两种尺寸游离软骨移植的实验研究
作者：杨光成 司徒朴 刘春利 陈 兵
单位：杨光成 刘春利 (广州军区广州总医院整形外科(510010))；司徒朴 陈 兵(第一军医大学珠江医院整形外科(510282))
关键词：软骨；聚乳酸；游离移植
广东医学991205 【摘要】 目的 探讨游离软骨块大小对软骨生长的影响。方法 将新西兰大白兔24只随机分为A，B两组，将切取的软骨制成不同大小的软骨浆，A组软骨大小约为0.5 mm×0.5 mm,B组为1.5 mm×1.5 mm，将软骨浆均匀地涂布在多孔聚乳酸泡沫上，制成软骨-聚乳酸复合物，埋植于兔背皮下，分别于术后第1，3，6个月取出标本作大体观察和病理检查。结果 两组均有不同程度的软骨形成，经统计分析较小软骨组比较大软骨组新生软骨量明显增多(P<0.05)。结论 游离软骨块在聚乳酸泡沫上均具有一定的生长潜能，其中较小软骨块更有利于软骨生长。
, 百拇医药
Experimental study of different two size free auotgraft cartilage
Yang Guangcheng, Situ Pu, Liu Chunli, et al.
Department of Plastic Surgery, General Hospital of Guangzhou Command of PLA, Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To investigate the effect of the size of cartilage on growth potential of free autograft cartilage.Methods Twenty four 5-week-old New Zealand rabbits were randomly divided into two groups (A and B), each with twelve animals. The mean body weight was less than 1.5 kg (1.4～1.6 kg). Cartilage taken from the ear without perichondrium was cut into 0.5 mm×0.5 mm and 1.5 mm×1.5 mm grafts, which were smeared on the three dimensional polylactic acid (PLA) foams, then implanted into subcutaneous pocket. Animals were sacrified 1,3,6 month after transplantation. The retrieved implants were used for gross measurement and histological analysis.Results All implants in both groups could be palpable outside skin. They nearly gained their original contour without losing their mechanical strength. Implants exhibited various degree of cartilage growth at different period, especially at 6th month. Cartilage cells remained functionally differentiated and proliferative, especially in group A which had significantly (P<0.05) more cartilage neogenesis.Conclusion Free cartilage has great growth potential on PLA scaffolds. Smaller cartilage has more cartilage neogenesis than larger one (P<0.05).
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【Key words】 Cartilage Polylactic acid Free graft
软骨移植是整形美容最常见手术，游离软骨移植是否能生长一直为学者所关注。一种观点认为游离软骨具有生长潜能，尤其是幼龄动物[1]，另一种观念认为游离软骨无生长潜能，尤其是成年动物[2，3]，但仍能保持活性。游离软骨大小对软骨生长是否有影响?为此我们通过将两种不同尺寸的软骨种植于聚乳酸泡沫上，埋植于皮下，通过分析PLA泡沫上新生软骨量来判断软骨大小对新生软骨的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 新西兰大白兔24只，雌雄不限，随机分为A，B两组，每组12只，平均体重1.0～1.5 kg，平均兔龄5周。
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1.1.2 聚乳酸(polylactic acid, PLA) 广州中山大学高分子研究所提供，相对分子质量60 000，为固体块状，无微孔结构。
1.2 方法
1.2.1 PLA泡沫制备 聚乳酸与有机溶剂二氧六环按重量体积比1∶9(g/mL)混合，置于低温中蒸发，即可制得聚乳酸泡沫，平均孔径大小约为2 mm，孔隙率为75%，抗压强度大，质地硬，韧性强。用手术刀将其雕刻成不同形状、大小的植入块，术前12 h紫外线消毒[4]。
1.2.2 手术方法 2%戊巴比妥钠30～40 mg/kg右耳缘静脉注射麻醉。左耳备皮，消毒、铺巾。距两侧耳缘1 cm、近端3 cm、远端1 cm，作全层棱形切除，大小6 cm×3 cm。离体耳组织置于含少量庆大霉素的灭菌生理盐水中浸泡片刻，供区对位拉拢分层缝合。用眼科剪剃除离体耳组织皮肤、皮下组织及软骨膜，按照纵行条块状剪碎耳组织。A组：耳组织碎片平均测量值小于0.5 mm×0.5 mm,B组为1.5 mm×1.5 mm。将软骨浆均匀地涂布在PLA孔内。分别在两组兔背两侧皮下植入48块植入块。皮肤、皮下分层缝合。术后无压力包扎，分笼饲养。术后3 d每日肌注青霉素40万u。
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1.3 观察方法
1.3.1 大体观察及测量 分别于术后第1，3，6个月各取出16块植入块，观察植入块新生软骨量。为了量化新生软骨，根据新生软骨分布大小作如下计量：①未见新生软骨块，直径<0.2 cm(-);②少量分布软骨块，直径～0.3 cm(+)；③软骨呈花斑状分布，直径～0.5 cm(++)；④软骨呈块状分布，直径～1 cm(+++)；⑤植入块为新生软骨，直径>1 cm(++++)。
1.3.2 组织学观察 完成以上测量后将标本放入10%福尔马林中固定，脱水，石蜡包埋，切成5 μm厚切片，HE染色。
1.3.3 统计学分析 采用秩和检验、χ2检验及u检验。
2 结果
2.1 大体观察 各期PLA支架外形仍维持良好，6个月后有软化现象，实验前后植入块大体测量值无明显变化，两组植入块均有不同程度的新生软骨块，在基材上呈散在分布。最大新生软骨约8 mm×8 mm，最小约3 mm×3 mm，质地较均匀，新生软骨块弹性尚可，不透明。A组植入块上新生软骨分布较均匀且密度较大。评分结果如表1。
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表1 两组不同时间新生软骨块评分结果 (块) 组别
总植入块数
1个月
3个月
6个月
A组
48
3- 13+
7+ 9++
3+ 8++ 5+++
B组
48
, http://www.100md.com 2- 14+
14+ 2++
12+ 4++
2.1.1 A组在不同时间点上的比较 见表2。表2 A组在不同时间点上的比较 对比组
秩和之差
0.05界值
0.01界值
P值
x1 x2
13.69
11.13
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13.80
<0.05
x1 x3
22.13
11.13
13.80
<0.01
x2 x3
8.44
11.13
13.80
>0.05
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注：两两比较秩和检验(Nemeyi法)，x1，x2，x3分别代表第1，3，6个月，下表同
2.1.2 B组在不同时间点上的比较 见表3。
表3 B组在不同时间点上的比较 对比组
秩和之差
0.05界值
0.01界值
P值
x1 x2
5.50
7.85
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9.73
>0.05
x1 x3
8.83
7.85
9.73
<0.05
x2 x3
2.88
7.85
9.73
>0.05
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2.1.3 A，B两组在不同时间点上的比较 A，B两组植入块在第3个月时间点上比较，校正χ2值=4.987 6，P＝0.025<0.05；A，B两组植入块在第6个月时间点上比较，Wilcoxon等级资料两样本比较：u=2.256>1.96，P<0.05。
2.2 病理检查
2.2.1 A组 第1个月软骨断缘与表面细胞增生明显，可见细胞分裂像，双核细胞；部分细胞增生呈舌状延伸至被包绕的纤维结缔组织中，细胞间距缩小，近PLA侧有软骨增生及幼稚细胞，未见有软骨吸收、坏死征象。第3个月软骨保持活性，细胞增生活跃，细胞呈圆形，幼稚细胞层次增加。耳软骨附近可见孤立的、完全是增生的软骨组织。在软骨表面及其横断面均见有数层活跃增生的细胞。第6个月类似第3个月上述征象，而细胞层次及成熟软骨细胞增加，出现陷窝，孤立的新增生软骨组织数量增加。
2.2.2 B组 第1，3，6个月均可见活跃增生的细胞，幼稚细胞数量及横断面细胞层次均增加。单位体积软骨新增生率低于A组，未见孤立新增生软骨组织。3 讨论
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两组(A，B)软骨均有增生现象，LA泡沫为软骨的生长提供有益的环境，有利于组织液自由流动，同时能将代谢产物排出，不致对软骨组织起毒害作用。
3.1 A组单位体积成软骨量比B组高 A，B两组间统计分析表明存在新生软骨量上的明显差异，前者明显高于后者，说明不同大小软骨块成软骨量有较大的差异。
3.2 不同时间软骨生成量不同 A组内第1个月与第3个月及第1个月与第6个月之间差异有显著性(P<0.05，P<0.01)，而第3个月与第6个月之间差别并不显著(P>0.05)。B组内只有第1个月与第6个月之间差异有显著性(P<0.05)。A，B组在第3个月与第6个月两个时间点上差异均有显著性(P<0.05)，说明在一定时间内软骨细胞保持活性，但是软骨细胞是否随着时间延长能继续生长尚待研究。
3.3 游离软骨生长方式 与表面平行活跃增生的软骨细胞促进软骨面积的增加而不是厚度的增加，无软骨膜的表面同样具有软骨生长的潜能，软骨膜是非必须的成软骨因素[5]。本实验表明游离软骨存在两种生长方式：一种为软骨内生长，是依靠软骨细胞分化增生及分泌基质完成的；另一种为软骨膜下生长，来自软骨膜下的软骨细胞增生导致软骨的平行生长[6]。较小的软骨碎片单位体积成软骨量比较大组多。较小软骨片更易生长是由于单位体积内较小软骨片断缘与周围营养液接触面积大，小碎片更易受到某种因素刺激。而A组在周围无软骨块情况下，出现一些散在孤立的新生软骨岛，可能为极小碎片或者说少数的细胞群的增生行为，这为单个细胞体内、外培养可大量扩增提供了有力的依据。
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参考文献
1 Cardenas CL, Gomez RB, Guerrero MT, et al. Cartilaginous behavior in nasal surgery: a comparative observational study. Ann Plast Surg, 1998, 40(1):34
2 Cardenas CL, Guerrero MT. Use of cartilaginous autografts in nasal surgery: 8 years of experience. Plast Reconstr Surg, 1999, 103(3): 1003
3 Akeson WH. Current status of cartilage grafting. West J Med, 1998, 168(2):121
, 百拇医药
4 Athanasiou KA, Niederauer GG. Sterilization, toxicity, biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid copolymers. Biomaterials, 1996, 17:93
5 Peltomaki T, Kylamarkula S, Vinkka PH, et al. Tissue-separating capacity of growth cartilages. Eur J Orthod, 1997, 19(5):473
6 Collawn SS, Fix RJ, Moore JR, et al. Nasal cartilage grafts: more than a decade of experience. Plast Reconstr Surg, 1997, 100(6):1547, 百拇医药
单位：杨光成 刘春利 (广州军区广州总医院整形外科(510010))；司徒朴 陈 兵(第一军医大学珠江医院整形外科(510282))
关键词：软骨；聚乳酸；游离移植
广东医学991205 【摘要】 目的 探讨游离软骨块大小对软骨生长的影响。方法 将新西兰大白兔24只随机分为A，B两组，将切取的软骨制成不同大小的软骨浆，A组软骨大小约为0.5 mm×0.5 mm,B组为1.5 mm×1.5 mm，将软骨浆均匀地涂布在多孔聚乳酸泡沫上，制成软骨-聚乳酸复合物，埋植于兔背皮下，分别于术后第1，3，6个月取出标本作大体观察和病理检查。结果 两组均有不同程度的软骨形成，经统计分析较小软骨组比较大软骨组新生软骨量明显增多(P<0.05)。结论 游离软骨块在聚乳酸泡沫上均具有一定的生长潜能，其中较小软骨块更有利于软骨生长。
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Experimental study of different two size free auotgraft cartilage
Yang Guangcheng, Situ Pu, Liu Chunli, et al.
Department of Plastic Surgery, General Hospital of Guangzhou Command of PLA, Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To investigate the effect of the size of cartilage on growth potential of free autograft cartilage.Methods Twenty four 5-week-old New Zealand rabbits were randomly divided into two groups (A and B), each with twelve animals. The mean body weight was less than 1.5 kg (1.4～1.6 kg). Cartilage taken from the ear without perichondrium was cut into 0.5 mm×0.5 mm and 1.5 mm×1.5 mm grafts, which were smeared on the three dimensional polylactic acid (PLA) foams, then implanted into subcutaneous pocket. Animals were sacrified 1,3,6 month after transplantation. The retrieved implants were used for gross measurement and histological analysis.Results All implants in both groups could be palpable outside skin. They nearly gained their original contour without losing their mechanical strength. Implants exhibited various degree of cartilage growth at different period, especially at 6th month. Cartilage cells remained functionally differentiated and proliferative, especially in group A which had significantly (P<0.05) more cartilage neogenesis.Conclusion Free cartilage has great growth potential on PLA scaffolds. Smaller cartilage has more cartilage neogenesis than larger one (P<0.05).
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【Key words】 Cartilage Polylactic acid Free graft
软骨移植是整形美容最常见手术，游离软骨移植是否能生长一直为学者所关注。一种观点认为游离软骨具有生长潜能，尤其是幼龄动物[1]，另一种观念认为游离软骨无生长潜能，尤其是成年动物[2，3]，但仍能保持活性。游离软骨大小对软骨生长是否有影响?为此我们通过将两种不同尺寸的软骨种植于聚乳酸泡沫上，埋植于皮下，通过分析PLA泡沫上新生软骨量来判断软骨大小对新生软骨的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 新西兰大白兔24只，雌雄不限，随机分为A，B两组，每组12只，平均体重1.0～1.5 kg，平均兔龄5周。
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1.1.2 聚乳酸(polylactic acid, PLA) 广州中山大学高分子研究所提供，相对分子质量60 000，为固体块状，无微孔结构。
1.2 方法
1.2.1 PLA泡沫制备 聚乳酸与有机溶剂二氧六环按重量体积比1∶9(g/mL)混合，置于低温中蒸发，即可制得聚乳酸泡沫，平均孔径大小约为2 mm，孔隙率为75%，抗压强度大，质地硬，韧性强。用手术刀将其雕刻成不同形状、大小的植入块，术前12 h紫外线消毒[4]。
1.2.2 手术方法 2%戊巴比妥钠30～40 mg/kg右耳缘静脉注射麻醉。左耳备皮，消毒、铺巾。距两侧耳缘1 cm、近端3 cm、远端1 cm，作全层棱形切除，大小6 cm×3 cm。离体耳组织置于含少量庆大霉素的灭菌生理盐水中浸泡片刻，供区对位拉拢分层缝合。用眼科剪剃除离体耳组织皮肤、皮下组织及软骨膜，按照纵行条块状剪碎耳组织。A组：耳组织碎片平均测量值小于0.5 mm×0.5 mm,B组为1.5 mm×1.5 mm。将软骨浆均匀地涂布在PLA孔内。分别在两组兔背两侧皮下植入48块植入块。皮肤、皮下分层缝合。术后无压力包扎，分笼饲养。术后3 d每日肌注青霉素40万u。
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1.3 观察方法
1.3.1 大体观察及测量 分别于术后第1，3，6个月各取出16块植入块，观察植入块新生软骨量。为了量化新生软骨，根据新生软骨分布大小作如下计量：①未见新生软骨块，直径<0.2 cm(-);②少量分布软骨块，直径～0.3 cm(+)；③软骨呈花斑状分布，直径～0.5 cm(++)；④软骨呈块状分布，直径～1 cm(+++)；⑤植入块为新生软骨，直径>1 cm(++++)。
1.3.2 组织学观察 完成以上测量后将标本放入10%福尔马林中固定，脱水，石蜡包埋，切成5 μm厚切片，HE染色。
1.3.3 统计学分析 采用秩和检验、χ2检验及u检验。
2 结果
2.1 大体观察 各期PLA支架外形仍维持良好，6个月后有软化现象，实验前后植入块大体测量值无明显变化，两组植入块均有不同程度的新生软骨块，在基材上呈散在分布。最大新生软骨约8 mm×8 mm，最小约3 mm×3 mm，质地较均匀，新生软骨块弹性尚可，不透明。A组植入块上新生软骨分布较均匀且密度较大。评分结果如表1。
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表1 两组不同时间新生软骨块评分结果 (块) 组别
总植入块数
1个月
3个月
6个月
A组
48
3- 13+
7+ 9++
3+ 8++ 5+++
B组
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14+ 2++
12+ 4++
2.1.1 A组在不同时间点上的比较 见表2。表2 A组在不同时间点上的比较 对比组
秩和之差
0.05界值
0.01界值
P值
x1 x2
13.69
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注：两两比较秩和检验(Nemeyi法)，x1，x2，x3分别代表第1，3，6个月，下表同
2.1.2 B组在不同时间点上的比较 见表3。
表3 B组在不同时间点上的比较 对比组
秩和之差
0.05界值
0.01界值
P值
x1 x2
5.50
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2.1.3 A，B两组在不同时间点上的比较 A，B两组植入块在第3个月时间点上比较，校正χ2值=4.987 6，P＝0.025<0.05；A，B两组植入块在第6个月时间点上比较，Wilcoxon等级资料两样本比较：u=2.256>1.96，P<0.05。
2.2 病理检查
2.2.1 A组 第1个月软骨断缘与表面细胞增生明显，可见细胞分裂像，双核细胞；部分细胞增生呈舌状延伸至被包绕的纤维结缔组织中，细胞间距缩小，近PLA侧有软骨增生及幼稚细胞，未见有软骨吸收、坏死征象。第3个月软骨保持活性，细胞增生活跃，细胞呈圆形，幼稚细胞层次增加。耳软骨附近可见孤立的、完全是增生的软骨组织。在软骨表面及其横断面均见有数层活跃增生的细胞。第6个月类似第3个月上述征象，而细胞层次及成熟软骨细胞增加，出现陷窝，孤立的新增生软骨组织数量增加。
2.2.2 B组 第1，3，6个月均可见活跃增生的细胞，幼稚细胞数量及横断面细胞层次均增加。单位体积软骨新增生率低于A组，未见孤立新增生软骨组织。3 讨论
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两组(A，B)软骨均有增生现象，LA泡沫为软骨的生长提供有益的环境，有利于组织液自由流动，同时能将代谢产物排出，不致对软骨组织起毒害作用。
3.1 A组单位体积成软骨量比B组高 A，B两组间统计分析表明存在新生软骨量上的明显差异，前者明显高于后者，说明不同大小软骨块成软骨量有较大的差异。
3.2 不同时间软骨生成量不同 A组内第1个月与第3个月及第1个月与第6个月之间差异有显著性(P<0.05，P<0.01)，而第3个月与第6个月之间差别并不显著(P>0.05)。B组内只有第1个月与第6个月之间差异有显著性(P<0.05)。A，B组在第3个月与第6个月两个时间点上差异均有显著性(P<0.05)，说明在一定时间内软骨细胞保持活性，但是软骨细胞是否随着时间延长能继续生长尚待研究。
3.3 游离软骨生长方式 与表面平行活跃增生的软骨细胞促进软骨面积的增加而不是厚度的增加，无软骨膜的表面同样具有软骨生长的潜能，软骨膜是非必须的成软骨因素[5]。本实验表明游离软骨存在两种生长方式：一种为软骨内生长，是依靠软骨细胞分化增生及分泌基质完成的；另一种为软骨膜下生长，来自软骨膜下的软骨细胞增生导致软骨的平行生长[6]。较小的软骨碎片单位体积成软骨量比较大组多。较小软骨片更易生长是由于单位体积内较小软骨片断缘与周围营养液接触面积大，小碎片更易受到某种因素刺激。而A组在周围无软骨块情况下，出现一些散在孤立的新生软骨岛，可能为极小碎片或者说少数的细胞群的增生行为，这为单个细胞体内、外培养可大量扩增提供了有力的依据。
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参考文献
1 Cardenas CL, Gomez RB, Guerrero MT, et al. Cartilaginous behavior in nasal surgery: a comparative observational study. Ann Plast Surg, 1998, 40(1):34
2 Cardenas CL, Guerrero MT. Use of cartilaginous autografts in nasal surgery: 8 years of experience. Plast Reconstr Surg, 1999, 103(3): 1003
3 Akeson WH. Current status of cartilage grafting. West J Med, 1998, 168(2):121
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4 Athanasiou KA, Niederauer GG. Sterilization, toxicity, biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid copolymers. Biomaterials, 1996, 17:93
5 Peltomaki T, Kylamarkula S, Vinkka PH, et al. Tissue-separating capacity of growth cartilages. Eur J Orthod, 1997, 19(5):473
6 Collawn SS, Fix RJ, Moore JR, et al. Nasal cartilage grafts: more than a decade of experience. Plast Reconstr Surg, 1997, 100(6):1547, 百拇医药