bcl-2基因在阻塞性黄疸大鼠肝组织细胞凋亡中作用的研究
作者：王剑明 邹倩 邹声泉
单位：同济医科大学附属同济医院外科 湖北省武汉市 430030
关键词：黄疸；肝；细胞凋亡；bcl-2基因
世界华人消化杂志991208
摘 要 目的 探讨阻塞性黄疸大鼠肝组织损害的机制.方法 用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)和免疫组织化学方法检测阻塞性黄疸大鼠肝脏组织细胞凋亡状态及凋亡相关基因bcl-2的表达.结果 胆总管结扎后，随结扎时间的延长细胞凋亡增加，结扎14d后细胞凋亡达高峰，凋亡指数(AI)达58.23±1.58，各组AI差异有显著性意义(P<0.05).在阻塞性黄疸过程中，bcl-2蛋白表达越强，AI就越少.结论 bcl-2蛋白参与了阻塞性黄疸肝组织中细胞凋亡的调节，并在阻塞性黄疸肝损害的发生和发展中起重要作用.
, 百拇医药
中国图书馆分类号 R575
The role of bcl-2 gene in apoptosis of liver in rat with obstructive jaundice
WANG Jian-Ming，ZOU Qian and ZOU Sheng-Quan
(Department of Surgery，Tongji Hospital，Tongji Medical University，Wuhan 430030，Hubei Province，China)
Abstract AIM To explore the mechanism of hepatic injury in obstructive jaundice (OJ).METHODS Forty adult male Wistar rats (190g-230g) were used in all experiments.All rats underwent laparotomy.Experimental obstructive jaundice (BDL) was induced by double ligation of the bile duct by a proximal ligature around the bile duct in the hilus of the liver and by a distal ligature close to its entry into the duodenum.The animals were randomly divided into two groups: those that underwent bile duct manipulation (sham operated) and those that underwent BDL for 3，7，14，and 21 days.We detected the serum bilirubin and pathological change of liver in all rats.Then we detected apoptotic status and the expression of apoptosis related bcl-2 gene protein in liver of all rats with terminal-deoxynucleotidyl mediated nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry method.RESULTS The apoptotic rate of liver is related to times of OJ.Apoptosis was highest 14-days after bile duct ligation，apoptotic index (AI) was 58.23±1.58 (P<0.05).The stronger the bcl-2 expression，the less number of apoptotic cells in OJ.The increase of bilirubin and pathological change of liver in OJ were obvious.CONCLUSION bcl-2 takes part in the regulation and occurrence and progression of hepatic injury in OJ.
, 百拇医药
Subject headings jaundice; liver; apoptosis; bcl-2 gene
0 引言
研究表明，细胞凋亡在人体组织细胞中普遍存在，它由基因编制程序控制，许多基因参与此调节过程，且人类许多疾病和病理生理现象都与细胞凋亡的紊乱有关，但阻塞性黄疸(阻黄)时肝组织细胞的凋亡及其基因调控目前知之甚少.我们用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)和免疫组织化学方法对阻黄大鼠肝脏细胞凋亡状态及凋亡相关基因bcl-2蛋白的表达进行了研究，以探讨阻黄肝损害的病理调控机制.
1 材料和方法
1.1 材料 阻塞性黄疸大鼠模型的建立：健康♂ Wistar大鼠，体重190g～230g，大鼠予以氯胺酮0.2mL/100g腹腔注射麻醉后，剑突下小切口进腹，游离出胆总管，于肝门部结扎胆总管并切断，远端再予以结扎.进腹后不结扎切断胆总管作为正常对照.结扎后分别于3,7,14,21d处死大鼠，每组8只.
, 百拇医药
1.2 方法 ①血清胆红素的测定：处死大鼠门静脉抽血，离心后取上层血清行胆红素测定.②阻黄大鼠肝脏组织病理改变的检查：处死大鼠肝组织标本甲醛固定，石蜡包埋，切取厚度4mm切片，常规脱蜡、脱水，HE染色，光镜下观察.③用TUNEL法进行阻黄大鼠肝脏组织切片细胞凋亡的原位检测：TUNEL试剂盒为德国宝灵曼公司提供.在TdT介导下，使生物素化的dUTP标记至DNA断裂后形成的3＇-OH端，借助生物素与亲合素的特异结合，使过氧化物酶连接至DNA断点，最后加入底物，通过DAB染色，可在显微镜下观察细胞核中棕黄着色的凋亡细胞.每例切片计数5个400倍视野，以平均每100个细胞核中含凋亡细胞个数作为凋亡指数(AI).④免疫组织化学实验参照SABC法.兔抗鼠bcl-2单克隆抗体、生物素标记羊抗鼠IgG由北京中山公司提供.石蜡切片，DAB染色，细胞质出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞，切片内无阳性细胞为阴性表达(-)，阳性细胞率小于1/3为弱阳性表达(+)，1/3～2/3为中阳性表达(++)，大于2/3为强阳性表达(+++).
统计学处理 所有数据均用算术均数±标准差(
±s)表示：所获数据采用同济医科大学统计教研室提供的SAS统计软件包行多元方差分析及组间比较.
, 百拇医药
2 结果
2.1 阻黄大鼠血清胆红素的变化 正常组及结扎后3，7，14，21d胆红素值分别为：1.95μmol/L±0.47μmol/L，74.65μmol/L±15.83μmol/L，104.21μmol/L±22.36μmol/L，127.25μmol/L±28.53μmol/L，142.16μmol/L±35.27μmol/L，逐渐增高.
2.2 光镜下阻黄大鼠肝脏的病理改变 胆总管结扎3d即见肝内胆管扩张，偶见肝细胞结构改变，可见少量细胞凋亡，表现为细胞质浓缩，核染色质向核仁或核周边聚集；结扎7d，细胞凋亡增加，肝细胞部分变性，肝细胞内或细胞间瘀胆，纤维组织增生，胆小管扩张及中度增生，胆栓形成；结扎14d，细胞凋亡达到高峰，大范围的汇管区周围肝细胞变性，纤维组织增生向肝小叶内扩展；结扎21d，细胞凋亡有所减少，可见成片的肝细胞结构改变及胆湖形成，纤维组织带增宽，肝脏结构广泛改变，肝细胞数目明显减少.
, 百拇医药
2.3 阻黄大鼠肝组织切片TUNEL检测结果 DAB染色后，凋亡细胞核呈棕黄色，核呈固缩状、或染色质向周边聚集、或呈核碎片状(图1).正常大鼠肝组织偶见细胞凋亡，结扎3d即见细胞凋亡增加，结扎7d明显增加，14d后镜下视野见广泛细胞凋亡，21d细胞凋亡数目明显减少，各组间凋亡率有显著性差异(P<0.05)，表1.
表1 细胞凋亡指数(±s)及bcl-2的表达 指标
正常
结扎3d
结扎7d
结扎14d
结扎21d
, 百拇医药 AI
3.74±1.63
17.83±3.45
35.97±3.76
58.23±1.58
33.82±5.47
bcl-2
-
-
-
+
+ + +
, 百拇医药
图1 大鼠胆总管结扎21d后肝组织细胞凋亡，凋亡细胞核呈棕黄色，核呈固缩状、或染色质向周边聚集、或呈核碎片状.TUNEL法 ×400
2.4 阻黄大鼠肝组织细胞bcl-2蛋白的表达及与AI的关系 bcl-2蛋白的表达：对照组、胆总管结扎3d，7d均为阴性表达，14d弱阳性表达，21d强阳性表达，几乎所有肝组织细胞表达阳性(图2)；结扎14d，bcl-2蛋白弱阳性表达(+)，AI达高峰，结扎21d bcl-2强阳性表达(+++)，AI下降(表1).
图2 大鼠胆总管结扎21d后肝组织细胞bcl-2的表达，细胞质出现棕黄色颗粒为bcl-2表达阳性细胞.SABC法 ×400
3 讨论
阻塞性黄疸引起胆汁瘀积，造成肝脏损伤，为一常见的肝胆外科病症.一般认为，阻黄肝损害是由于胆盐甾类成分有类似除垢剂的效应，引起肝细胞膜损害，受损害的程度与胆盐的疏水性有关；另外，胆盐增加肝细胞胞质游离钙离子浓度造成肝细胞损害，以及胆盐致肝细胞内ATP过度水解引起线粒体损伤导致肝细胞损害[1].还有一种假说认为，阻黄肝细胞肿瘤坏死因子基因的过量表达造成肝脏的损害.但所有这些假说均建立在肝细胞发生坏死的假定条件之上.早在1972年Kerr et al[2]就描述了形态上不同于坏死性细胞死亡的另一种细胞死亡形式，称之为凋亡性细胞死亡，但直至最近才认识到人类许多疾病和病理生理现象都与细胞凋亡的紊乱有关，其中凋亡异常增加被认为是肝胆疾病的重要发病机制[3].在本研究中也发现，在阻黄大鼠的早期，肝脏即出现细胞凋亡现象，随着黄疸的加重，细胞凋亡明显增加，在后期随着凋亡调控机制的激活及肝脏纤维组织的增生，细胞凋亡减少.这为进一步认识阻黄肝脏的病理改变提供了新的途径.
, 百拇医药
细胞凋亡是细胞有序而协调激活凋亡刺激基因和凋亡抑制基因共同控制的过程.bcl-2基因是目前最受关注的与细胞凋亡相关的基因之一，它最早是从B细胞淋巴瘤染色体14和18异位短裂点t(14∶18)(q31～q32)中将bcl-2基因分离出来的[4].bcl-2基因蛋白表达产物定位于线粒体膜、核膜和内质网，在其氨基酸C端有一个由19个氨基酸组成的疏水性片段，并借此与膜相连.通过转基因动物和基因转染实验研究发现，bcl-2对细胞凋亡具有明显的抑制作用[5].本实验研究证实，在阻黄大鼠早期，bcl-2不表达或少量表达，肝组织出现细胞凋亡明显增加；在阻黄后期，bcl-2大量表达，出现肝组织细胞凋亡明显减少.因而表明，在大鼠阻黄过程中，bcl-2的表达起到了抑制肝组织细胞凋亡的作用，这与体外实验的结果相一致[6].
作者简介：王剑明，男，1968-11-11生，湖北省黄石市人，汉族.1992年武汉同济医科大学毕业，1995年同济医院外科硕士，1997年同济医院肝胆外科博士，主要从事阻塞性黄疸基础与临床研究，发表论文6篇.
, 百拇医药
通讯作者 王剑明，430030，湖北省武汉市汉口解放大道1095号，同济医科大学附属同济医院外科.
Tel.+86.27.83646252(H)
参考文献
1 Spirey JR，Bronk SF，Gores GJ，Izquierdo M，Murcia G.GCDC induced lethal hepatocellular injury in rat hepatocytes.Role of ATP depletion and cytosolic free calcium.J Clin Invest，1993;92:17-24
2 Kerr JFR，Sanchez MV，Sanz A.Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissues kinetics.Br J Cancer，1972;24:239-248
, http://www.100md.com
3 Patel T，Bronk SF，Gores GF.Apoptosis and hepatobiliary disease.Hepatology，1995;21:1725
4 Tsujimoto Y，Croce CM.Analysis of the structure，transcripts，and protein products of bcl-2，the gene involved in human follicular lymphoma.Proc Natl Acad Sci USA，1986;83:5214-5218
5 Korsmeyer SJ，Marx J，Debatin KM，Sanchez MV，Sanz A.Bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulators of cell death.Blood，1992;80:879-886
6 Kurosawa EC，Haruki SN，Florencia G，Boucher E，Calmus Y，Coker A.Hepatocytes in the bile duct-ligated rat express Bcl-2.Am J Physiol，1997;272:1587-1593
收稿日期 1999-07-28 修回日期 1999-11-08, 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院外科 湖北省武汉市 430030
关键词：黄疸；肝；细胞凋亡；bcl-2基因
世界华人消化杂志991208
摘 要 目的 探讨阻塞性黄疸大鼠肝组织损害的机制.方法 用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)和免疫组织化学方法检测阻塞性黄疸大鼠肝脏组织细胞凋亡状态及凋亡相关基因bcl-2的表达.结果 胆总管结扎后，随结扎时间的延长细胞凋亡增加，结扎14d后细胞凋亡达高峰，凋亡指数(AI)达58.23±1.58，各组AI差异有显著性意义(P<0.05).在阻塞性黄疸过程中，bcl-2蛋白表达越强，AI就越少.结论 bcl-2蛋白参与了阻塞性黄疸肝组织中细胞凋亡的调节，并在阻塞性黄疸肝损害的发生和发展中起重要作用.
, 百拇医药
中国图书馆分类号 R575
The role of bcl-2 gene in apoptosis of liver in rat with obstructive jaundice
WANG Jian-Ming，ZOU Qian and ZOU Sheng-Quan
(Department of Surgery，Tongji Hospital，Tongji Medical University，Wuhan 430030，Hubei Province，China)
Abstract AIM To explore the mechanism of hepatic injury in obstructive jaundice (OJ).METHODS Forty adult male Wistar rats (190g-230g) were used in all experiments.All rats underwent laparotomy.Experimental obstructive jaundice (BDL) was induced by double ligation of the bile duct by a proximal ligature around the bile duct in the hilus of the liver and by a distal ligature close to its entry into the duodenum.The animals were randomly divided into two groups: those that underwent bile duct manipulation (sham operated) and those that underwent BDL for 3，7，14，and 21 days.We detected the serum bilirubin and pathological change of liver in all rats.Then we detected apoptotic status and the expression of apoptosis related bcl-2 gene protein in liver of all rats with terminal-deoxynucleotidyl mediated nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry method.RESULTS The apoptotic rate of liver is related to times of OJ.Apoptosis was highest 14-days after bile duct ligation，apoptotic index (AI) was 58.23±1.58 (P<0.05).The stronger the bcl-2 expression，the less number of apoptotic cells in OJ.The increase of bilirubin and pathological change of liver in OJ were obvious.CONCLUSION bcl-2 takes part in the regulation and occurrence and progression of hepatic injury in OJ.
, 百拇医药
Subject headings jaundice; liver; apoptosis; bcl-2 gene
0 引言
研究表明，细胞凋亡在人体组织细胞中普遍存在，它由基因编制程序控制，许多基因参与此调节过程，且人类许多疾病和病理生理现象都与细胞凋亡的紊乱有关，但阻塞性黄疸(阻黄)时肝组织细胞的凋亡及其基因调控目前知之甚少.我们用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)和免疫组织化学方法对阻黄大鼠肝脏细胞凋亡状态及凋亡相关基因bcl-2蛋白的表达进行了研究，以探讨阻黄肝损害的病理调控机制.
1 材料和方法
1.1 材料 阻塞性黄疸大鼠模型的建立：健康♂ Wistar大鼠，体重190g～230g，大鼠予以氯胺酮0.2mL/100g腹腔注射麻醉后，剑突下小切口进腹，游离出胆总管，于肝门部结扎胆总管并切断，远端再予以结扎.进腹后不结扎切断胆总管作为正常对照.结扎后分别于3,7,14,21d处死大鼠，每组8只.
, 百拇医药
1.2 方法 ①血清胆红素的测定：处死大鼠门静脉抽血，离心后取上层血清行胆红素测定.②阻黄大鼠肝脏组织病理改变的检查：处死大鼠肝组织标本甲醛固定，石蜡包埋，切取厚度4mm切片，常规脱蜡、脱水，HE染色，光镜下观察.③用TUNEL法进行阻黄大鼠肝脏组织切片细胞凋亡的原位检测：TUNEL试剂盒为德国宝灵曼公司提供.在TdT介导下，使生物素化的dUTP标记至DNA断裂后形成的3＇-OH端，借助生物素与亲合素的特异结合，使过氧化物酶连接至DNA断点，最后加入底物，通过DAB染色，可在显微镜下观察细胞核中棕黄着色的凋亡细胞.每例切片计数5个400倍视野，以平均每100个细胞核中含凋亡细胞个数作为凋亡指数(AI).④免疫组织化学实验参照SABC法.兔抗鼠bcl-2单克隆抗体、生物素标记羊抗鼠IgG由北京中山公司提供.石蜡切片，DAB染色，细胞质出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞，切片内无阳性细胞为阴性表达(-)，阳性细胞率小于1/3为弱阳性表达(+)，1/3～2/3为中阳性表达(++)，大于2/3为强阳性表达(+++).
统计学处理 所有数据均用算术均数±标准差(
±s)表示：所获数据采用同济医科大学统计教研室提供的SAS统计软件包行多元方差分析及组间比较., 百拇医药
2 结果
2.1 阻黄大鼠血清胆红素的变化 正常组及结扎后3，7，14，21d胆红素值分别为：1.95μmol/L±0.47μmol/L，74.65μmol/L±15.83μmol/L，104.21μmol/L±22.36μmol/L，127.25μmol/L±28.53μmol/L，142.16μmol/L±35.27μmol/L，逐渐增高.
2.2 光镜下阻黄大鼠肝脏的病理改变 胆总管结扎3d即见肝内胆管扩张，偶见肝细胞结构改变，可见少量细胞凋亡，表现为细胞质浓缩，核染色质向核仁或核周边聚集；结扎7d，细胞凋亡增加，肝细胞部分变性，肝细胞内或细胞间瘀胆，纤维组织增生，胆小管扩张及中度增生，胆栓形成；结扎14d，细胞凋亡达到高峰，大范围的汇管区周围肝细胞变性，纤维组织增生向肝小叶内扩展；结扎21d，细胞凋亡有所减少，可见成片的肝细胞结构改变及胆湖形成，纤维组织带增宽，肝脏结构广泛改变，肝细胞数目明显减少.
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2.3 阻黄大鼠肝组织切片TUNEL检测结果 DAB染色后，凋亡细胞核呈棕黄色，核呈固缩状、或染色质向周边聚集、或呈核碎片状(图1).正常大鼠肝组织偶见细胞凋亡，结扎3d即见细胞凋亡增加，结扎7d明显增加，14d后镜下视野见广泛细胞凋亡，21d细胞凋亡数目明显减少，各组间凋亡率有显著性差异(P<0.05)，表1.
表1 细胞凋亡指数(
±s)及bcl-2的表达 指标正常
结扎3d
结扎7d
结扎14d
结扎21d
, 百拇医药 AI
3.74±1.63
17.83±3.45
35.97±3.76
58.23±1.58
33.82±5.47
bcl-2
-
-
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+
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图1 大鼠胆总管结扎21d后肝组织细胞凋亡，凋亡细胞核呈棕黄色，核呈固缩状、或染色质向周边聚集、或呈核碎片状.TUNEL法 ×400
2.4 阻黄大鼠肝组织细胞bcl-2蛋白的表达及与AI的关系 bcl-2蛋白的表达：对照组、胆总管结扎3d，7d均为阴性表达，14d弱阳性表达，21d强阳性表达，几乎所有肝组织细胞表达阳性(图2)；结扎14d，bcl-2蛋白弱阳性表达(+)，AI达高峰，结扎21d bcl-2强阳性表达(+++)，AI下降(表1).
图2 大鼠胆总管结扎21d后肝组织细胞bcl-2的表达，细胞质出现棕黄色颗粒为bcl-2表达阳性细胞.SABC法 ×400
3 讨论
阻塞性黄疸引起胆汁瘀积，造成肝脏损伤，为一常见的肝胆外科病症.一般认为，阻黄肝损害是由于胆盐甾类成分有类似除垢剂的效应，引起肝细胞膜损害，受损害的程度与胆盐的疏水性有关；另外，胆盐增加肝细胞胞质游离钙离子浓度造成肝细胞损害，以及胆盐致肝细胞内ATP过度水解引起线粒体损伤导致肝细胞损害[1].还有一种假说认为，阻黄肝细胞肿瘤坏死因子基因的过量表达造成肝脏的损害.但所有这些假说均建立在肝细胞发生坏死的假定条件之上.早在1972年Kerr et al[2]就描述了形态上不同于坏死性细胞死亡的另一种细胞死亡形式，称之为凋亡性细胞死亡，但直至最近才认识到人类许多疾病和病理生理现象都与细胞凋亡的紊乱有关，其中凋亡异常增加被认为是肝胆疾病的重要发病机制[3].在本研究中也发现，在阻黄大鼠的早期，肝脏即出现细胞凋亡现象，随着黄疸的加重，细胞凋亡明显增加，在后期随着凋亡调控机制的激活及肝脏纤维组织的增生，细胞凋亡减少.这为进一步认识阻黄肝脏的病理改变提供了新的途径.
, 百拇医药
细胞凋亡是细胞有序而协调激活凋亡刺激基因和凋亡抑制基因共同控制的过程.bcl-2基因是目前最受关注的与细胞凋亡相关的基因之一，它最早是从B细胞淋巴瘤染色体14和18异位短裂点t(14∶18)(q31～q32)中将bcl-2基因分离出来的[4].bcl-2基因蛋白表达产物定位于线粒体膜、核膜和内质网，在其氨基酸C端有一个由19个氨基酸组成的疏水性片段，并借此与膜相连.通过转基因动物和基因转染实验研究发现，bcl-2对细胞凋亡具有明显的抑制作用[5].本实验研究证实，在阻黄大鼠早期，bcl-2不表达或少量表达，肝组织出现细胞凋亡明显增加；在阻黄后期，bcl-2大量表达，出现肝组织细胞凋亡明显减少.因而表明，在大鼠阻黄过程中，bcl-2的表达起到了抑制肝组织细胞凋亡的作用，这与体外实验的结果相一致[6].
作者简介：王剑明，男，1968-11-11生，湖北省黄石市人，汉族.1992年武汉同济医科大学毕业，1995年同济医院外科硕士，1997年同济医院肝胆外科博士，主要从事阻塞性黄疸基础与临床研究，发表论文6篇.
, 百拇医药
通讯作者 王剑明，430030，湖北省武汉市汉口解放大道1095号，同济医科大学附属同济医院外科.
Tel.+86.27.83646252(H)
参考文献
1 Spirey JR，Bronk SF，Gores GJ，Izquierdo M，Murcia G.GCDC induced lethal hepatocellular injury in rat hepatocytes.Role of ATP depletion and cytosolic free calcium.J Clin Invest，1993;92:17-24
2 Kerr JFR，Sanchez MV，Sanz A.Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissues kinetics.Br J Cancer，1972;24:239-248
, http://www.100md.com
3 Patel T，Bronk SF，Gores GF.Apoptosis and hepatobiliary disease.Hepatology，1995;21:1725
4 Tsujimoto Y，Croce CM.Analysis of the structure，transcripts，and protein products of bcl-2，the gene involved in human follicular lymphoma.Proc Natl Acad Sci USA，1986;83:5214-5218
5 Korsmeyer SJ，Marx J，Debatin KM，Sanchez MV，Sanz A.Bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulators of cell death.Blood，1992;80:879-886
6 Kurosawa EC，Haruki SN，Florencia G，Boucher E，Calmus Y，Coker A.Hepatocytes in the bile duct-ligated rat express Bcl-2.Am J Physiol，1997;272:1587-1593
收稿日期 1999-07-28 修回日期 1999-11-08, 百拇医药