CEA分泌性肿瘤微循环检测体会
作者：李荔霞 王晓怀
单位：广州军区广州总医院肿瘤科(510010)
关键词：CEAmRNA；RT-PCR；外周血
广东医学991207 【摘要】 目的 检测肿瘤外周血肿瘤细胞，建立肿瘤微循环转移早期诊断的方法。方法 取CEA分泌性肿瘤患者外周血，分离其有核细胞后进行细胞总RNA的抽提，运用RT-PCR技术进行基因检测。结果 以PCR终产物出现131 bp带定为CEAmRNA阳性，结果20例患者总阳性率为55%。结论 RT-PCR是分子生物学领域的新技术，已成为肿瘤微循环检测的方法，具有灵敏度高的优点。在该技术运用中有一些注意事项。
Microcyclic detection of CEA-secreting-neoplasms
Li Lixia, Wang Xiaohuai.
, 百拇医药
Department of Oncology, General Hospital of Guangzhou Command of PLA,Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To establish an early diagnostic method for neoplastic microcirculatory metastasis by detecting neoplastic cells in peripheral blood.Methods Peripheral blood samples in patients with CEA-secreting-neoplasms were taken.After separating nucleated cells and isolating total RNA, CEA gene was detected by using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) technique.Results Sample was diagnosed as CEAmRNA positive when 131 bp band is defected in PCR end-product. 55% of patients were CEAmRNA positive. Conclusion RT-PCR is a new technique for detecting neoplastic microcirculation, with relatively high sensitivity. Precaution should be taken on using this technique.
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【Key words】 CEAmRNA RT-PCR Peripheral blood
在肿瘤的临床治疗中,复发和转移是一主要问题。除了提高手术水平，早期诊断、及时治疗是提高疗效的重要措施。目前，肿瘤的微循环检测已成为研究热点。用分子生物学的检测方法，即逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术,可检测患者外周血中的极少数癌细胞,并预示肿瘤的微小转移[1]。我们在对CEA(carcinoembryonic antigen)分泌性肿瘤的研究过程中，发现一些问题，在此提出并进行讨论。
1 材料与方法
1.1 病例选择 病例为20例CEA分泌性肿瘤患者，包括结直肠癌13例、肺癌4例、胃癌3例。
1.2 研究方法 取外周血5 mL，加淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离。用Trizol试剂(GIBCO公司)进行细胞总RNA的抽提。测定OD值并行琼脂糖变性凝胶电泳鉴定所抽提出的RNA。以RNA为模板，逆转录反应合成cDNA。采用巢式PCR扩增所需的CEA DNA片段[2]。2.5%琼脂糖凝胶或5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物。
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2 结果
抽提出的RNAOD260/280比值在1.0～1.8之间。琼脂糖变性凝胶电泳均见竹节样带，但混有杂带。琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳，以出现定为
本课题由广东省自然科学基金及广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”基金资助(编号990667)
阳性。测得20例阳性率为55%。
3 讨论
随着分子生物学的发展，T-技术已在肿瘤的微循环检测中发挥重要的作用。该技术灵敏度高，可达(2～5)×107[2]。在我们的研究中，20例患者有11例出现CEAmRNA阳性。由于CEAmRNA是由脱落到循环中的癌细胞产生，故结果阳性则提示肿瘤微转移的可能，这对临床工作具有一定的指导意义。在肿瘤的微循环RT-PCR检测中，许多环节不容忽视。首先是抽提细胞总RNA，只有把这一步做好了，才有可能继续实验。由于RNA是一种很不稳定的物质，容易被环境中存在的RNA酶所降解，因此操作过程中常规要求使用RNA酶抑制剂如DEPC。另外，我们提出以下几点进行讨论：①材料的准备。国产的Tip头、Eppendorf管不同于进口货，单纯高温高压消毒不够，一定要预先经0.1%DEPC浸泡，而后高温高压、干烤8 h以上后使用。提倡直接使用进口Tip头及Eppendorf 管，处理简易方便。我们在研究开始忽视了国产材料的预处理，考虑所测RNAOD260/280比值偏低与此有一定关系。②关于抽提方法的选择。抽提过程中使用RNA酶抑制剂很重要，另外缩短抽提时间对RNA的保存也有利。时间越短，RNA被RNA酶分解的机会就越小。传统的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法需要4～5 h,操作较为繁琐。如使用Trizol快速抽提液进行抽提，1～2h基本可以完成，且比较简单。当然，如有条件，使用RNA抽提试剂盒更好。从实验全局考虑，抽提快是优势所在。③有核细胞、细胞总RNA的保存有一定的技巧。从外周血分离出的有核细胞，如不马上进行RNA抽提，可直接冻于-80℃冰箱保存[3]。低温下酶活性几乎无，故对RNA存在有利。抽提出的细胞总RNA用75%乙醇悬浮后，分装多管，置于-20℃保存即可。该法比用无RNA水溶解保存更安全，后者需置-80℃保存。④在抽提过程中,吸取离心分层后含RNA的水相时动作要轻,宁少勿多,注意不要吸及下层的酚或蛋白,否则会影响以后的PCR反应。我们所测OD 260/280比值偏低的另一个原因在此。另外在电泳鉴定RNA时出现杂带也与此有关。
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逆转录PCR中，我们总结出几点经验供大家参考：①逆转录模板量与时间的选择。每次从标本中抽提出的RNA量有多有少，为了更好地进行逆转录，模板的量可适当多取，以保证逆转录酶发挥最大的作用。逆转录时间可灵活掌握，必要时可适当延长。②PCR反应条件的优化。退火温度较高的反应，一定要保证PCR仪的可靠。如果达不到预定温度，生成非特异性产物的可能性就大。我们在研究中反复探讨过这个问题，得出结论：非特异性产物的产生与退火温度不足有很大关系。③PCR产物的分析，一般采用琼脂糖凝胶电泳。如果DNA片段在200 bp以下，一般的琼脂糖凝胶区分DNA条带的能力较差，这时选用聚丙烯酰胺凝胶电泳可大大提高分辨率。
参考文献
1 Vessella RL,Blouke KA,Stray JE,et al. The use of the polymerase chain reaction to detect metastatic prostate cancer in lymph nodes and bone marrow.Proceedings of the American Association for Cancer Res,1992,33:2367
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2 Gerhard M, Juhl H, Kalthoff H, et al. Specific detection of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction.Journal of Clinical Oncology,1994， 12(4):725
3 Jonas S, Windeatt S, Boateng AO, et al. Identification of carcinoembryonic antigen-producing cells circulating in the blood of patients with colorectal carcinoma by reverse transcriptase polymerase chain reaction.Gut,1996， 39:717, http://www.100md.com
单位：广州军区广州总医院肿瘤科(510010)
关键词：CEAmRNA；RT-PCR；外周血
广东医学991207 【摘要】 目的 检测肿瘤外周血肿瘤细胞，建立肿瘤微循环转移早期诊断的方法。方法 取CEA分泌性肿瘤患者外周血，分离其有核细胞后进行细胞总RNA的抽提，运用RT-PCR技术进行基因检测。结果 以PCR终产物出现131 bp带定为CEAmRNA阳性，结果20例患者总阳性率为55%。结论 RT-PCR是分子生物学领域的新技术，已成为肿瘤微循环检测的方法，具有灵敏度高的优点。在该技术运用中有一些注意事项。
Microcyclic detection of CEA-secreting-neoplasms
Li Lixia, Wang Xiaohuai.
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Department of Oncology, General Hospital of Guangzhou Command of PLA,Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To establish an early diagnostic method for neoplastic microcirculatory metastasis by detecting neoplastic cells in peripheral blood.Methods Peripheral blood samples in patients with CEA-secreting-neoplasms were taken.After separating nucleated cells and isolating total RNA, CEA gene was detected by using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) technique.Results Sample was diagnosed as CEAmRNA positive when 131 bp band is defected in PCR end-product. 55% of patients were CEAmRNA positive. Conclusion RT-PCR is a new technique for detecting neoplastic microcirculation, with relatively high sensitivity. Precaution should be taken on using this technique.
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【Key words】 CEAmRNA RT-PCR Peripheral blood
在肿瘤的临床治疗中,复发和转移是一主要问题。除了提高手术水平，早期诊断、及时治疗是提高疗效的重要措施。目前，肿瘤的微循环检测已成为研究热点。用分子生物学的检测方法，即逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术,可检测患者外周血中的极少数癌细胞,并预示肿瘤的微小转移[1]。我们在对CEA(carcinoembryonic antigen)分泌性肿瘤的研究过程中，发现一些问题，在此提出并进行讨论。
1 材料与方法
1.1 病例选择 病例为20例CEA分泌性肿瘤患者，包括结直肠癌13例、肺癌4例、胃癌3例。
1.2 研究方法 取外周血5 mL，加淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离。用Trizol试剂(GIBCO公司)进行细胞总RNA的抽提。测定OD值并行琼脂糖变性凝胶电泳鉴定所抽提出的RNA。以RNA为模板，逆转录反应合成cDNA。采用巢式PCR扩增所需的CEA DNA片段[2]。2.5%琼脂糖凝胶或5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物。
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2 结果
抽提出的RNAOD260/280比值在1.0～1.8之间。琼脂糖变性凝胶电泳均见竹节样带，但混有杂带。琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳，以出现定为
本课题由广东省自然科学基金及广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”基金资助(编号990667)
阳性。测得20例阳性率为55%。
3 讨论
随着分子生物学的发展，T-技术已在肿瘤的微循环检测中发挥重要的作用。该技术灵敏度高，可达(2～5)×107[2]。在我们的研究中，20例患者有11例出现CEAmRNA阳性。由于CEAmRNA是由脱落到循环中的癌细胞产生，故结果阳性则提示肿瘤微转移的可能，这对临床工作具有一定的指导意义。在肿瘤的微循环RT-PCR检测中，许多环节不容忽视。首先是抽提细胞总RNA，只有把这一步做好了，才有可能继续实验。由于RNA是一种很不稳定的物质，容易被环境中存在的RNA酶所降解，因此操作过程中常规要求使用RNA酶抑制剂如DEPC。另外，我们提出以下几点进行讨论：①材料的准备。国产的Tip头、Eppendorf管不同于进口货，单纯高温高压消毒不够，一定要预先经0.1%DEPC浸泡，而后高温高压、干烤8 h以上后使用。提倡直接使用进口Tip头及Eppendorf 管，处理简易方便。我们在研究开始忽视了国产材料的预处理，考虑所测RNAOD260/280比值偏低与此有一定关系。②关于抽提方法的选择。抽提过程中使用RNA酶抑制剂很重要，另外缩短抽提时间对RNA的保存也有利。时间越短，RNA被RNA酶分解的机会就越小。传统的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法需要4～5 h,操作较为繁琐。如使用Trizol快速抽提液进行抽提，1～2h基本可以完成，且比较简单。当然，如有条件，使用RNA抽提试剂盒更好。从实验全局考虑，抽提快是优势所在。③有核细胞、细胞总RNA的保存有一定的技巧。从外周血分离出的有核细胞，如不马上进行RNA抽提，可直接冻于-80℃冰箱保存[3]。低温下酶活性几乎无，故对RNA存在有利。抽提出的细胞总RNA用75%乙醇悬浮后，分装多管，置于-20℃保存即可。该法比用无RNA水溶解保存更安全，后者需置-80℃保存。④在抽提过程中,吸取离心分层后含RNA的水相时动作要轻,宁少勿多,注意不要吸及下层的酚或蛋白,否则会影响以后的PCR反应。我们所测OD 260/280比值偏低的另一个原因在此。另外在电泳鉴定RNA时出现杂带也与此有关。
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逆转录PCR中，我们总结出几点经验供大家参考：①逆转录模板量与时间的选择。每次从标本中抽提出的RNA量有多有少，为了更好地进行逆转录，模板的量可适当多取，以保证逆转录酶发挥最大的作用。逆转录时间可灵活掌握，必要时可适当延长。②PCR反应条件的优化。退火温度较高的反应，一定要保证PCR仪的可靠。如果达不到预定温度，生成非特异性产物的可能性就大。我们在研究中反复探讨过这个问题，得出结论：非特异性产物的产生与退火温度不足有很大关系。③PCR产物的分析，一般采用琼脂糖凝胶电泳。如果DNA片段在200 bp以下，一般的琼脂糖凝胶区分DNA条带的能力较差，这时选用聚丙烯酰胺凝胶电泳可大大提高分辨率。
参考文献
1 Vessella RL,Blouke KA,Stray JE,et al. The use of the polymerase chain reaction to detect metastatic prostate cancer in lymph nodes and bone marrow.Proceedings of the American Association for Cancer Res,1992,33:2367
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2 Gerhard M, Juhl H, Kalthoff H, et al. Specific detection of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction.Journal of Clinical Oncology,1994， 12(4):725
3 Jonas S, Windeatt S, Boateng AO, et al. Identification of carcinoembryonic antigen-producing cells circulating in the blood of patients with colorectal carcinoma by reverse transcriptase polymerase chain reaction.Gut,1996， 39:717, http://www.100md.com