>5倍体各自百分率及分析细胞/淋巴细胞平均积分光密度值(DI)。
1.2.3 AgNORs染色及观察方法
采用胶质银染色，油镜下观察，每例取100个肿瘤细胞核内AgNORs总数，再换算成每个细胞核内AgNORs平均数。
1.2.4 单克隆抗体SP免疫组化染色方法及判断标准
, 百拇医药
PCNA单克隆抗体PC-10(工作浓度1∶50)及S-P试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，KiS1单克隆抗体(工作浓度1∶10 000)由德国Kiel大学Kreipe教授惠赠。
细胞核呈黄色至棕色染色为阳性，计算整张切片阳性细胞分布数，按百分比计数，阳性细胞数<50%定为低分级(Low grade, L)，阳性细胞数>50%定为高分级(High grade, H)。
1.2.5 肥大细胞染色方法
采用甲苯胺蓝法。
1.3 统计学方法
单因素分析法：Log-rank时序检验法；多因素分析法：多元线性回归和多元逐步回归。采用我校数学教研室医用统计程序包SPMR。
2 结果
, 百拇医药
2.1 一般情况
96例骨肉瘤患者中男性63例，女性33例，男女之比为1.91∶1。年龄范围9～58岁。中位年龄21岁，高发年龄组为20～29岁。随访时间1～18年。平均为3.3年。3年生存率为51.04%(49/96)，总生存率为44.79%(43/96)。
2.2 单因素分析
将选取的11个观察指标(见表1)逐个用Log-rank检验方法进行检验，以上各指标均对预后的判断有意义(P<0.05,P<0.01)[6]。
表1 预后因素分析变量及赋值
Tab 1 Prognostic factors and their values Variables
, 百拇医药 Meanings
Values
X
Prognosis
Death=1 Survival=2
X1
Sex
Female=1 Male=2
X2
Age
<30=1 ≥30=2
X3
, 百拇医药
Site
Typical site=1 Atypical site=2
X4
Typing
Classical type=1 MFH-like=2
Small cell type=3 Giant cell type=4
X5
Size
<10 cm=1 ≥10 cm=2
X6
, 百拇医药
Mitotic count
≤5=1 >5=2(/10HFPs)
X7
DNA index
1 for DI=1 2 for DI=2
3 for DI=3 4 for DI=4
X8
AgNORs count
<3.5=1 ≥3.5=2
X9
, 百拇医药
PCNA count
L=1 H=2
X10
KiS1 count
L=1 H=2
X11
Mast cell count
<5=1 ≥5=2 (/10HFPs)
2.3 多因素分析
从96例人骨肉瘤Kaplan-Meier生存曲线看，患者多于3年内死亡，所以采用3年生存率为标准[3]。预后因素分析变量及赋值见表1。
, http://www.100md.com
得如下多元直线回归方程：
Y=2.6574-0.2166X1+0.1462X2+0.1028X3-0.0044X4
-0.2333X5+0.020X6-0.1752X7-0.1187X8
-0.1113X9-0.1080X10+0.0926X11
该方程的复相关系数为0.7134,F=12.575,P<0.0001。方程有非常显著的意义。作偏相关系数的显著性检验，结果见表2。表2 多元直线回归各因素偏回归系数及其显著性检验
, 百拇医药
Tab 2 Multivariate partial regression and significant test Variables
Partial regression
F
P
X1
-0.2613
6.155
0.0151
X2
0.1854
2.989
, 百拇医药
0.0875
X3
0.2003
3.513
0.0644
X4
-0.0167
0.023
0.8793
X5
-0.2929
7.882
, 百拇医药
0.0062
X6
-0.0275
0.063
0.8019
X7
-0.4696
23.766
<0.0001
X8
-0.1577
2.141
, http://www.100md.com
0.1471
X9
-0.1440
1.780
0.1858
X10
-0.1424
1.739
0.1908
X11
0.1042
0.922
, 百拇医药
0.3398
X5和X7(即肿瘤大小和DNA含量)的偏相关系数有非常显著的统计学意义(P<0.01),X1(性别)有显著的统计学意义(P<0.05)。作逐步回归分析，将显著性检验F值定为F>4，共有6个变量进入方程。
Y=2.6452-0.2460X1+0.1700X2+0.1099X3-0.2637X5
-0.1729X7-0.1949X8
复相关系数为0.7220,F=16.1515,P<0.0001方程有非常显著的意义。各自变量对Y的作用见表3。
, 百拇医药 表3 多元逐步回归自变量X对Y的作用
Tab 3 The actions of variables X of multivariate
regression on Y Selected variables
F ratio
Important rank
X7
42.3936
1
X8
8.8857
, 百拇医药
2
X5
6.5144
3
X2
7.9548
4
X1
6.6932
5
X3
4.5819
, http://www.100md.com
6
3 讨论 找寻一个对骨肉瘤预后判断有意义的模型一直是骨科医师与临床病理医师共同努力的目标[4]。我们对11项常用的临床与病理指标进行统计学处理，得到一个有非常显著意义的多元直线回归方程，其中偏相关系数与预后的线性关系有统计学意义的变量有DNA含量，肿瘤大小及性别。作逐步回归发现对预后有明确影响的因素有性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小，DNA含量及AgNORs计数。本组资料表明，年龄小于30岁，男性患者，发生于典型部位者(近膝关节)，以及肿瘤直径大于10 cm者的预后差。为什么在单因素分析中有统计学意义的PCNA、KiS1及肥大细胞计数在多因素分析中反而无意义了呢?我们认为，PCNA、KiS1计数与DNA含量及AgNORs计数间存在线性相关性(都反映肿瘤细胞增殖活性)，其作用可能部分或完全地被DNA含量代替，在多元分析中被掩盖。肥大细胞计数在单因素中的分析显示有显著意义，但在多元直线回归和逐步回归中皆无显著意义。因此将其作为判断预后的手段恰当与否。还需作进一步的资料积累和证实。
, 百拇医药
从以上模型可知，肿瘤患者的预后主要取决于肿瘤本身的恶性程度和增殖能力，DNA含量测定及图像分析，AgNORs计数方法简便，快捷、重复性好，尤其是DNA含量图像分析不受形态学改变的影响，在同一肿瘤中的值是恒定的，使其更具优越性。而PCNA，KiS1常规免疫组化染色也可作为一项补充手段来测定肿瘤增殖活性[5，6]，既然肿瘤大小是判断预后的明确因素，对肿瘤直径的测量也是必要的。
Cox回归模型是一种半参数生存分析数学模型，是生存分析中理论较为完善、应用最广泛的统计方法。我们国内随着计算机的推广应用也开始应用Cox模型进行预后分析。但我校目前还未建立此软件，不能开展此项工作。Davis等[1]对上百篇有关骨肉瘤预后的文章进行分析评述，不论是单因素分析，还是多因素分析，结果都不尽相同。我们采用多元直线回归和多元逐步回归模型，从某种程度上损失了截尾数据这个协变量的信息。但在没有Cox回归软件的情况下，采用Kaplan-Mier生存曲线，log-rank时序检验有意义的一些单因素进行多元直线回归和多元逐步回归，其结果仍有一定的临床意义。
, 百拇医药
作者简介：郭乔楠，女，1964.08.05生，湖南省桃源县人，博士，副教授，主要从事肿瘤病理方面的研究，发表论文10余篇。电话：(023)68753291
参考文献
[1] Davis A M, Bell R S, Goodwin P J. Prognostic Factors in osteosarcoma: A critical review[J]. J Clin Oncol,1994,12(2):423-431.
[2] Glasser D B, Lane J M, Huros A G, et al. Survival, prognosis and therapeutic response in osteogenic sarcoma[J],Cancer,1992,69(3):698-701.
[3] 郭乔楠，陈意生.96例人骨肉瘤预后影响因素的研究[J].第三军医大学学报，1999，21(2)：116-118.
, 百拇医药
[4] Wisman P, Enneking W F, Roesner A, et al. Local growth and the prognosis of osteosarcoma[J]. Int Orthopaed,1992,16(1):55-58.
[5] Linden M D, Torres F X, Kwbus J, et al. Clinical Application of morphologic and immunocytochemical assessments of cell proliferation[J]. Am J Clin Pathol,1992,97(5):s4-s13.
[6] Quinn C M, Wright N A. The clinical assessment of proliferation and growth in human tumors: Evaluation of methods and applications as prognostic variables[J]. J Pathol,1990;160(1):93-102.
收稿日期：1998-12-22；修回日期：1999-09-28, http://www.100md.com
单位：第三军医大学基础医学部病理学教研室，重庆 400038
关键词：骨肉瘤；多元回归；预后
第三军医大学学报991208
提要 目的：探讨骨肉瘤的性别、年龄、肿瘤部位、病理分型、肿瘤大小、核丝分裂像计数、DNA图像分析、AgNORs计数、PCNA分级、KiS1分级、肥大细胞计数共11个观察指标与骨肉瘤预后的关系。方法：单因素分析：Kaplan-Meier生存曲线法，Log-rank检验法。多因素分析：多元线性回归法，多元逐步回归法。结果：经多元回归获得预后预测方程，其总F=12.575，r=0.7134，P<0.0001。逐步回归检验显示6个明显的骨肉瘤预后影响因素，其作用强度依次为DNA图像分析、AgNORs计数、肿瘤大小、年龄、性别、肿瘤部位。结论：几项骨肉瘤细胞增殖活性指标对骨肉瘤预后的判断有一定的应用价值。
, 百拇医药
中图法分类号 R195.1;R738.1 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(1999)12-0893-03
Analysis of prognostic factors of human osteosarcoma with multivariate regression
GUO Qiao-nan,CHEN Yi-sheng
(Department of Pathology, Third Military Medical University, Chongqing 400038)
Abstract Objective: To analyze the prognostic significance of sex,age,tumor site,tumor size,mitotic count,DNA content AgNORs count,PCNA grading,KiS1 grading and mast cell count for osteosarcoma with multivariate regression. Methods: Univariate analysis including Kaplan-Meier survival curve and Log-rank test and multivariate analysis including multivariate linear regression and multivariate partial regression were used.Results: A significant regression equation was obtained as following:F=12.575. r=0.7134 and P<0.0001. Partial regression revealed that the most useful prognostic factors for osteosarcoma were DNA ploidy and DI value,tumor size, tumor site,KiS1 grading and AgNORs count.Conclusion:Certain indices denoting the activity of cellular proliferation of osteosarcoma are useful to its prognosis.
, 百拇医药
Key words osteosarcoma;multivariate regression;prognosis
迄今为止，对骨肉瘤的治疗方法尚不够理想。其病死率及致残率皆较高[1，2]。因而对骨肉瘤预后影响因素的研究更显重要。我们应用多元线性回归及多元逐步回归检验对影响骨肉瘤预后的11项指标进行了分析，报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
收集1978～1994年间我校附一、二院及重庆市肿瘤医院骨肉瘤患者共96例，均为有完整随访资料的存档蜡块。
1.2 方法
1.2.1 组织学观察及分型标准
, 百拇医药
采用WHO 1993年骨肿瘤分型标准。核丝分裂像计数为每10个高倍视野(40×10)中核分裂像。
1.2.2 细胞核DNA染色及图像分析方法
DNA染色采用Feulgen染色法。应用CMIAS真彩色图像分析系统，综合采用图像分割及交互分割方法。以同切片中的间质细胞或淋巴细胞作为二倍体DNA含量的对照值，测定结果以DNA含量为横坐标，细胞数为纵坐标，自动绘出每个标本细胞核DNA含量直方图，并绘出每例的2倍体，3倍体，>5倍体各自百分率及分析细胞/淋巴细胞平均积分光密度值(DI)。
1.2.3 AgNORs染色及观察方法
采用胶质银染色，油镜下观察，每例取100个肿瘤细胞核内AgNORs总数，再换算成每个细胞核内AgNORs平均数。
1.2.4 单克隆抗体SP免疫组化染色方法及判断标准
, 百拇医药
PCNA单克隆抗体PC-10(工作浓度1∶50)及S-P试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，KiS1单克隆抗体(工作浓度1∶10 000)由德国Kiel大学Kreipe教授惠赠。
细胞核呈黄色至棕色染色为阳性，计算整张切片阳性细胞分布数，按百分比计数，阳性细胞数<50%定为低分级(Low grade, L)，阳性细胞数>50%定为高分级(High grade, H)。
1.2.5 肥大细胞染色方法
采用甲苯胺蓝法。
1.3 统计学方法
单因素分析法：Log-rank时序检验法；多因素分析法：多元线性回归和多元逐步回归。采用我校数学教研室医用统计程序包SPMR。
2 结果
, 百拇医药
2.1 一般情况
96例骨肉瘤患者中男性63例，女性33例，男女之比为1.91∶1。年龄范围9～58岁。中位年龄21岁，高发年龄组为20～29岁。随访时间1～18年。平均为3.3年。3年生存率为51.04%(49/96)，总生存率为44.79%(43/96)。
2.2 单因素分析
将选取的11个观察指标(见表1)逐个用Log-rank检验方法进行检验，以上各指标均对预后的判断有意义(P<0.05,P<0.01)[6]。
表1 预后因素分析变量及赋值
Tab 1 Prognostic factors and their values Variables
, 百拇医药 Meanings
Values
X
Prognosis
Death=1 Survival=2
X1
Sex
Female=1 Male=2
X2
Age
<30=1 ≥30=2
X3
, 百拇医药
Site
Typical site=1 Atypical site=2
X4
Typing
Classical type=1 MFH-like=2
Small cell type=3 Giant cell type=4
X5
Size
<10 cm=1 ≥10 cm=2
X6
, 百拇医药
Mitotic count
≤5=1 >5=2(/10HFPs)
X7
DNA index
1 for DI=1 2 for DI=2
3 for DI=3 4 for DI=4
X8
AgNORs count
<3.5=1 ≥3.5=2
X9
, 百拇医药
PCNA count
L=1 H=2
X10
KiS1 count
L=1 H=2
X11
Mast cell count
<5=1 ≥5=2 (/10HFPs)
2.3 多因素分析
从96例人骨肉瘤Kaplan-Meier生存曲线看，患者多于3年内死亡，所以采用3年生存率为标准[3]。预后因素分析变量及赋值见表1。
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得如下多元直线回归方程：
Y=2.6574-0.2166X1+0.1462X2+0.1028X3-0.0044X4
-0.2333X5+0.020X6-0.1752X7-0.1187X8
-0.1113X9-0.1080X10+0.0926X11
该方程的复相关系数为0.7134,F=12.575,P<0.0001。方程有非常显著的意义。作偏相关系数的显著性检验，结果见表2。表2 多元直线回归各因素偏回归系数及其显著性检验
, 百拇医药
Tab 2 Multivariate partial regression and significant test Variables
Partial regression
F
P
X1
-0.2613
6.155
0.0151
X2
0.1854
2.989
, 百拇医药
0.0875
X3
0.2003
3.513
0.0644
X4
-0.0167
0.023
0.8793
X5
-0.2929
7.882
, 百拇医药
0.0062
X6
-0.0275
0.063
0.8019
X7
-0.4696
23.766
<0.0001
X8
-0.1577
2.141
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0.1471
X9
-0.1440
1.780
0.1858
X10
-0.1424
1.739
0.1908
X11
0.1042
0.922
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0.3398
X5和X7(即肿瘤大小和DNA含量)的偏相关系数有非常显著的统计学意义(P<0.01),X1(性别)有显著的统计学意义(P<0.05)。作逐步回归分析，将显著性检验F值定为F>4，共有6个变量进入方程。
Y=2.6452-0.2460X1+0.1700X2+0.1099X3-0.2637X5
-0.1729X7-0.1949X8
复相关系数为0.7220,F=16.1515,P<0.0001方程有非常显著的意义。各自变量对Y的作用见表3。
, 百拇医药 表3 多元逐步回归自变量X对Y的作用
Tab 3 The actions of variables X of multivariate
regression on Y Selected variables
F ratio
Important rank
X7
42.3936
1
X8
8.8857
, 百拇医药
2
X5
6.5144
3
X2
7.9548
4
X1
6.6932
5
X3
4.5819
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6
3 讨论 找寻一个对骨肉瘤预后判断有意义的模型一直是骨科医师与临床病理医师共同努力的目标[4]。我们对11项常用的临床与病理指标进行统计学处理，得到一个有非常显著意义的多元直线回归方程，其中偏相关系数与预后的线性关系有统计学意义的变量有DNA含量，肿瘤大小及性别。作逐步回归发现对预后有明确影响的因素有性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小，DNA含量及AgNORs计数。本组资料表明，年龄小于30岁，男性患者，发生于典型部位者(近膝关节)，以及肿瘤直径大于10 cm者的预后差。为什么在单因素分析中有统计学意义的PCNA、KiS1及肥大细胞计数在多因素分析中反而无意义了呢?我们认为，PCNA、KiS1计数与DNA含量及AgNORs计数间存在线性相关性(都反映肿瘤细胞增殖活性)，其作用可能部分或完全地被DNA含量代替，在多元分析中被掩盖。肥大细胞计数在单因素中的分析显示有显著意义，但在多元直线回归和逐步回归中皆无显著意义。因此将其作为判断预后的手段恰当与否。还需作进一步的资料积累和证实。
, 百拇医药
从以上模型可知，肿瘤患者的预后主要取决于肿瘤本身的恶性程度和增殖能力，DNA含量测定及图像分析，AgNORs计数方法简便，快捷、重复性好，尤其是DNA含量图像分析不受形态学改变的影响，在同一肿瘤中的值是恒定的，使其更具优越性。而PCNA，KiS1常规免疫组化染色也可作为一项补充手段来测定肿瘤增殖活性[5，6]，既然肿瘤大小是判断预后的明确因素，对肿瘤直径的测量也是必要的。
Cox回归模型是一种半参数生存分析数学模型，是生存分析中理论较为完善、应用最广泛的统计方法。我们国内随着计算机的推广应用也开始应用Cox模型进行预后分析。但我校目前还未建立此软件，不能开展此项工作。Davis等[1]对上百篇有关骨肉瘤预后的文章进行分析评述，不论是单因素分析，还是多因素分析，结果都不尽相同。我们采用多元直线回归和多元逐步回归模型，从某种程度上损失了截尾数据这个协变量的信息。但在没有Cox回归软件的情况下，采用Kaplan-Mier生存曲线，log-rank时序检验有意义的一些单因素进行多元直线回归和多元逐步回归，其结果仍有一定的临床意义。
, 百拇医药
作者简介：郭乔楠，女，1964.08.05生，湖南省桃源县人，博士，副教授，主要从事肿瘤病理方面的研究，发表论文10余篇。电话：(023)68753291
参考文献
[1] Davis A M, Bell R S, Goodwin P J. Prognostic Factors in osteosarcoma: A critical review[J]. J Clin Oncol,1994,12(2):423-431.
[2] Glasser D B, Lane J M, Huros A G, et al. Survival, prognosis and therapeutic response in osteogenic sarcoma[J],Cancer,1992,69(3):698-701.
[3] 郭乔楠，陈意生.96例人骨肉瘤预后影响因素的研究[J].第三军医大学学报，1999，21(2)：116-118.
, 百拇医药
[4] Wisman P, Enneking W F, Roesner A, et al. Local growth and the prognosis of osteosarcoma[J]. Int Orthopaed,1992,16(1):55-58.
[5] Linden M D, Torres F X, Kwbus J, et al. Clinical Application of morphologic and immunocytochemical assessments of cell proliferation[J]. Am J Clin Pathol,1992,97(5):s4-s13.
[6] Quinn C M, Wright N A. The clinical assessment of proliferation and growth in human tumors: Evaluation of methods and applications as prognostic variables[J]. J Pathol,1990;160(1):93-102.
收稿日期：1998-12-22；修回日期：1999-09-28, http://www.100md.com