抗病毒红藻多糖的提取与测定
作者：张斌 陈家童 白玉华 耿运琪
单位：(张斌)天津医科大学药学院(300203)；(陈家童 白玉华 耿运琪)南开大学生命科学院
关键词：红藻多糖；抗病毒；硫酸酯化多糖；艾滋病
中草药991207摘 要 从我国沿海红藻中提取的粗多糖，经DEAE-纤维素柱层析得到红藻多糖RP1，实验证实有明显抗病毒作用。通过气相色谱、红外光谱、Yaphe测定方法，证明红藻多糖RP1含硫酸基是一种硫酸酯化多糖，其单糖组成为半乳糖和3，6-内醚半乳糖，定量分析含量分别为：半乳糖70.04%、3，6-内醚半乳糖9.56%、硫酸基17.30%。
Extraction and Characterization of a Virus Inhibitor,Sulfated Polysaccharides Extracted from
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Red Alga (Halymemin sinensis)
Zhang Bin Chen Jiatong Bai Yuhua et al.
(College of Pharmacy, Tianjin University of Medical Sciences, Tianjin 300203)
Abstract A rhodophyta polysaccharide (RP1) was extracted and purified from red alga, Halymemin sinensis Tseng et. C.F.. Its chromatographic behavior and chemical properties suggested that it is a sulfated polysaccharide composed of galactose 70.44%, sulfonate 17.30% and 3,6-anhydrogalactose 9.56%. Pharmacological screening proved that RP1 is a virus inhibitor.
, 百拇医药
Key words rhodophyta polysaccharide (RP1) virus inhibitor sulfated polysaccharide AIDS
多糖作为免疫促进剂在临床上已广泛应用。近年来研究发现多糖的衍生物特别是硫酸酯化多糖具有抗凝血作用[1]、抗病毒活性[2]，它在艾滋病(AIDS)治疗上的应用已得到证实[3]。我国对AIDS的防治工作刻不容缓，由于HIV基因组具有高度的可塑性，其病毒能不断产生变异株，开发有效的疫苗相当困难。因此，筛选具有明显治疗意义的药物尤为重要。
文献报道，从海藻中提取的红藻多糖为硫酸酯化多糖，是AMV和HIV的反相转录酶的抑制剂[4]。体外实验表明，红藻中提取的红藻多糖(RP1和RP2)，在细胞水平上能明显抑制牛免疫缺陷病毒BIV的生长，具有开发AIDS药物的前景[5]。笔者从我国沿海红藻中提取纯化得到红藻多糖(RP1)，并对其理化性质、成分进行了分析测定，为进一步开发利用红藻多糖提供依据。
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1 材料、仪器和试剂
1.1 材料：红藻 Halymenin sinensis Tseng et C.F. Chang 采自北戴河海滨。
1.2 仪器：Model-analectrfx-65型傅利叶红外光谱仪、岛津120-02紫外分光光度计、美国惠普公司 Hewlett Packard 5890A型气相色谱；氢火焰离子化检测器。
1.3 试剂：DEAE-Cellulose DE-32为Wha-tman产品，标准糖和其它化学试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 多糖的提取纯化：将采集的海藻漂白晾干后粉碎，加蒸馏水，100 ℃提取3 h，过滤后冷冻过夜。经醇沉后，以Sevage法[6]去蛋白，并透析3 h，再反复醇沉后，真空干燥即得到粗多糖。将粗多糖溶于蒸馏水中，DEAE-Cellulose装柱后，用0.01 mol/L乙酸缓冲液平衡，然后加样进行分段洗脱，逐步增加洗脱液中NaCl浓度(0.5，0.75，2.0 mol/L)，用部分收集器自动收集，蒽酮法检测，按吸收度合并、浓缩、透析后，得到3个组分HS Ⅰ、HS Ⅱ和HS Ⅲ，其中样品HS Ⅰ经实验证明具有抗病毒活性，将其命名为RP1。
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2.2 多糖的分析测定
2.2.1 多糖的定性检测：以甲醇法和蒽酮法进行检测。
2.2.2 紫外光谱分析：在200～400 nm区间进行紫外扫描。
2.2.3 单糖组分分析：①气相色谱分析：将样品加入2 mol/L HCL-甲醇密闭80 ℃水解24 h，蒸干溶剂后，制备糖脎衍生物，然后上机测定。气体流速：200 mL/min；柱温：190 ℃；检测器温度：250 ℃；气化室温度：250 ℃。②采用Yaphe法[7]，以半乳糖和果糖作为标准品。
2.2.4 多糖的化学结构分析[8]：①红外光谱分析：KBr压片法，在4 000～400 cm-1区间进行红外扫描。②采用Terho[9]法定量测定硫酸基的含量。
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3 结果与讨论
3.1 多糖的理化性质：红藻多糖RP1为白色粉末状，不溶于高浓度的乙醇、丙酮等有机溶剂。其溶液加入甲醇后出现白色浑浊，加蒽酮试剂后成蓝绿色，说明RP1为多糖。经紫外光谱检测，在260～280 nm处未见到核酸和蛋白质的吸收峰。经去蛋白后，在280 nm下检测，吸收度低于0.05，说明基本不含蛋白质杂质。
3.2 单糖的组成分析；气相色谱测定红藻多糖RP1，只检测出一个峰，与标准单糖的出峰时间比较，可知15.23 min为半乳糖的出峰时间(图1)。由此，可以推测出红藻多糖RP1主要由半乳糖组成。Yaphe法测定RP1，结果表明RP1由半乳糖和3，6-内醚半乳糖组成，经查标准曲线，其含量分别为70.04%和9.56%。据文献报道，3，6-内醚半乳糖对酸不稳定，当多糖经酸水解时，它就被破坏，所以气相色谱只检测出一个峰。由于IR分析和Yaphe法测定都证实了内醚半乳糖的存在，因此认为红藻多糖RP1组成单糖为半乳糖和3，6-内醚半乳糖。
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图1 红藻多糖RP1的气相色谱图
3.3 多糖的化学结构分析：IR图谱可见，在3 600～3 200 cm-1，1 400～1 200 cm-1有两组峰，表明了RP1为糖类化合物。3 600～3 200 cm-1吸收是O-H伸缩振动，存在分子间和分子内氢键；1 400～1 200 cm-1的吸收峰是C-H变角振动；1 200～1 000 cm-1区段的吸收峰是吡喃糖环醚键(C-O-C)和羟基的吸收，说明多糖中内醚糖的存在。858 cm-1处的吸收峰为硫酸基-O-SO3-的C-O-S伸缩振动而形成；1 256 cm-1处的吸收峰系硫酸基-O-SO3的S=O伸缩振动造成的，均证实了硫酸根基团的存在，说明RP1为硫酸酯化多糖。Terho法定量测定，经查标准曲线得出的硫酸基含量为17.30%(表1)。
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表1 红藻多糖RP1的组成成分 半乳糖(%)
3，6-内醚半乳糖(%)
硫酸基(%)
70.04
9.56
17.30
实验结果表明，红藻多糖RP1是一种含硫酸基的硫酸酯化多糖，检出组成的单糖及其百分含量比为半乳糖∶3，6-内醚半乳糖 70.4∶9.56(表1)。我们先前实验证明它对BIV的生长有较强的抑制作用，这与国外对其它的硫酸酯化多糖抗HIV的研究结果一致。牛免疫缺陷病毒抗艾滋病药物筛选模型的运用[10]，初步证实了红藻多糖RP1在治疗AIDS方面具有良好的前景。
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由于Halymenin sinensis Tseng et C.F. Chang 为我国沿海常见藻类，且红藻多糖RP1提取方法简便易行，这就为开发新的抗病毒药物，研制我国自己的抗AIDS药物提供了新的资源。所以，这一方面的研究具有重要意义。另外，红藻多糖抗病毒的作用机理还有待于进一步研究。
参考文献
1 Hatanaka K, et al. J Med Chem， 1987, 30:810
2 Baba M. J Infect Dis, 1990, 142:407
3 Wagner W H. Arzneim-Forsch Drug Res, 1989,39:1
4 Hideki N, et al. Antimicrobial Agents and Chemoth-erapy, 1987,31:1524
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5 陈家童，等.南开大学学报(自然科学版)，1998，4：26
6 Staub A M. Methods in Carbohydr Chem, 1965,5:5
7 Yaphe W, et al. Analytical Biochemistry, 1965 13:143
8 张维杰主编.复合多糖生化技术.上海：上海科学技术出版社，1987：121
9 Terho T, et al. Analytical Biochemistry, 1971, 41:471
10 王岱，等.中国药理学与毒理学杂志，1996，1：49
收稿日期：1999-01-14, http://www.100md.com
单位：(张斌)天津医科大学药学院(300203)；(陈家童 白玉华 耿运琪)南开大学生命科学院
关键词：红藻多糖；抗病毒；硫酸酯化多糖；艾滋病
中草药991207摘 要 从我国沿海红藻中提取的粗多糖，经DEAE-纤维素柱层析得到红藻多糖RP1，实验证实有明显抗病毒作用。通过气相色谱、红外光谱、Yaphe测定方法，证明红藻多糖RP1含硫酸基是一种硫酸酯化多糖，其单糖组成为半乳糖和3，6-内醚半乳糖，定量分析含量分别为：半乳糖70.04%、3，6-内醚半乳糖9.56%、硫酸基17.30%。
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Red Alga (Halymemin sinensis)
Zhang Bin Chen Jiatong Bai Yuhua et al.
(College of Pharmacy, Tianjin University of Medical Sciences, Tianjin 300203)
Abstract A rhodophyta polysaccharide (RP1) was extracted and purified from red alga, Halymemin sinensis Tseng et. C.F.. Its chromatographic behavior and chemical properties suggested that it is a sulfated polysaccharide composed of galactose 70.44%, sulfonate 17.30% and 3,6-anhydrogalactose 9.56%. Pharmacological screening proved that RP1 is a virus inhibitor.
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Key words rhodophyta polysaccharide (RP1) virus inhibitor sulfated polysaccharide AIDS
多糖作为免疫促进剂在临床上已广泛应用。近年来研究发现多糖的衍生物特别是硫酸酯化多糖具有抗凝血作用[1]、抗病毒活性[2]，它在艾滋病(AIDS)治疗上的应用已得到证实[3]。我国对AIDS的防治工作刻不容缓，由于HIV基因组具有高度的可塑性，其病毒能不断产生变异株，开发有效的疫苗相当困难。因此，筛选具有明显治疗意义的药物尤为重要。
文献报道，从海藻中提取的红藻多糖为硫酸酯化多糖，是AMV和HIV的反相转录酶的抑制剂[4]。体外实验表明，红藻中提取的红藻多糖(RP1和RP2)，在细胞水平上能明显抑制牛免疫缺陷病毒BIV的生长，具有开发AIDS药物的前景[5]。笔者从我国沿海红藻中提取纯化得到红藻多糖(RP1)，并对其理化性质、成分进行了分析测定，为进一步开发利用红藻多糖提供依据。
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1 材料、仪器和试剂
1.1 材料：红藻 Halymenin sinensis Tseng et C.F. Chang 采自北戴河海滨。
1.2 仪器：Model-analectrfx-65型傅利叶红外光谱仪、岛津120-02紫外分光光度计、美国惠普公司 Hewlett Packard 5890A型气相色谱；氢火焰离子化检测器。
1.3 试剂：DEAE-Cellulose DE-32为Wha-tman产品，标准糖和其它化学试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 多糖的提取纯化：将采集的海藻漂白晾干后粉碎，加蒸馏水，100 ℃提取3 h，过滤后冷冻过夜。经醇沉后，以Sevage法[6]去蛋白，并透析3 h，再反复醇沉后，真空干燥即得到粗多糖。将粗多糖溶于蒸馏水中，DEAE-Cellulose装柱后，用0.01 mol/L乙酸缓冲液平衡，然后加样进行分段洗脱，逐步增加洗脱液中NaCl浓度(0.5，0.75，2.0 mol/L)，用部分收集器自动收集，蒽酮法检测，按吸收度合并、浓缩、透析后，得到3个组分HS Ⅰ、HS Ⅱ和HS Ⅲ，其中样品HS Ⅰ经实验证明具有抗病毒活性，将其命名为RP1。
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2.2 多糖的分析测定
2.2.1 多糖的定性检测：以甲醇法和蒽酮法进行检测。
2.2.2 紫外光谱分析：在200～400 nm区间进行紫外扫描。
2.2.3 单糖组分分析：①气相色谱分析：将样品加入2 mol/L HCL-甲醇密闭80 ℃水解24 h，蒸干溶剂后，制备糖脎衍生物，然后上机测定。气体流速：200 mL/min；柱温：190 ℃；检测器温度：250 ℃；气化室温度：250 ℃。②采用Yaphe法[7]，以半乳糖和果糖作为标准品。
2.2.4 多糖的化学结构分析[8]：①红外光谱分析：KBr压片法，在4 000～400 cm-1区间进行红外扫描。②采用Terho[9]法定量测定硫酸基的含量。
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3 结果与讨论
3.1 多糖的理化性质：红藻多糖RP1为白色粉末状，不溶于高浓度的乙醇、丙酮等有机溶剂。其溶液加入甲醇后出现白色浑浊，加蒽酮试剂后成蓝绿色，说明RP1为多糖。经紫外光谱检测，在260～280 nm处未见到核酸和蛋白质的吸收峰。经去蛋白后，在280 nm下检测，吸收度低于0.05，说明基本不含蛋白质杂质。
3.2 单糖的组成分析；气相色谱测定红藻多糖RP1，只检测出一个峰，与标准单糖的出峰时间比较，可知15.23 min为半乳糖的出峰时间(图1)。由此，可以推测出红藻多糖RP1主要由半乳糖组成。Yaphe法测定RP1，结果表明RP1由半乳糖和3，6-内醚半乳糖组成，经查标准曲线，其含量分别为70.04%和9.56%。据文献报道，3，6-内醚半乳糖对酸不稳定，当多糖经酸水解时，它就被破坏，所以气相色谱只检测出一个峰。由于IR分析和Yaphe法测定都证实了内醚半乳糖的存在，因此认为红藻多糖RP1组成单糖为半乳糖和3，6-内醚半乳糖。
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图1 红藻多糖RP1的气相色谱图
3.3 多糖的化学结构分析：IR图谱可见，在3 600～3 200 cm-1，1 400～1 200 cm-1有两组峰，表明了RP1为糖类化合物。3 600～3 200 cm-1吸收是O-H伸缩振动，存在分子间和分子内氢键；1 400～1 200 cm-1的吸收峰是C-H变角振动；1 200～1 000 cm-1区段的吸收峰是吡喃糖环醚键(C-O-C)和羟基的吸收，说明多糖中内醚糖的存在。858 cm-1处的吸收峰为硫酸基-O-SO3-的C-O-S伸缩振动而形成；1 256 cm-1处的吸收峰系硫酸基-O-SO3的S=O伸缩振动造成的，均证实了硫酸根基团的存在，说明RP1为硫酸酯化多糖。Terho法定量测定，经查标准曲线得出的硫酸基含量为17.30%(表1)。
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表1 红藻多糖RP1的组成成分 半乳糖(%)
3，6-内醚半乳糖(%)
硫酸基(%)
70.04
9.56
17.30
实验结果表明，红藻多糖RP1是一种含硫酸基的硫酸酯化多糖，检出组成的单糖及其百分含量比为半乳糖∶3，6-内醚半乳糖 70.4∶9.56(表1)。我们先前实验证明它对BIV的生长有较强的抑制作用，这与国外对其它的硫酸酯化多糖抗HIV的研究结果一致。牛免疫缺陷病毒抗艾滋病药物筛选模型的运用[10]，初步证实了红藻多糖RP1在治疗AIDS方面具有良好的前景。
, http://www.100md.com
由于Halymenin sinensis Tseng et C.F. Chang 为我国沿海常见藻类，且红藻多糖RP1提取方法简便易行，这就为开发新的抗病毒药物，研制我国自己的抗AIDS药物提供了新的资源。所以，这一方面的研究具有重要意义。另外，红藻多糖抗病毒的作用机理还有待于进一步研究。
参考文献
1 Hatanaka K, et al. J Med Chem， 1987, 30:810
2 Baba M. J Infect Dis, 1990, 142:407
3 Wagner W H. Arzneim-Forsch Drug Res, 1989,39:1
4 Hideki N, et al. Antimicrobial Agents and Chemoth-erapy, 1987,31:1524
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5 陈家童，等.南开大学学报(自然科学版)，1998，4：26
6 Staub A M. Methods in Carbohydr Chem, 1965,5:5
7 Yaphe W, et al. Analytical Biochemistry, 1965 13:143
8 张维杰主编.复合多糖生化技术.上海：上海科学技术出版社，1987：121
9 Terho T, et al. Analytical Biochemistry, 1971, 41:471
10 王岱，等.中国药理学与毒理学杂志，1996，1：49
收稿日期：1999-01-14, http://www.100md.com