胃癌病变术前超声内镜检查分期与p53基因突变的关系
作者：郭文 张亚历 周殿元 张万岱
单位：中国人民解放军第一军医大学南方医院消化科 广东省广州市 510515
关键词：胃肿瘤/超声检查；p53基因；突变；内窥镜检查
世界华人消化杂志991238 中国图书馆分类号 R.
Subject headings stomach neoplasms/ultrasonography; p53 gene; mutation; endoscopy
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，术前进行正确的病变分期、判断癌浸润和转移的生物学行为，不仅有助于预后判断，同时也有助于更好的制定治疗计划，因此术前癌肿分期已成为现代医学重要的诊断模式，针对胃癌术前病理取材和分期的研究在临床上具有重大的实际应用价值.业已表明，超声内镜检查(endoscopic ultrasonography，EUS)对胃癌术前分期明显优于其他各种检查，与术后病理对照也具有较高的一致性[1].然而，这种术前分期能否反映胃癌的细胞生物学行为，其术前EUS分期的基因改变背景尚未见有研究报告.本文主要探讨胃癌术前EUS分期与其p53基因突变的相关性，为EUS的临床应用提供细胞生物学理论和依据.
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1 材料和方法
1.1 材料 对临床73例胃癌患者，术前行EUS(GF-UM20/EU-M20，Olympus，Japan)检查，进行TN分期[2].其中男41例，女32例，男女之比为1.28∶1.年龄在26岁～67岁之间，平均年龄为51.4岁.每例同时取粘膜病变组织和正常粘膜组织作石蜡包埋切片，行HE染色和作组织消化行PCR-SSCP检测p53基因突变.所有病例于2wk内手术，作术后病理TN分期对照.
1.2 方法 银染PCR-SSCP检测p53基因突变：按文献[3]之方法A，从石蜡组织切片中提取DNA模板.参考文献[4]设计p53基因第5～8外显子引物，由加拿大真达基因公司协助合成，其序列如下：①第5外显子(产物为245bp).PU5：5＇-GACTTTCAACTGTCTC-3＇,PD5:5＇-CTGGGACCCTGGGCAAC-3＇；②第6外显子(产物为184bp).PU6：5＇-GAGACGACAGGGCTGGTT-3＇，PD6：5＇-CCACTGACAACCACCCTT-3＇；③第7外显子(产物为188bp)，PU7：5＇-GTGTTGTCTCCTAGGTTGGC-3＇，PD7：5＇-AAGTGGCTCCTGACCTGGAG-3＇；④第8外显子(产物为214bp)，PU8：5＇-TGGTAATCTACTGGGACG-3＇，PD8：5＇-CTCGCTTAGTGCTCCCTGG-3＇.应用4对引物扩增4个DNA片段，扩增条件为：94℃ 45s，55℃ 1min，72℃ 1min.依次进行35个循环，72℃ 5min.
, 百拇医药
取上述PCR产物6μL加入18μL变性缓冲液(含98%去离子甲酰胺、10mmol/L EDTA，pH 8.0，0.025%二甲苯青、0.025%溴酚蓝)混匀于97℃变性8min，冰上骤冷，快速加样于预冷4℃的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶板(含5%甘油，丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺为19∶1)上.双链对照标本不作变性处理，直接上样.13℃，400V恒压电泳4h，行SSCP分析.最后按文献[5]银染.
2 结果
2.1 胃癌EUS检查与分期 EUS能够清晰地显示胃壁的层次结构.胃癌的EUS影像表现为不规则的低回声肿块影，根据正常胃壁结构层次的破坏情况可对其进行分期.其中T1期癌(浸润粘膜或粘膜下层)5例，T2期癌(浸润固有肌层)12例，T3期癌(浸润至浆膜层)28例，T4期癌(浸润至邻近组织)28例.根据EUS检查有无探及邻近淋巴结肿大情况可将病例分为淋巴结转移(N+)与非转移(N0)二组，其中N+者37例，N0者36例.对照术后病理检查(表1，2)，EUS T，N分期的准确率分别达84.9%和83.6%.
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表1 EUS对73例胃癌术前T分期的准确性 EUS分期
n
病理分期
EUS诊断
准确率(%)
T1
T2
T3
T4
T1
5
5
0
, 百拇医药
0
0
100.0
T2
12
0
10
2
0
83.3
T3
28
0
2
, 百拇医药
23
3
82.1
T4
28
0
0
4
24
85.7
总计
73
5
12
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29
27
84.9
2.2 胃癌p53基因突变检出情况 应用银染PCR-SSCP技术检测73例胃癌标本中p53基因第5，6，7和8外显子的突变情况，通过与自身的正常胃粘膜组织对照，发现40例存在p53基因点突变，出现异常移动的单链DNA电泳带，突变率为54.8%.外显子5～8出现异常电泳带的频率分别为：5(6.8%)，11(15.1%)，14(19.2%)和10例(13.7%).在胃癌的不同组织学类型之间，低分化癌中p53基因突变率稍高于中和高分化癌(表3)，但未具备统计学意义(P>0.05).分析其突变与术前超声内镜分期的关系(表4)，可见癌细胞浸润浆膜层后(T3或T4期)，突变率明显高于癌细胞限制于固有肌层以内(T1或T2期)者(P<0.05)，但T3与T4或T1与T2期之间p53基因突变并无明显差别.另外，伴淋巴结转移组突变率明显高于无转移组(P<0.05).表2 EUS对73例胃癌淋巴结转移的分期评价 EUS分期
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n
病理分期
EUS诊断
准确率(%)
N0
N+
N0
36
28
8
77.8
N+
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37
4
33
89.2
总计
73
32
41
83.6
表3 p53基因突变与胃癌组织类型的关系 组织类型
n
突变数
突变率
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高分化腺癌
29
14
48.3
中分化腺癌
25
14
56.0
低分化腺癌
19
12
63.2
表4 不同EUS分期的胃癌p53基因突变情况 EUS分期
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浸润深度或转移
n
p53基因突变
n
%
T1
粘膜或粘膜下
5
0
0.0
T2
固有肌层
12
, 百拇医药
3
25.0
T3
浆膜层
28
18
64.3a
T4
邻近组织
28
19
67.9a
N0
, 百拇医药
无LN转移
36
15
41.7
N+
伴LN转移
37
25
67.6b
a与T1或T2相比，0.025b与No相比，0.025
LN：指淋巴结.
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3 讨论
在胃癌的术前诊断中，EUS由于能将超声探头直接经内镜检查送达病变部位对病变进行超声扫描，明显优于现有的其他各项检查.综合文献报道[1].EUS对542例胃癌浸润深度的判断和外科病理组织学对照，EUS对T分期的总准确率为83.7%，其中T1，T2，T3，T4各期分期准确率分别为91.0%，78.1%，78.1%和90.5%.EUS能发现直径3mm以上肿大的淋巴结，并可根据淋巴结回声类型、边界及大小判断转移情况，准确率达86.0%.因此，EUS作为胃癌术前分期的重要检查手段已逐步推广应用于临床.本研究对73例胃癌术前EUS分期准确性，T分期达84.9%，N分期达83.6%，与文献报告相符.然而，这种术前分期能否反映胃癌的细胞生物学行为，并未进行深入研究.
从分子水平探讨胃癌发病机制是近几年研究的一个热点.业已表明，胃癌的发生发展与抑癌基因有关，其中p53基因突变是胃癌最常见的遗传学改变之一.研究表明，p53基因突变或丢失与人类胃癌的发生发展相关.这种基因水平的改变主要发生在4个进化上高度保守区，即外显子5～8.据文献报道[6]，约50%的胃癌存在p53基因突变，而这些报告均基于对术后病理标本的检测.本文应用PCR-SSCP银染技术检测73例胃癌术前内镜活检组织石蜡包埋标本中p53基因第5，6，7和8外显子的突变情况，发现40例存在基因突变，突变率为54.8%.此结果与文献报道基本相同.同时显示，p53基因突变虽与胃癌组织类型无关，但与肿瘤浸润深度及淋巴结转移状况相关.而术前EUS分期与这种改变有较好的相关性.研究提示胃癌中普遍存在p53基因突变，并可推测p53基因突变与胃癌的发生演化、转移和预后有关.而以EUS术前分期为依据，对术前活检标本的检测可以反映胃癌的细胞生物学恶性行为，有助于临床术前对胃癌患者的正确评价.
, 百拇医药
通讯作者 郭文
参考文献
1 郭文，张亚历，周殿元.胃癌的超声内镜诊断进展.现代消化病及内镜杂志，1996；1：174-179
2 郭文，张亚历，周殿元，黄祥成，齐德林，邹小明.超声内镜对食道癌和胃癌的诊断价值.现代消化病及内镜杂志，1996；1：90-94
3 Thomas S，Suzette M.Comparison of methods for extracting DNA from formalin-fixed paraffin sections for nonisotopic PCR.Diagn Mol Pathol，1996;5:220-224
4 Gorgoulis V，Zoumpourlis V，Rassidakis G，Karameris A，Barbatis C，Spandidos DA，Kittas C.Molecular analysis of p53 gene in laryngeal premalignant and malignant lesions.P53 protein immunohistochemical expression is positively related to proliferating cell nuclear antigen labelling index.Virchows Arch，1995;426:339-344
5 李家良，杨光华，李甘地.银染PCR-SSCP方法检测恶性纤维组织细胞瘤p53基因点突变.中华肿瘤杂志，1996；18：13-15
6 吕有勇，李诤，孙梅，高崇峰，崔建涛，李文梅，张青云，谢山海，李吉友，邓国仁.p53基因点突变与胃癌细胞恶性程度及临床预后的关系.中华医学杂志，1995；75：679-682
收稿日期 1999-06-23 修回日期 1999-11-08, 百拇医药
单位：中国人民解放军第一军医大学南方医院消化科 广东省广州市 510515
关键词：胃肿瘤/超声检查；p53基因；突变；内窥镜检查
世界华人消化杂志991238 中国图书馆分类号 R.
Subject headings stomach neoplasms/ultrasonography; p53 gene; mutation; endoscopy
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，术前进行正确的病变分期、判断癌浸润和转移的生物学行为，不仅有助于预后判断，同时也有助于更好的制定治疗计划，因此术前癌肿分期已成为现代医学重要的诊断模式，针对胃癌术前病理取材和分期的研究在临床上具有重大的实际应用价值.业已表明，超声内镜检查(endoscopic ultrasonography，EUS)对胃癌术前分期明显优于其他各种检查，与术后病理对照也具有较高的一致性[1].然而，这种术前分期能否反映胃癌的细胞生物学行为，其术前EUS分期的基因改变背景尚未见有研究报告.本文主要探讨胃癌术前EUS分期与其p53基因突变的相关性，为EUS的临床应用提供细胞生物学理论和依据.
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1 材料和方法
1.1 材料 对临床73例胃癌患者，术前行EUS(GF-UM20/EU-M20，Olympus，Japan)检查，进行TN分期[2].其中男41例，女32例，男女之比为1.28∶1.年龄在26岁～67岁之间，平均年龄为51.4岁.每例同时取粘膜病变组织和正常粘膜组织作石蜡包埋切片，行HE染色和作组织消化行PCR-SSCP检测p53基因突变.所有病例于2wk内手术，作术后病理TN分期对照.
1.2 方法 银染PCR-SSCP检测p53基因突变：按文献[3]之方法A，从石蜡组织切片中提取DNA模板.参考文献[4]设计p53基因第5～8外显子引物，由加拿大真达基因公司协助合成，其序列如下：①第5外显子(产物为245bp).PU5：5＇-GACTTTCAACTGTCTC-3＇,PD5:5＇-CTGGGACCCTGGGCAAC-3＇；②第6外显子(产物为184bp).PU6：5＇-GAGACGACAGGGCTGGTT-3＇，PD6：5＇-CCACTGACAACCACCCTT-3＇；③第7外显子(产物为188bp)，PU7：5＇-GTGTTGTCTCCTAGGTTGGC-3＇，PD7：5＇-AAGTGGCTCCTGACCTGGAG-3＇；④第8外显子(产物为214bp)，PU8：5＇-TGGTAATCTACTGGGACG-3＇，PD8：5＇-CTCGCTTAGTGCTCCCTGG-3＇.应用4对引物扩增4个DNA片段，扩增条件为：94℃ 45s，55℃ 1min，72℃ 1min.依次进行35个循环，72℃ 5min.
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取上述PCR产物6μL加入18μL变性缓冲液(含98%去离子甲酰胺、10mmol/L EDTA，pH 8.0，0.025%二甲苯青、0.025%溴酚蓝)混匀于97℃变性8min，冰上骤冷，快速加样于预冷4℃的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶板(含5%甘油，丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺为19∶1)上.双链对照标本不作变性处理，直接上样.13℃，400V恒压电泳4h，行SSCP分析.最后按文献[5]银染.
2 结果
2.1 胃癌EUS检查与分期 EUS能够清晰地显示胃壁的层次结构.胃癌的EUS影像表现为不规则的低回声肿块影，根据正常胃壁结构层次的破坏情况可对其进行分期.其中T1期癌(浸润粘膜或粘膜下层)5例，T2期癌(浸润固有肌层)12例，T3期癌(浸润至浆膜层)28例，T4期癌(浸润至邻近组织)28例.根据EUS检查有无探及邻近淋巴结肿大情况可将病例分为淋巴结转移(N+)与非转移(N0)二组，其中N+者37例，N0者36例.对照术后病理检查(表1，2)，EUS T，N分期的准确率分别达84.9%和83.6%.
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表1 EUS对73例胃癌术前T分期的准确性 EUS分期
n
病理分期
EUS诊断
准确率(%)
T1
T2
T3
T4
T1
5
5
0
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0
0
100.0
T2
12
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10
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0
83.3
T3
28
0
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23
3
82.1
T4
28
0
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4
24
85.7
总计
73
5
12
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27
84.9
2.2 胃癌p53基因突变检出情况 应用银染PCR-SSCP技术检测73例胃癌标本中p53基因第5，6，7和8外显子的突变情况，通过与自身的正常胃粘膜组织对照，发现40例存在p53基因点突变，出现异常移动的单链DNA电泳带，突变率为54.8%.外显子5～8出现异常电泳带的频率分别为：5(6.8%)，11(15.1%)，14(19.2%)和10例(13.7%).在胃癌的不同组织学类型之间，低分化癌中p53基因突变率稍高于中和高分化癌(表3)，但未具备统计学意义(P>0.05).分析其突变与术前超声内镜分期的关系(表4)，可见癌细胞浸润浆膜层后(T3或T4期)，突变率明显高于癌细胞限制于固有肌层以内(T1或T2期)者(P<0.05)，但T3与T4或T1与T2期之间p53基因突变并无明显差别.另外，伴淋巴结转移组突变率明显高于无转移组(P<0.05).表2 EUS对73例胃癌淋巴结转移的分期评价 EUS分期
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病理分期
EUS诊断
准确率(%)
N0
N+
N0
36
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37
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总计
73
32
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83.6
表3 p53基因突变与胃癌组织类型的关系 组织类型
n
突变数
突变率
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高分化腺癌
29
14
48.3
中分化腺癌
25
14
56.0
低分化腺癌
19
12
63.2
表4 不同EUS分期的胃癌p53基因突变情况 EUS分期
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浸润深度或转移
n
p53基因突变
n
%
T1
粘膜或粘膜下
5
0
0.0
T2
固有肌层
12
, 百拇医药
3
25.0
T3
浆膜层
28
18
64.3a
T4
邻近组织
28
19
67.9a
N0
, 百拇医药
无LN转移
36
15
41.7
N+
伴LN转移
37
25
67.6b
a与T1或T2相比，0.025
LN：指淋巴结.
, http://www.100md.com
3 讨论
在胃癌的术前诊断中，EUS由于能将超声探头直接经内镜检查送达病变部位对病变进行超声扫描，明显优于现有的其他各项检查.综合文献报道[1].EUS对542例胃癌浸润深度的判断和外科病理组织学对照，EUS对T分期的总准确率为83.7%，其中T1，T2，T3，T4各期分期准确率分别为91.0%，78.1%，78.1%和90.5%.EUS能发现直径3mm以上肿大的淋巴结，并可根据淋巴结回声类型、边界及大小判断转移情况，准确率达86.0%.因此，EUS作为胃癌术前分期的重要检查手段已逐步推广应用于临床.本研究对73例胃癌术前EUS分期准确性，T分期达84.9%，N分期达83.6%，与文献报告相符.然而，这种术前分期能否反映胃癌的细胞生物学行为，并未进行深入研究.
从分子水平探讨胃癌发病机制是近几年研究的一个热点.业已表明，胃癌的发生发展与抑癌基因有关，其中p53基因突变是胃癌最常见的遗传学改变之一.研究表明，p53基因突变或丢失与人类胃癌的发生发展相关.这种基因水平的改变主要发生在4个进化上高度保守区，即外显子5～8.据文献报道[6]，约50%的胃癌存在p53基因突变，而这些报告均基于对术后病理标本的检测.本文应用PCR-SSCP银染技术检测73例胃癌术前内镜活检组织石蜡包埋标本中p53基因第5，6，7和8外显子的突变情况，发现40例存在基因突变，突变率为54.8%.此结果与文献报道基本相同.同时显示，p53基因突变虽与胃癌组织类型无关，但与肿瘤浸润深度及淋巴结转移状况相关.而术前EUS分期与这种改变有较好的相关性.研究提示胃癌中普遍存在p53基因突变，并可推测p53基因突变与胃癌的发生演化、转移和预后有关.而以EUS术前分期为依据，对术前活检标本的检测可以反映胃癌的细胞生物学恶性行为，有助于临床术前对胃癌患者的正确评价.
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通讯作者 郭文
参考文献
1 郭文，张亚历，周殿元.胃癌的超声内镜诊断进展.现代消化病及内镜杂志，1996；1：174-179
2 郭文，张亚历，周殿元，黄祥成，齐德林，邹小明.超声内镜对食道癌和胃癌的诊断价值.现代消化病及内镜杂志，1996；1：90-94
3 Thomas S，Suzette M.Comparison of methods for extracting DNA from formalin-fixed paraffin sections for nonisotopic PCR.Diagn Mol Pathol，1996;5:220-224
4 Gorgoulis V，Zoumpourlis V，Rassidakis G，Karameris A，Barbatis C，Spandidos DA，Kittas C.Molecular analysis of p53 gene in laryngeal premalignant and malignant lesions.P53 protein immunohistochemical expression is positively related to proliferating cell nuclear antigen labelling index.Virchows Arch，1995;426:339-344
5 李家良，杨光华，李甘地.银染PCR-SSCP方法检测恶性纤维组织细胞瘤p53基因点突变.中华肿瘤杂志，1996；18：13-15
6 吕有勇，李诤，孙梅，高崇峰，崔建涛，李文梅，张青云，谢山海，李吉友，邓国仁.p53基因点突变与胃癌细胞恶性程度及临床预后的关系.中华医学杂志，1995；75：679-682
收稿日期 1999-06-23 修回日期 1999-11-08, 百拇医药