抑癌基因P16蛋白在大肠腺癌组织中的表达及意义
作者：王青 吴金生 赖大年 马庆久 潘伯荣
单位：中国人民解放军第四军医大学唐都医院普通外科 陕西省西安市 710038
关键词：肿瘤抑制基因；结直肠肿瘤；免疫组织化学
摘 要 目的 探讨P16蛋白在大肠癌发生发展中的作用及其意义
摘 要 目的 探讨P16蛋白在大肠癌发生发展中的作用及其意义.方法 应用免疫组织化学方法检测56例大肠癌，15例正常结肠组织中P16蛋白的表达情况，并分析其意义.结果 大肠癌组织中阳性率(33.8%)低于正常对照结肠组织中的阳性率(73.3%)，差异非常显著(P<0.01).P16蛋白的表达与肿瘤分化程度及Dukes分期相关(P<0.05).结论 P16蛋白在大肠癌的发生发展中起重要作用，反映肿瘤恶性程度和肿瘤进展情况.
, http://www.100md.com 中国图书馆分类号 R735.34
Expression and significance of P16 protein in colorectal adenocarcinoma
WANG Qing，WU Jin-Sheng，LAI Da-Nian，MA Qing-Jiu and PAN Bo-Rong
(Department of General Surgery，Tangdu Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi＇an 710038，Shaanxi Province，China)
Abstract AIM To illustrate the role and significance of P16 protein in the occurrence and development of colorectal carcinoma.METHODS The expression of P16 protein was studied immunohistochemically in 56 patients with colorectal carcinoma and 15 cases of normal colon tissue.RESULTS The positive rate of P16 protein in colorectal carcinoma (33.85%) was significantly lower than that in normal tissue (73.3%，P<0.01).The loss of P16 protein expression was associated with differentiation of carcinoma and Duke＇s grade (P<0.05).CONCLUSION P16 protein takes a key role in occurrence and development of colorectal carcinoma and is an indicator of malignancy and development of tumor.
, 百拇医药
Subject headings tumor suppression gene; colorectal neoplasms; immunohistochemistry
0 引言
多肿瘤抑制基因(MTS1)的表达产物P16蛋白作为细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制物，使得Rb蛋白磷酸化受阻，细胞不能由G1期进入S期，进而抑制细胞增殖.关于该基因的研究日益深入，但其与大肠癌关系目前报道较少.为了探讨P16蛋白的表达在大肠癌中的意义，对65例大肠癌及15例正常组织石蜡切片用免疫组化方法进行检测.
1 材料和方法
1.1 材料 收集我院1993/1995经手术证实的65例大肠癌及15例正常结肠组织.标本经100mL/L甲醛固定，常规石蜡包埋.其中腺癌48例，粘液细胞癌6例，胶样癌5例，其他6例.本研究只统计腺癌，其中高分化腺癌30例，中分化和低分化腺癌分别为13例和5例.Dukes分期中A期14例，B期20例，C期11例，D期3例.兔抗人P16多克隆抗体及S-P免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术公司.
, http://www.100md.com
1.2 方法 4μm厚度的连续切片两张，1张行HE染色复查诊断，1张行免疫组化研究.用常规S-P法进行免疫组化染色.阳性对照用乳腺癌阳性标本，以PBS代替一抗作为阴性对照.胞质中出现棕黄色颗粒记为阳性.
统计学处理 采用χ2检验.
2 结果
2.1 P16蛋白在大肠癌及正常对照组织中的表达 大肠癌及正常对照组织中P16蛋白表达的阳性率分别为33.8%和73.3%，正常对照组织中P16的阳性率高于大肠癌组织(P<0.01，表1).
表1 P16蛋白在大肠癌及正常对照组织中的表达 (n,%)
分组
n
, 百拇医药
P16蛋白表达
阳性率(%)
-
+
大肠癌
65
43
22
33.8
正常结肠组织
15
4
11
, 百拇医药
73.3
P<0.01，vs大肠癌.
2.2 P16蛋白表达与大肠癌病理类型的关系 腺癌组织中P16蛋白阳性率35.4%，在粘液细胞癌，胶样癌及其他类型癌组织中P16阳性率分别为33.3%，40.0%和16.7%，腺癌与其他3组病理类型间比较，差异无显著意义(P<0.5，表2).
表2 P16蛋白表达与大肠癌病理类型的关系 (n,%)
分组
n
P16蛋白表达
阳性率(%)
-
, http://www.100md.com
+
腺癌
48
31
17
35.4
粘液细胞癌
6
4
2
33.3
胶样癌
5
3
, http://www.100md.com
2
40.0
其他
6
5
1
16.7
2.3 P16蛋白表达与腺癌分化程度的关系 P16蛋白在高、中、低分化腺癌中表达的阳性率分别为46.7%，23.1%和0.在高分化腺癌和低分化腺癌间，阳性率差异有显著意义(P<0.05，表3).表3 P16蛋白表达与大肠癌腺癌分化程度的关系 (n,%)
分组
n
, http://www.100md.com P16蛋白表达
阳性率(%)
-
+
高分化腺癌
30
16
14
46.7
中分化腺癌
13
10
3
, http://www.100md.com 23.1
低分化腺癌
5
5
0
0.0
P<0.05，vs低分化.
2.4 P16蛋白表达与大肠癌Dukes分期的关系 在48例腺癌中，Dukes分期各期阳性率分别为42.9%，45.0%，18.2%和0.在A，B期与C，D期间，差异有显著意义(P<0.05，表4)，即在病程较早期的阳性率高于病程晚期.
表4 P16蛋白表达与腺癌Dukes分期的关系 (n,%)
分期
, http://www.100md.com
n
P16蛋白表达
阳性率(%)
-
+
A期
14
8
6
42.9
B期
20
11
, 百拇医药 9
45.0
C期
11
9
2
18.2
D期
3
3
0
0.0
P<0.05，vs C，D期.
, 百拇医药 3 讨论
细胞周期负调控与抑癌基因密切相关.P16蛋白作为CDK的抑制物，当同细胞周期素D(cyclin D)竞争与CDK4结合后，抑制其活性，使CDK4不能催化Rb蛋白磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞分裂生长.因此当P16蛋白失表达时，可能是肿瘤细胞逃避负性调控成为恶性生长的重要环节[1-5].进一步的研究表明P16INK4编码的蛋白是CDK4的抑制因子，直接调控细胞增殖周期[6].在间皮瘤细胞(M9k)等3株细胞系中，转染表达P16INK4 cDNA的载体后，其克隆形成效率受到抑制，但在结肠癌细胞系DLD-1中并未发现生长受到抑制[7,8].在几种主要的p16基因失活机制中，目前尚未发现在结肠癌中有纯合性缺失或杂合性缺失.Herman et al[9]分析了13株结肠癌细胞后发现92%(12/13)的结肠癌细胞存在p16基因5＇CpG岛从头甲基化，但在乳腺癌、前列腺癌和肾癌细胞中，5＇CpG岛从头(de novo)甲基化率分别为33%，60%和23%.在原发肿瘤中，40%(8/20)的结肠癌亦表现出5＇CpG岛从头甲基化，而正常对照组织未发现甲基化存在.因此p16基因5＇CpG岛从头甲基化是结肠癌中该基因失活的主要或唯一方式[9-11].由此不能正常转录、翻译出抑癌蛋白，而无法发挥抑癌作用.
, http://www.100md.com
我们应用S-P免疫组化染色方法检测了65例大肠癌和15例正常结肠组织中P16蛋白的表达，其中48例腺癌的阳性表达率为35.4%.本结果提示，P16蛋白的失表达与大肠癌分化程度和Dukes分期相关，与肿瘤发生类型无关.在正常对照组织P16阳性表达率高于肿瘤组织的表达，并随着肿瘤分化程度的降低，其蛋白表达下降，在低分化腺癌，P16蛋白几乎无表达.表明肿瘤阳性表达与肿瘤分化程度关系密切.Dukes分期各期间虽无明显差异，但A，B期与C，D期间的阳性率差异显著，表明随着肿瘤的生长，浸润和转移，其P16蛋白表达的阳性率降低.即在病程的较早期阳性表达高于病程晚期，提示P16蛋白的失表达或弱阳性的病例更具转移性，并反映肿瘤的进展情况，间或提示与预后有一定的关系，但由于缺乏随访资料，尚有待进一步研究.
总之，由于p16基因甲基化的发生，使得其在大肠癌中的表达远远低于其他恶性肿瘤.这或许是大肠癌独特的致癌机制所致，尚有许多问题需要进一步的研究.
作者简介：王青，男，1965-03-02生，河南省扶沟县人，汉族.1989年第四军医大学空医系本科毕业，1996年第四军医大学硕士，主治医师，讲师，主要从事胃肠道肿瘤的诊治研究，发表论文3篇.
, 百拇医药
通讯作者 潘伯荣，710033，世界胃肠病学杂志西安及海外编辑部，陕西省西安市长乐西路17号，中国人民解放军第四军医大学621楼12室.
Tel.+86.29.3224890，Rax.+86.29.3224890
Email.pan-br.@fmmu.edu.cn
Email.panbr.@pub.xaonline.com
参考文献
1 Kamb A，Gruis NA，Weaver Feldhaus J，Liu Q，Harshman K，Tavtigian SV，Stockert E，Day RS 3rd，Johnson BE，Skolnick MH.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science，1994;264:436-440
, 百拇医药
2 Nobori T，Miura K，Wu DJ，Lois A，Takabayashi K，Carson DA.Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature，1994;368:753-756
3 Marx J.A challenge to p16 gene as a major tumor suppressor.Science，1994;264:1846
4 Marx J.How cells cycle toward cancer.Science，1994;26:319-321
5 Marx J.New tumor suppressor may rival P53.Science，1994;264:344-345
, 百拇医药
6 Spillare EA，Okamoto A，Hagiwara K，Demetrick DJ，Serrano M，Beach D，Harris CC.Suppression of growth in vitro and tumorigenicity in vivo of human carcinoma cell lines by transfected P16INK4.Mol Carcinog，1996;16:53-60
7 Lois AF,Rosenbach M,Miura K，Michimata H，Carson DA，Nobori T.Structural-functional analysis of the P16 tumor suppressor.Cancer Res，1995;36(Suppl):575
8 Spillare EA，Okamoto A，Hussain SP，Serrano M，Beach D，Harris CC.Transfected P16INK4 suppresses in vitro growth of human tumor cell lines.Cancer Res，1995;36(Suppl):200
, 百拇医药
9 Herman JG，Merlo A，Mao L，Lapidus RG，Issa JP，Davidson NE，Sidransky D，Baylin SB.Inactivation of the CDK2/P16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers.Cancer Res，1995;55:4525-4530
10 Gonzalez Zulueta M，Bender CM，Yang AS，Nguyen T，Beart RW，Van Tornout JM，Jones PA.Methylation of the 5＇CpG island of the P16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.Cancer Res，1995;55:4531-4535
11 Ahuja N，Mohan AL，Li Q，Stolker JM，Herman JG，Hamilton SR，Baylin SB，Issa JP.Association between CpG island methylation and microsatellite instability in colorectal cancer.Cancer Res，1997;57:3370-3374
收稿日期 1999-09-31, 百拇医药
单位：中国人民解放军第四军医大学唐都医院普通外科 陕西省西安市 710038
关键词：肿瘤抑制基因；结直肠肿瘤；免疫组织化学
摘 要 目的 探讨P16蛋白在大肠癌发生发展中的作用及其意义
摘 要 目的 探讨P16蛋白在大肠癌发生发展中的作用及其意义.方法 应用免疫组织化学方法检测56例大肠癌，15例正常结肠组织中P16蛋白的表达情况，并分析其意义.结果 大肠癌组织中阳性率(33.8%)低于正常对照结肠组织中的阳性率(73.3%)，差异非常显著(P<0.01).P16蛋白的表达与肿瘤分化程度及Dukes分期相关(P<0.05).结论 P16蛋白在大肠癌的发生发展中起重要作用，反映肿瘤恶性程度和肿瘤进展情况.
, http://www.100md.com 中国图书馆分类号 R735.34
Expression and significance of P16 protein in colorectal adenocarcinoma
WANG Qing，WU Jin-Sheng，LAI Da-Nian，MA Qing-Jiu and PAN Bo-Rong
(Department of General Surgery，Tangdu Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi＇an 710038，Shaanxi Province，China)
Abstract AIM To illustrate the role and significance of P16 protein in the occurrence and development of colorectal carcinoma.METHODS The expression of P16 protein was studied immunohistochemically in 56 patients with colorectal carcinoma and 15 cases of normal colon tissue.RESULTS The positive rate of P16 protein in colorectal carcinoma (33.85%) was significantly lower than that in normal tissue (73.3%，P<0.01).The loss of P16 protein expression was associated with differentiation of carcinoma and Duke＇s grade (P<0.05).CONCLUSION P16 protein takes a key role in occurrence and development of colorectal carcinoma and is an indicator of malignancy and development of tumor.
, 百拇医药
Subject headings tumor suppression gene; colorectal neoplasms; immunohistochemistry
0 引言
多肿瘤抑制基因(MTS1)的表达产物P16蛋白作为细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制物，使得Rb蛋白磷酸化受阻，细胞不能由G1期进入S期，进而抑制细胞增殖.关于该基因的研究日益深入，但其与大肠癌关系目前报道较少.为了探讨P16蛋白的表达在大肠癌中的意义，对65例大肠癌及15例正常组织石蜡切片用免疫组化方法进行检测.
1 材料和方法
1.1 材料 收集我院1993/1995经手术证实的65例大肠癌及15例正常结肠组织.标本经100mL/L甲醛固定，常规石蜡包埋.其中腺癌48例，粘液细胞癌6例，胶样癌5例，其他6例.本研究只统计腺癌，其中高分化腺癌30例，中分化和低分化腺癌分别为13例和5例.Dukes分期中A期14例，B期20例，C期11例，D期3例.兔抗人P16多克隆抗体及S-P免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术公司.
, http://www.100md.com
1.2 方法 4μm厚度的连续切片两张，1张行HE染色复查诊断，1张行免疫组化研究.用常规S-P法进行免疫组化染色.阳性对照用乳腺癌阳性标本，以PBS代替一抗作为阴性对照.胞质中出现棕黄色颗粒记为阳性.
统计学处理 采用χ2检验.
2 结果
2.1 P16蛋白在大肠癌及正常对照组织中的表达 大肠癌及正常对照组织中P16蛋白表达的阳性率分别为33.8%和73.3%，正常对照组织中P16的阳性率高于大肠癌组织(P<0.01，表1).
表1 P16蛋白在大肠癌及正常对照组织中的表达 (n,%)
分组
n
, 百拇医药
P16蛋白表达
阳性率(%)
-
+
大肠癌
65
43
22
33.8
正常结肠组织
15
4
11
, 百拇医药
73.3
P<0.01，vs大肠癌.
2.2 P16蛋白表达与大肠癌病理类型的关系 腺癌组织中P16蛋白阳性率35.4%，在粘液细胞癌，胶样癌及其他类型癌组织中P16阳性率分别为33.3%，40.0%和16.7%，腺癌与其他3组病理类型间比较，差异无显著意义(P<0.5，表2).
表2 P16蛋白表达与大肠癌病理类型的关系 (n,%)
分组
n
P16蛋白表达
阳性率(%)
-
, http://www.100md.com
+
腺癌
48
31
17
35.4
粘液细胞癌
6
4
2
33.3
胶样癌
5
3
, http://www.100md.com
2
40.0
其他
6
5
1
16.7
2.3 P16蛋白表达与腺癌分化程度的关系 P16蛋白在高、中、低分化腺癌中表达的阳性率分别为46.7%，23.1%和0.在高分化腺癌和低分化腺癌间，阳性率差异有显著意义(P<0.05，表3).表3 P16蛋白表达与大肠癌腺癌分化程度的关系 (n,%)
分组
n
, http://www.100md.com P16蛋白表达
阳性率(%)
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高分化腺癌
30
16
14
46.7
中分化腺癌
13
10
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低分化腺癌
5
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0.0
P<0.05，vs低分化.
2.4 P16蛋白表达与大肠癌Dukes分期的关系 在48例腺癌中，Dukes分期各期阳性率分别为42.9%，45.0%，18.2%和0.在A，B期与C，D期间，差异有显著意义(P<0.05，表4)，即在病程较早期的阳性率高于病程晚期.
表4 P16蛋白表达与腺癌Dukes分期的关系 (n,%)
分期
, http://www.100md.com
n
P16蛋白表达
阳性率(%)
-
+
A期
14
8
6
42.9
B期
20
11
, 百拇医药 9
45.0
C期
11
9
2
18.2
D期
3
3
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0.0
P<0.05，vs C，D期.
, 百拇医药 3 讨论
细胞周期负调控与抑癌基因密切相关.P16蛋白作为CDK的抑制物，当同细胞周期素D(cyclin D)竞争与CDK4结合后，抑制其活性，使CDK4不能催化Rb蛋白磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞分裂生长.因此当P16蛋白失表达时，可能是肿瘤细胞逃避负性调控成为恶性生长的重要环节[1-5].进一步的研究表明P16INK4编码的蛋白是CDK4的抑制因子，直接调控细胞增殖周期[6].在间皮瘤细胞(M9k)等3株细胞系中，转染表达P16INK4 cDNA的载体后，其克隆形成效率受到抑制，但在结肠癌细胞系DLD-1中并未发现生长受到抑制[7,8].在几种主要的p16基因失活机制中，目前尚未发现在结肠癌中有纯合性缺失或杂合性缺失.Herman et al[9]分析了13株结肠癌细胞后发现92%(12/13)的结肠癌细胞存在p16基因5＇CpG岛从头甲基化，但在乳腺癌、前列腺癌和肾癌细胞中，5＇CpG岛从头(de novo)甲基化率分别为33%，60%和23%.在原发肿瘤中，40%(8/20)的结肠癌亦表现出5＇CpG岛从头甲基化，而正常对照组织未发现甲基化存在.因此p16基因5＇CpG岛从头甲基化是结肠癌中该基因失活的主要或唯一方式[9-11].由此不能正常转录、翻译出抑癌蛋白，而无法发挥抑癌作用.
, http://www.100md.com
我们应用S-P免疫组化染色方法检测了65例大肠癌和15例正常结肠组织中P16蛋白的表达，其中48例腺癌的阳性表达率为35.4%.本结果提示，P16蛋白的失表达与大肠癌分化程度和Dukes分期相关，与肿瘤发生类型无关.在正常对照组织P16阳性表达率高于肿瘤组织的表达，并随着肿瘤分化程度的降低，其蛋白表达下降，在低分化腺癌，P16蛋白几乎无表达.表明肿瘤阳性表达与肿瘤分化程度关系密切.Dukes分期各期间虽无明显差异，但A，B期与C，D期间的阳性率差异显著，表明随着肿瘤的生长，浸润和转移，其P16蛋白表达的阳性率降低.即在病程的较早期阳性表达高于病程晚期，提示P16蛋白的失表达或弱阳性的病例更具转移性，并反映肿瘤的进展情况，间或提示与预后有一定的关系，但由于缺乏随访资料，尚有待进一步研究.
总之，由于p16基因甲基化的发生，使得其在大肠癌中的表达远远低于其他恶性肿瘤.这或许是大肠癌独特的致癌机制所致，尚有许多问题需要进一步的研究.
作者简介：王青，男，1965-03-02生，河南省扶沟县人，汉族.1989年第四军医大学空医系本科毕业，1996年第四军医大学硕士，主治医师，讲师，主要从事胃肠道肿瘤的诊治研究，发表论文3篇.
, 百拇医药
通讯作者 潘伯荣，710033，世界胃肠病学杂志西安及海外编辑部，陕西省西安市长乐西路17号，中国人民解放军第四军医大学621楼12室.
Tel.+86.29.3224890，Rax.+86.29.3224890
Email.pan-br.@fmmu.edu.cn
Email.panbr.@pub.xaonline.com
参考文献
1 Kamb A，Gruis NA，Weaver Feldhaus J，Liu Q，Harshman K，Tavtigian SV，Stockert E，Day RS 3rd，Johnson BE，Skolnick MH.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science，1994;264:436-440
, 百拇医药
2 Nobori T，Miura K，Wu DJ，Lois A，Takabayashi K，Carson DA.Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature，1994;368:753-756
3 Marx J.A challenge to p16 gene as a major tumor suppressor.Science，1994;264:1846
4 Marx J.How cells cycle toward cancer.Science，1994;26:319-321
5 Marx J.New tumor suppressor may rival P53.Science，1994;264:344-345
, 百拇医药
6 Spillare EA，Okamoto A，Hagiwara K，Demetrick DJ，Serrano M，Beach D，Harris CC.Suppression of growth in vitro and tumorigenicity in vivo of human carcinoma cell lines by transfected P16INK4.Mol Carcinog，1996;16:53-60
7 Lois AF,Rosenbach M,Miura K，Michimata H，Carson DA，Nobori T.Structural-functional analysis of the P16 tumor suppressor.Cancer Res，1995;36(Suppl):575
8 Spillare EA，Okamoto A，Hussain SP，Serrano M，Beach D，Harris CC.Transfected P16INK4 suppresses in vitro growth of human tumor cell lines.Cancer Res，1995;36(Suppl):200
, 百拇医药
9 Herman JG，Merlo A，Mao L，Lapidus RG，Issa JP，Davidson NE，Sidransky D，Baylin SB.Inactivation of the CDK2/P16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers.Cancer Res，1995;55:4525-4530
10 Gonzalez Zulueta M，Bender CM，Yang AS，Nguyen T，Beart RW，Van Tornout JM，Jones PA.Methylation of the 5＇CpG island of the P16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.Cancer Res，1995;55:4531-4535
11 Ahuja N，Mohan AL，Li Q，Stolker JM，Herman JG，Hamilton SR，Baylin SB，Issa JP.Association between CpG island methylation and microsatellite instability in colorectal cancer.Cancer Res，1997;57:3370-3374
收稿日期 1999-09-31, 百拇医药