幽门螺杆菌清除前后胃粘膜C-myc蛋白和表皮生长因子受体的变化
作者：高晋华 梁后杰 刘为纹 房殿春 王振华
单位：中国人民解放军第三军医大学西南医院消化科 重庆市 400038
关键词：螺杆菌，幽门；胃粘膜；C-myc基因蛋白；受体，表皮生长因子
摘 要 目的 了解幽门螺杆菌
摘 要 目的 了解幽门螺杆菌(Hp)感染对胃粘膜C-myc基因蛋白和表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响.方法 应用流式细胞术和免疫荧光染色技术，对Hp清除前后胃粘膜C-myc基因蛋白和EGFR进行定量测定，用免疫组化法研究增殖细胞核抗原(PCNA)在组织中的表达.结果 Hp阳性患者胃粘膜细胞C-myc蛋白和EGFR的阳性细胞百分率和平均荧光强度显著高于Hp阴性患者，经治疗Hp转阴者上述指标显著下降，而Hp仍为阳性者上述指标则无明显变化.胃粘膜PCNA标记指数与C-myc蛋白和EGFR呈一致性改变.结论 Hp感染导致的C-myc蛋白和EGFR的过度表达，可能对细胞增殖和癌变具有促进作用.
, http://www.100md.com
中国图书馆分类号 R573.2
Expression of C-myc gene protein and epidermal growth factor receptor in gastric mucosa pre- and post-Helicobacter pylori clearance
GAO Jin-Hua，LIANG Hou-Jie，LIU Wei-Wen，FANG Dian-Chun and WANG Zhen-Hua
(Department of Gastroenterology，Southwest Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)
Abstract AIM To investigate the effect of Helicobacter pylori infection on the expression of C-myc gene protein and epidermal growth factor receptor (EGFR) in gastric mucosa.METHODS The expression of C-myc gene protein and EGFR was quantitatively studied by flow cytometry and indirect immunofluorescence methods，proliferative cell nuclear antigen (PCNA) was analysed by immunochemistry method.RESULTS The percentage of positive cells and mean fluorescence intensity of C-myc protein and EGFR were significantly increased in Hp infected mucosa and significantly decreased after Hp clearance with triple therapy.This change was similar to that in proliferative activity indicated by PCNA labeling index.CONCLUSION The over expression of C-myc gene protein and EGFR may be the molecular basis for hyperproliferation of gastric mucosal epithelium induced by Hp infection
, 百拇医药
Subject headings Helicobacter pylori; gastric mucosa; C-myc gene protein; receptor，epidermal growth factor
0 引言
近年研究表明，幽门螺杆菌(Hp)感染可能与胃癌的发生有关[1]，而细胞癌变是一个涉及多个基因改变的多步骤过程，已发现在许多种肿瘤中均有c-myc基因的扩增和过度表达.本研究的目的在于①应用流式细胞术和免疫荧光技术，对Hp清除前后胃粘膜C-myc基因蛋白和表皮生长因子受体(EGFR)进行定量检测，以观察Hp感染对c-myc基因和EGFR表达的影响；②通过对C-myc基因蛋白，EGFR和增殖细胞核抗原(PCNA)标记指数的相关分析，了解c-myc基因和EGFR表达与细胞增殖活性的关系.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 所有患者均系以上消化道症状在我院行内镜检查的慢性胃炎患者共72例，其中Hp阳性者40例，Hp阴性者32例.细菌学检察包括细菌培养，PCR检测，Giemsa染色和Warthy-Starry银染色等，上述方法有两项以上阳性判为Hp阳性，全部均为阴性者判为Hp阴性.对Hp阳性者以枸橼酸铋钾(德诺，120mg，4次/d)，四环素(0.25g，4次/d)和小剂量呋喃唑酮(痢特灵，10mg，4次/d)“三联”疗法进行治疗，4wk后内镜复查.
1.2 方法
1.2.1 C-myc基因蛋白和EGFR流式免疫荧光测定 鼠抗人C-myc蛋白单克隆抗体和兔抗人EGFR单克隆抗体均为Oncogene Science Inc.产品，羊抗兔和羊抗鼠FITC-IgG为军事医学科学院微生物流行病研究所生产.胃粘膜组织剪碎，以2.5g/L胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，用不锈钢网过滤，再依次以149和74尼龙网过滤，去除细胞团块.采用间接免疫荧光染色法.将110细胞悬液用PBS液离心洗涤2次，1000r/min每次2min，弃去上清，加入1∶100稀释的一抗100μL，在37℃恒温水浴中温育30min，PBS洗2次，然后加入1∶20稀释的羊抗鼠(C-myc)或羊抗兔(EGFR) FITC-IgG 100μL 37℃水浴温育30min，PBS洗2次，离心去上清，除去未结合的多余荧光抗体.上机前加入1.0mL PBS液，经400目滤网过滤，上机分析.经免疫荧光染色的细胞涂片在荧光显微镜下观察荧光的分布情况.采用美国BD公司生产的流式细胞仪FACS420型，光源为2W氩离子激光器，工作功率为300mW，分别进行单参数检测，数据测量，图形同时输入Hp-300 consort 30计算机，应用Single histogram statistics-substract graphs软件程序进行资料处理.测定前以鸡红细胞标准样品调整仪器的CV值在5.0%以内.应用相应程序，每例样品均计算出C-myc蛋白和EGFR标记率及平均荧光强度，以此表示其相对含量.
, 百拇医药
1.2.2 PCNA免疫组化染色 采用ABC酶标法.抗PCNA单克隆抗体(PC10)和ABC试剂盒均为Sigma公司产品.以正常鼠血清代替第一抗体作阴性对照.以PCNA阳性细胞占计数细胞总数的百分比作为PCNA标记指数.
统计学处理 两样品均数的比较采用t检验，相关性比较采用直线相关分析.
2 结果
2.1 Hp阳性患者各指标对比 Hp阳性患者胃粘膜细胞C-myc蛋白，EGFR及PCNA表达均显著高于Hp阴性患者(表1).
表1 胃粘膜Hp感染与C-myc及PCNA的表达 (
±s)
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Hp
C-myc蛋白
EGFR
PCNA
标记指数
阳性细胞百分率
荧光强度
阳性细胞百分率
荧光强度
阳性
34.1±15.6
61.6±9.5
33.2±16.0
, 百拇医药
64.2±11.8
19.1±3.2
阴性
20.2±12.3b
48.7±10.1b
19.8±13.4b
49.5±9.7b
13.1±2.4b
bP<0.01，vs Hp阳性.
2.2 Hp感染对C-myc蛋白和EGFR表达的影响 经“三联”治疗Hp转阴者胃粘膜细胞C-myc蛋白和EGFR的阳性细胞百分率和平均荧光强度均显著下降，而Hp仍为阳性者上述指标则无明显变化(表2).
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表2 胃粘膜Hp清除前后C-myc蛋白和EGFR表达的变化
Hp
C-myc蛋白
EGFR
阳性细胞百分率
平均荧光强度
阳性细胞百分率
平均荧光强度
清除组
治疗前
34.3±15.6
63.5±9.7
, 百拇医药
32.7±15.8
60.3±10.7
治疗后
21.5±10.9a
50.6±8.9b
20.7±13.2b
50.2±10.1b
未清除组
治疗前
32.5±14.9
63.1±9.8
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31.8±15.4
64.7±14.3
治疗后
31.5±14.8b
64.4±12.4b
33.1±15.7b
63.5±14.2b
aP<0.05，bP<0.01，vs 治疗前.
2.3 Hp清除前后PCNA标记指数的变化 经“三联”治疗后，Hp被清除者PCNA标记指数显著下降，而Hp未被清除者PCNA标记指数无显著性变化(表3).
, 百拇医药
表3 胃粘膜Hp清除前后PCNA标记指数的变化
Hp
n
治疗前
治疗后
清除组
19
19.0±2.7
14.0±2.3
未清除组
12
19.1±2.6
18.1±2.5b
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bP<0.01，vs 治疗前.
2.4 EGFR，C-myc蛋白与PCNA标记指数的相关性 经直线相关性分析表明，EGFR，C-myc蛋白与PCNA标记指数均有明显的正相关(P<0.01).
3 讨论
近来研究发现，c-myc基因与细胞持续增殖有关，并且与不同的基因群协同控制细胞增殖与分化，参与细胞的调控特别是G0～G1期的过渡，因此推测c-myc基因与肿瘤的发生发展有关[2].对胃癌及其癌前病变的研究表明，从正常胃粘膜→肠化生→异型增生→胃癌，c-myc基因表达依次递增[3].我们应用流式细胞术，并结合免疫荧光方法对Hp相关性胃炎的胃粘膜和Hp阴性胃炎者的胃粘膜C-myc基因蛋白进行定量检测，结果表明Hp阳性患者C-myc蛋白表达显著高于Hp阴性患者，Hp阳性患者经“三联”治疗后Hp转阴者C-myc蛋白显著下降，而Hp未被清除者C-myc蛋白表达则无明显变化，说明Hp感染导致了胃粘膜c-myc基因的过度表达.细胞增殖是细胞癌变和肿瘤发生的细胞学基础，而生长因子及其受体和癌基因的表达异常则是细胞增殖的分子基础[4].本结果表明，C-myc蛋白，EGFR，PCNA标记指数间成显著正相关，提示Hp感染导致的C-myc蛋白和EGFR的表达，可能对细胞增殖具有促进作用.及时有效地清除Hp，则可纠正癌基因表达和细胞增殖异常，这一结果为胃癌的一级预防和癌前阶段的干预治疗提供了一定的理论依据.
, 百拇医药
作者简介：高晋华，女，1963-08-26生，山西省沁源县人，1980年毕业于第三军医大学护理系，1994年毕业于第三军医大学医学实验技术专修班，现为消化内科主管技师，长期从事消化内镜诊疗工作.
通讯作者 高晋华,400038,重庆市，第三军医大学西南医院消化科.
Tel.+86.23.68754013
参考文献
1 Parsonnet J.Helicobacter pylori and gastric cancer.Gastroenterol Clin North Am，1993;22:89-104
2 Freytag SO.Enforced expression of the c-myc oncogene inhibits cell differentiation by producing entry into a distinct predifferentiation state in G0/G1.Mol Cell Biol，1988;8:1614-1624
, 百拇医药
3 Liang HJ，Liu WW，Fang DC，Men RP.Quatitative study on the expression of C-myc gene protein in gastric cancer and precancerous lesions.Zhonghua Wuli Yixue Zazhi，1996；18：65-67
4 Pitot HC.The molecular biology of carcinogenesis.Cancer，1993;72:962-970
5 Stemmermann G.The molecular biology of esophageal and gastric cancer and their precursors: oncogenes，tumor suppressor genes，and growth factors.Human Pathol，1994;25:968-981
收稿日期 1999-04-28, 百拇医药
单位：中国人民解放军第三军医大学西南医院消化科 重庆市 400038
关键词：螺杆菌，幽门；胃粘膜；C-myc基因蛋白；受体，表皮生长因子
摘 要 目的 了解幽门螺杆菌
摘 要 目的 了解幽门螺杆菌(Hp)感染对胃粘膜C-myc基因蛋白和表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响.方法 应用流式细胞术和免疫荧光染色技术，对Hp清除前后胃粘膜C-myc基因蛋白和EGFR进行定量测定，用免疫组化法研究增殖细胞核抗原(PCNA)在组织中的表达.结果 Hp阳性患者胃粘膜细胞C-myc蛋白和EGFR的阳性细胞百分率和平均荧光强度显著高于Hp阴性患者，经治疗Hp转阴者上述指标显著下降，而Hp仍为阳性者上述指标则无明显变化.胃粘膜PCNA标记指数与C-myc蛋白和EGFR呈一致性改变.结论 Hp感染导致的C-myc蛋白和EGFR的过度表达，可能对细胞增殖和癌变具有促进作用.
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中国图书馆分类号 R573.2
Expression of C-myc gene protein and epidermal growth factor receptor in gastric mucosa pre- and post-Helicobacter pylori clearance
GAO Jin-Hua，LIANG Hou-Jie，LIU Wei-Wen，FANG Dian-Chun and WANG Zhen-Hua
(Department of Gastroenterology，Southwest Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)
Abstract AIM To investigate the effect of Helicobacter pylori infection on the expression of C-myc gene protein and epidermal growth factor receptor (EGFR) in gastric mucosa.METHODS The expression of C-myc gene protein and EGFR was quantitatively studied by flow cytometry and indirect immunofluorescence methods，proliferative cell nuclear antigen (PCNA) was analysed by immunochemistry method.RESULTS The percentage of positive cells and mean fluorescence intensity of C-myc protein and EGFR were significantly increased in Hp infected mucosa and significantly decreased after Hp clearance with triple therapy.This change was similar to that in proliferative activity indicated by PCNA labeling index.CONCLUSION The over expression of C-myc gene protein and EGFR may be the molecular basis for hyperproliferation of gastric mucosal epithelium induced by Hp infection
, 百拇医药
Subject headings Helicobacter pylori; gastric mucosa; C-myc gene protein; receptor，epidermal growth factor
0 引言
近年研究表明，幽门螺杆菌(Hp)感染可能与胃癌的发生有关[1]，而细胞癌变是一个涉及多个基因改变的多步骤过程，已发现在许多种肿瘤中均有c-myc基因的扩增和过度表达.本研究的目的在于①应用流式细胞术和免疫荧光技术，对Hp清除前后胃粘膜C-myc基因蛋白和表皮生长因子受体(EGFR)进行定量检测，以观察Hp感染对c-myc基因和EGFR表达的影响；②通过对C-myc基因蛋白，EGFR和增殖细胞核抗原(PCNA)标记指数的相关分析，了解c-myc基因和EGFR表达与细胞增殖活性的关系.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 所有患者均系以上消化道症状在我院行内镜检查的慢性胃炎患者共72例，其中Hp阳性者40例，Hp阴性者32例.细菌学检察包括细菌培养，PCR检测，Giemsa染色和Warthy-Starry银染色等，上述方法有两项以上阳性判为Hp阳性，全部均为阴性者判为Hp阴性.对Hp阳性者以枸橼酸铋钾(德诺，120mg，4次/d)，四环素(0.25g，4次/d)和小剂量呋喃唑酮(痢特灵，10mg，4次/d)“三联”疗法进行治疗，4wk后内镜复查.
1.2 方法
1.2.1 C-myc基因蛋白和EGFR流式免疫荧光测定 鼠抗人C-myc蛋白单克隆抗体和兔抗人EGFR单克隆抗体均为Oncogene Science Inc.产品，羊抗兔和羊抗鼠FITC-IgG为军事医学科学院微生物流行病研究所生产.胃粘膜组织剪碎，以2.5g/L胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，用不锈钢网过滤，再依次以149和74尼龙网过滤，去除细胞团块.采用间接免疫荧光染色法.将110细胞悬液用PBS液离心洗涤2次，1000r/min每次2min，弃去上清，加入1∶100稀释的一抗100μL，在37℃恒温水浴中温育30min，PBS洗2次，然后加入1∶20稀释的羊抗鼠(C-myc)或羊抗兔(EGFR) FITC-IgG 100μL 37℃水浴温育30min，PBS洗2次，离心去上清，除去未结合的多余荧光抗体.上机前加入1.0mL PBS液，经400目滤网过滤，上机分析.经免疫荧光染色的细胞涂片在荧光显微镜下观察荧光的分布情况.采用美国BD公司生产的流式细胞仪FACS420型，光源为2W氩离子激光器，工作功率为300mW，分别进行单参数检测，数据测量，图形同时输入Hp-300 consort 30计算机，应用Single histogram statistics-substract graphs软件程序进行资料处理.测定前以鸡红细胞标准样品调整仪器的CV值在5.0%以内.应用相应程序，每例样品均计算出C-myc蛋白和EGFR标记率及平均荧光强度，以此表示其相对含量.
, 百拇医药
1.2.2 PCNA免疫组化染色 采用ABC酶标法.抗PCNA单克隆抗体(PC10)和ABC试剂盒均为Sigma公司产品.以正常鼠血清代替第一抗体作阴性对照.以PCNA阳性细胞占计数细胞总数的百分比作为PCNA标记指数.
统计学处理 两样品均数的比较采用t检验，相关性比较采用直线相关分析.
2 结果
2.1 Hp阳性患者各指标对比 Hp阳性患者胃粘膜细胞C-myc蛋白，EGFR及PCNA表达均显著高于Hp阴性患者(表1).
表1 胃粘膜Hp感染与C-myc及PCNA的表达 (
±s), http://www.100md.com
Hp
C-myc蛋白
EGFR
PCNA
标记指数
阳性细胞百分率
荧光强度
阳性细胞百分率
荧光强度
阳性
34.1±15.6
61.6±9.5
33.2±16.0
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64.2±11.8
19.1±3.2
阴性
20.2±12.3b
48.7±10.1b
19.8±13.4b
49.5±9.7b
13.1±2.4b
bP<0.01，vs Hp阳性.
2.2 Hp感染对C-myc蛋白和EGFR表达的影响 经“三联”治疗Hp转阴者胃粘膜细胞C-myc蛋白和EGFR的阳性细胞百分率和平均荧光强度均显著下降，而Hp仍为阳性者上述指标则无明显变化(表2).
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表2 胃粘膜Hp清除前后C-myc蛋白和EGFR表达的变化
Hp
C-myc蛋白
EGFR
阳性细胞百分率
平均荧光强度
阳性细胞百分率
平均荧光强度
清除组
治疗前
34.3±15.6
63.5±9.7
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32.7±15.8
60.3±10.7
治疗后
21.5±10.9a
50.6±8.9b
20.7±13.2b
50.2±10.1b
未清除组
治疗前
32.5±14.9
63.1±9.8
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64.7±14.3
治疗后
31.5±14.8b
64.4±12.4b
33.1±15.7b
63.5±14.2b
aP<0.05，bP<0.01，vs 治疗前.
2.3 Hp清除前后PCNA标记指数的变化 经“三联”治疗后，Hp被清除者PCNA标记指数显著下降，而Hp未被清除者PCNA标记指数无显著性变化(表3).
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表3 胃粘膜Hp清除前后PCNA标记指数的变化
Hp
n
治疗前
治疗后
清除组
19
19.0±2.7
14.0±2.3
未清除组
12
19.1±2.6
18.1±2.5b
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2.4 EGFR，C-myc蛋白与PCNA标记指数的相关性 经直线相关性分析表明，EGFR，C-myc蛋白与PCNA标记指数均有明显的正相关(P<0.01).
3 讨论
近来研究发现，c-myc基因与细胞持续增殖有关，并且与不同的基因群协同控制细胞增殖与分化，参与细胞的调控特别是G0～G1期的过渡，因此推测c-myc基因与肿瘤的发生发展有关[2].对胃癌及其癌前病变的研究表明，从正常胃粘膜→肠化生→异型增生→胃癌，c-myc基因表达依次递增[3].我们应用流式细胞术，并结合免疫荧光方法对Hp相关性胃炎的胃粘膜和Hp阴性胃炎者的胃粘膜C-myc基因蛋白进行定量检测，结果表明Hp阳性患者C-myc蛋白表达显著高于Hp阴性患者，Hp阳性患者经“三联”治疗后Hp转阴者C-myc蛋白显著下降，而Hp未被清除者C-myc蛋白表达则无明显变化，说明Hp感染导致了胃粘膜c-myc基因的过度表达.细胞增殖是细胞癌变和肿瘤发生的细胞学基础，而生长因子及其受体和癌基因的表达异常则是细胞增殖的分子基础[4].本结果表明，C-myc蛋白，EGFR，PCNA标记指数间成显著正相关，提示Hp感染导致的C-myc蛋白和EGFR的表达，可能对细胞增殖具有促进作用.及时有效地清除Hp，则可纠正癌基因表达和细胞增殖异常，这一结果为胃癌的一级预防和癌前阶段的干预治疗提供了一定的理论依据.
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作者简介：高晋华，女，1963-08-26生，山西省沁源县人，1980年毕业于第三军医大学护理系，1994年毕业于第三军医大学医学实验技术专修班，现为消化内科主管技师，长期从事消化内镜诊疗工作.
通讯作者 高晋华,400038,重庆市，第三军医大学西南医院消化科.
Tel.+86.23.68754013
参考文献
1 Parsonnet J.Helicobacter pylori and gastric cancer.Gastroenterol Clin North Am，1993;22:89-104
2 Freytag SO.Enforced expression of the c-myc oncogene inhibits cell differentiation by producing entry into a distinct predifferentiation state in G0/G1.Mol Cell Biol，1988;8:1614-1624
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3 Liang HJ，Liu WW，Fang DC，Men RP.Quatitative study on the expression of C-myc gene protein in gastric cancer and precancerous lesions.Zhonghua Wuli Yixue Zazhi，1996；18：65-67
4 Pitot HC.The molecular biology of carcinogenesis.Cancer，1993;72:962-970
5 Stemmermann G.The molecular biology of esophageal and gastric cancer and their precursors: oncogenes，tumor suppressor genes，and growth factors.Human Pathol，1994;25:968-981
收稿日期 1999-04-28, 百拇医药