夹竹桃叶中一种阿拉伯半乳葡聚糖的化学结构
作者：李文雍 董群 方积年
单位：(李文雍)安徽省阜阳师范学院生物系(236000)；(董群 方积年)中国科学院上海药物研究所
关键词：夹竹桃；多糖；阿拉伯半乳
中草药991203摘 要 夹竹桃叶用3% Na2CO3 溶液提取，经DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析，Sephadex G-200 凝胶过滤法分离纯化，得到一种中性异多糖NIB-1，分子量为4 300，[α]20D+114.7°(c，0.2，H2O)，由L-Ara，D-Gal和D-Glc构成。用化学分析及NMR方法研究了其化学结构，由1，4连接的α-D-葡萄糖残基构成主链，阿拉伯糖和半乳糖分布于支链上，有多种分支形式，分支点在葡萄糖残基的6-O上。
, 百拇医药
Chemical Strucure of an Arabinogalactoglucan from
Sweet-scented Oleander Leaves (Nerium indicum)
Li wenyong Dong Qun Fang Jinian et al.
(Department of Biology, Fuyang Normal College, Fuyang 236000)
Abstract From the fresh leaves of Nerium indicum Mill., a neutral polysaccharide NIB-1 was isolated by extraction with 3% aqueous sodium carbonate, and with fractionation using DEAE-Sephadex A-25 and Sephadex G-200 chromatography. NIB-1 was shown to be homogeneous by HPGPC, and had a molecular weight of 4 300, and [α]20D+114.7° (c, 0.2， H2O). It was composed of L-arabinose, D-galactose and D-glucose, in the molar ratios of 1∶6∶10. Its main structural features were elucidated by methylation analysis, periodate oxidation, partial acid hydrolysis and 1H and 13CNMR spectroscopy. The data available indicated that NIB-1 has a backbone consisting of α (1→4) linked glucosyl residues, with branches at the O-6, composed of arabinosyl and galactosyl residues.
, 百拇医药
Key words Nerium indicum Mill. polysaccharide arabinogalactoglucan
夹竹桃是广为分布的常绿藻木，常见的有白花夹竹桃 Nerium indicum Mill. 和红花夹竹桃 N. odorum，属夹竹桃科，其叶有毒性，已知其中含有多种夹竹桃苷，此外还有生物碱，萜类，树脂，挥发油等成分[1]，有报道研究了同属植物欧洲夹竹桃 N. oleander 中的2种果胶类酸性多糖的化学结构和药理活性[2，3]，但没有关于白花夹竹桃中多糖组分的报道。笔者报道白花夹竹桃叶经水提后，用3% Na2CO3 溶液进一步提取而得到的一种新结构中性多糖的性质及化学结构。
1 仪器与材料
夹竹桃叶于1993年10月采集自武汉，采集后立即浸泡于75%乙醇溶液中。
, 百拇医药
IR用 Perkin-Elmer 599B红外光谱仪测定；旋光度用W22-15自动旋光仪测定；气相色谱：5% OV-225/AW-DMCS-Chromosorb W(80-100 mesh)。柱长1.3 m，糖组成分析：205 ℃；甲基化分析：170 ℃；过碘酸盐氧化产物分别用150 ℃，205 ℃两种温度条件进行分析；高效液相色谱：Bio-Rad 1330色谱仪，色谱柱：TSK-40，TSK-50二柱串联，示差仪：Shodex RI SE-51。减压蒸发均在<45 ℃下进行。
1H及13CNMR谱用 Brucker AM-400核磁共振仪在室温下记录，样品50 mg溶于0.5 mL D2O中。
2 提取与分离
新采集的夹竹桃叶3.2 kg在75%乙醇中于室温浸泡6 d，过滤，残渣风干后用沸水提取3次(20 L×3)，每次8 h，提取液另行处理，残渣用3%碳酸钠溶液10 L于5 ℃下提取8 h，提取液用2 mol/L HCl中和至pH 7.0，用流动水透析3 d，浓缩，加3倍体积乙醇，沉淀离心分离后依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤，真空干燥，得粗多糖NIB(3.3 g)，将其溶于100 mL水中，上DEAE-Sephadex A-25柱(Cl-型，80 cm×2.6 cm)，先用水洗脱，再用0～2 mol/L NaCl梯度洗脱，旋光法检测，得到NIB-1(137 mg)，NIB-2(745 mg)，NIB-3(545 mg)。各组分再经Sephadex G-200凝胶柱层析(90 cm×2.6 cm)进一步纯化。NIB-1经纯化后重71 mg，与碘-碘化钾试剂无呈色反应，在高效凝胶过滤色谱中呈单一对称峰，表明其为均一组分。高效凝胶过滤法测得其分子量为4 300[4]，[α]20D+114.7°(c, 0.2, H2O)。
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3 结构鉴定
3.1 组成分析：NIB-1(6 mg)溶于2 mol/L TFA 4 mL中，110 ℃封管水解2 h，减压蒸发除去TFA，水解产物用Pei-纤维素薄层板TLC法分析，展开溶剂：乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水(5∶5∶1∶3)，苯胺-邻苯二甲酸试剂显色。TLC表明不含糖醛酸，为中性多糖。剩余水解产物转变为糖醇乙醇酯后进行GC分析，结果表明NIB-1由L-阿拉伯糖，D-半乳糖和D-葡葡糖组成，摩尔比为1∶6∶10。
3.2 甲基化分析：NIB-1(6 mg)用改进的Hakomori法进行甲基化[5]，直至在IR谱中显示无羟基吸收峰(3 500 cm-1)，用90%甲酸100 ℃水解6 h，蒸干，再用2 mol/L TFA 100 ℃水解10 h，去酸后用 NaBH4还原，乙酰化(Ac2O，100 ℃ 1 h)，然后进行气相层析和气质联用分析。甲基化分析的结果见表1，葡萄糖主要以1，4和1，4，6连接的形式存在，此外还有少量位于非还原末端，半乳糖位于非还原末端或以1，3连接存在，甲基化位置表明葡萄糖和半乳糖均呈吡喃型，阿拉伯糖呈呋喃型，位于非还原末端或以1，3连接的形式存在。以上结果表明，该多糖含有较多分枝，分枝点在葡萄糖的4位或6位，由于存在较多→4)Glc(1→，可能由1→4连接的葡萄糖残基构成主链，在6-O上有分枝。
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表1 NIB-1和S2部分水解产物的甲基化分析 化学组成
克分分子比
联结形式
NIB-1
S2
2，3，5-Me3-Ara
3.3
Ara(1→
2，5-Me2-Ara
1.8
→3)Ara(1→
, 百拇医药
2，3，4，6-Me4-Gal
18.2
2
Gal(1→
2，4，6-Me3-Gal
10.6
1
→3)Gal(1→
2，3，4，6-Me4-Glc
3.2
Glc(1→
, 百拇医药
2，3，6-Me3-Glc
39.1
1
→4)Glc(1→
2，3-Me2-Glc
20.5
1
→4，6)Glc(1→
2，3，4-Me3-Glc
1
→6)Glc(1→
, 百拇医药
3.3 部分酸水解：为了进一步确定化学结构，对NIB-1进行部分酸水解，NIB-1(25 mg)溶于0.1 mol/L TFA(5 mL)中于100 ℃水解2 h，蒸去TFA，产物溶于4 mL水中，对蒸馏水透析(500 mL×3)，外液蒸干，然后溶于2 mL水中，上Sephadex G-15柱(90 cm×1.6 cm)，水洗脱，示差法检测，从中得到S1(2.0 mg)和S2(6.0 mg)两个组分，S1用TLC和GC分析确定为单糖混合物，含有L-Ara和D-Glc，摩尔比为：0.42∶1.00，这表明葡萄糖的1→4连接发生了部分水解，若葡萄糖通过1，4连接形成主链，以上水解必然会形成寡糖或较小分子量的多糖，阿拉伯糖因是呋喃型戊糖所以易被水解下来。S2为一寡糖，其1HNMR谱中1，4连接α-D-葡萄糖残基的H-1信号(δ 5.42， 1H)明显减弱，说明它是由葡萄糖间的1，4糖苷键断裂而形成的，根据1HNMR谱中信号的面积和甲基化分析的结构(表1)，该寡糖由6个残基构成结构可能如图1所示。1，3连接的D-Gal也可能位于主链上，但根据已知多糖的结构特征，这种可能性较小。
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图1 S2的化学结构式
不能透析的部分为S3(13.0 mg)，用Sephadex G-75柱纯化，用HPGPC法测得分子量约为2 000，说明由1→4连接的葡萄糖残基构成的主链发生断裂。
3.4 过碘酸盐氧化及产物分析：NIB-1取20 mg用0.017 mol/L NaIO4在5 ℃下于暗处进行氧化，用分光光度法测定NaIO4的消耗量[6]，氧化在4 d后进行完全，加入乙二醇0.2 mL以分解剩余的过碘酸钠，反应液对蒸馏水透析，加入NaBH4 100 mg还原生成的产物(20 ℃，10 h)，用1 mol/L TFA 100 ℃水解10 h，对蒸馏水透析(1 L×3)，不能透析的部分浓缩后冻干，用2 mol/L TFA水解(100 ℃，6 h)，蒸去TFA后依次进行还原，乙酰化，产物用GC进行分析，含有L-Ara，D-Gal，赤藓醇和丙三醇，表明有些阿拉伯糖和半乳糖未被氧化，因为它们在3位发生取代。
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3.5 核磁共振分析：1HNMR谱提供了各种糖基异头碳的构型信息，糖组成分析表明葡萄糖含量高于半乳糖，部分酸水解中葡萄糖部分被除去时，δ 5.45的信号明显减弱，位于δ 5.45(J1，23.0 Hz，3H)和δ 5.02(J1，23.3 Hz，2H)两个信号分别来自于1，4-和1，4，6-连接的葡萄糖，化学位移大于5.0，J1，2在3.0左右表明它们呈α构型，而在δ 4.68(J1，2～7.7 Hz，3H)的信号表明半乳糖呈β构型，阿拉伯糖由于含量较低，观察不到相应的异头质子信号。NIB-1的13CNMR谱在异头碳区有3个信号：δ 106.75对应于β-构型的D-Gal的C1，而δ 102.03和δ 100.16处的信号来源于α-D-Glc，在CH2区有明显的取代信号(δ 68.21)，表明有些葡萄糖的6位发生了取代，主链葡萄糖残基被取代的C-4信号在δ 80.05。
, 百拇医药
根据以上结果确定NIB-1具有如下结构特征：以1→4的α-D-葡萄糖残基构成主链，其中约三分之一的6位上有分歧，支链主要是β-D-Galp(1→3)β-D-Galp(1→和β-D-Galp(1→，此外还含有其它含量较少的支链，如：L-Araf(1→3)L-Araf(1→，DGlcp(1→，L-Araf(1→，它们也取代在主链葡萄糖的O-6上。此外部分非还原端的葡萄糖和阿拉伯糖也可能连接于β-D-Gal的3位上。在植物多糖中，α(1→4)连接的葡聚糖通常为淀粉，但NIB-1遇碘不呈蓝色，说明其结构不同于淀粉，可能是由于该多糖较多的分支影响主链的溶液构象，阻碍了碘与多糖的结合。
参考文献
1 中国医学科学院药物研究所编.中草药有效成分的研究.北京：人民卫生出版社，1972：392
, 百拇医药
2 Oezel H Z, et al. Ger Offen De, 1990, 22:3, 915, 999
3 Mueller B K M, et al. Pharmazie, 1991, 46:657
4 魏远安，等.药学学报，1989，24：532
5 方积年，等.化学学报，1988，46：1101
6 Ikenaka T, et al. J Biochem, 1963,54:328
收稿日期：1999-01-11, 百拇医药
单位：(李文雍)安徽省阜阳师范学院生物系(236000)；(董群 方积年)中国科学院上海药物研究所
关键词：夹竹桃；多糖；阿拉伯半乳
中草药991203摘 要 夹竹桃叶用3% Na2CO3 溶液提取，经DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析，Sephadex G-200 凝胶过滤法分离纯化，得到一种中性异多糖NIB-1，分子量为4 300，[α]20D+114.7°(c，0.2，H2O)，由L-Ara，D-Gal和D-Glc构成。用化学分析及NMR方法研究了其化学结构，由1，4连接的α-D-葡萄糖残基构成主链，阿拉伯糖和半乳糖分布于支链上，有多种分支形式，分支点在葡萄糖残基的6-O上。
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Chemical Strucure of an Arabinogalactoglucan from
Sweet-scented Oleander Leaves (Nerium indicum)
Li wenyong Dong Qun Fang Jinian et al.
(Department of Biology, Fuyang Normal College, Fuyang 236000)
Abstract From the fresh leaves of Nerium indicum Mill., a neutral polysaccharide NIB-1 was isolated by extraction with 3% aqueous sodium carbonate, and with fractionation using DEAE-Sephadex A-25 and Sephadex G-200 chromatography. NIB-1 was shown to be homogeneous by HPGPC, and had a molecular weight of 4 300, and [α]20D+114.7° (c, 0.2， H2O). It was composed of L-arabinose, D-galactose and D-glucose, in the molar ratios of 1∶6∶10. Its main structural features were elucidated by methylation analysis, periodate oxidation, partial acid hydrolysis and 1H and 13CNMR spectroscopy. The data available indicated that NIB-1 has a backbone consisting of α (1→4) linked glucosyl residues, with branches at the O-6, composed of arabinosyl and galactosyl residues.
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Key words Nerium indicum Mill. polysaccharide arabinogalactoglucan
夹竹桃是广为分布的常绿藻木，常见的有白花夹竹桃 Nerium indicum Mill. 和红花夹竹桃 N. odorum，属夹竹桃科，其叶有毒性，已知其中含有多种夹竹桃苷，此外还有生物碱，萜类，树脂，挥发油等成分[1]，有报道研究了同属植物欧洲夹竹桃 N. oleander 中的2种果胶类酸性多糖的化学结构和药理活性[2，3]，但没有关于白花夹竹桃中多糖组分的报道。笔者报道白花夹竹桃叶经水提后，用3% Na2CO3 溶液进一步提取而得到的一种新结构中性多糖的性质及化学结构。
1 仪器与材料
夹竹桃叶于1993年10月采集自武汉，采集后立即浸泡于75%乙醇溶液中。
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IR用 Perkin-Elmer 599B红外光谱仪测定；旋光度用W22-15自动旋光仪测定；气相色谱：5% OV-225/AW-DMCS-Chromosorb W(80-100 mesh)。柱长1.3 m，糖组成分析：205 ℃；甲基化分析：170 ℃；过碘酸盐氧化产物分别用150 ℃，205 ℃两种温度条件进行分析；高效液相色谱：Bio-Rad 1330色谱仪，色谱柱：TSK-40，TSK-50二柱串联，示差仪：Shodex RI SE-51。减压蒸发均在<45 ℃下进行。
1H及13CNMR谱用 Brucker AM-400核磁共振仪在室温下记录，样品50 mg溶于0.5 mL D2O中。
2 提取与分离
新采集的夹竹桃叶3.2 kg在75%乙醇中于室温浸泡6 d，过滤，残渣风干后用沸水提取3次(20 L×3)，每次8 h，提取液另行处理，残渣用3%碳酸钠溶液10 L于5 ℃下提取8 h，提取液用2 mol/L HCl中和至pH 7.0，用流动水透析3 d，浓缩，加3倍体积乙醇，沉淀离心分离后依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤，真空干燥，得粗多糖NIB(3.3 g)，将其溶于100 mL水中，上DEAE-Sephadex A-25柱(Cl-型，80 cm×2.6 cm)，先用水洗脱，再用0～2 mol/L NaCl梯度洗脱，旋光法检测，得到NIB-1(137 mg)，NIB-2(745 mg)，NIB-3(545 mg)。各组分再经Sephadex G-200凝胶柱层析(90 cm×2.6 cm)进一步纯化。NIB-1经纯化后重71 mg，与碘-碘化钾试剂无呈色反应，在高效凝胶过滤色谱中呈单一对称峰，表明其为均一组分。高效凝胶过滤法测得其分子量为4 300[4]，[α]20D+114.7°(c, 0.2, H2O)。
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3 结构鉴定
3.1 组成分析：NIB-1(6 mg)溶于2 mol/L TFA 4 mL中，110 ℃封管水解2 h，减压蒸发除去TFA，水解产物用Pei-纤维素薄层板TLC法分析，展开溶剂：乙酸乙酯-吡啶-乙酸-水(5∶5∶1∶3)，苯胺-邻苯二甲酸试剂显色。TLC表明不含糖醛酸，为中性多糖。剩余水解产物转变为糖醇乙醇酯后进行GC分析，结果表明NIB-1由L-阿拉伯糖，D-半乳糖和D-葡葡糖组成，摩尔比为1∶6∶10。
3.2 甲基化分析：NIB-1(6 mg)用改进的Hakomori法进行甲基化[5]，直至在IR谱中显示无羟基吸收峰(3 500 cm-1)，用90%甲酸100 ℃水解6 h，蒸干，再用2 mol/L TFA 100 ℃水解10 h，去酸后用 NaBH4还原，乙酰化(Ac2O，100 ℃ 1 h)，然后进行气相层析和气质联用分析。甲基化分析的结果见表1，葡萄糖主要以1，4和1，4，6连接的形式存在，此外还有少量位于非还原末端，半乳糖位于非还原末端或以1，3连接存在，甲基化位置表明葡萄糖和半乳糖均呈吡喃型，阿拉伯糖呈呋喃型，位于非还原末端或以1，3连接的形式存在。以上结果表明，该多糖含有较多分枝，分枝点在葡萄糖的4位或6位，由于存在较多→4)Glc(1→，可能由1→4连接的葡萄糖残基构成主链，在6-O上有分枝。
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表1 NIB-1和S2部分水解产物的甲基化分析 化学组成
克分分子比
联结形式
NIB-1
S2
2，3，5-Me3-Ara
3.3
Ara(1→
2，5-Me2-Ara
1.8
→3)Ara(1→
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2，3，4，6-Me4-Gal
18.2
2
Gal(1→
2，4，6-Me3-Gal
10.6
1
→3)Gal(1→
2，3，4，6-Me4-Glc
3.2
Glc(1→
, 百拇医药
2，3，6-Me3-Glc
39.1
1
→4)Glc(1→
2，3-Me2-Glc
20.5
1
→4，6)Glc(1→
2，3，4-Me3-Glc
1
→6)Glc(1→
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3.3 部分酸水解：为了进一步确定化学结构，对NIB-1进行部分酸水解，NIB-1(25 mg)溶于0.1 mol/L TFA(5 mL)中于100 ℃水解2 h，蒸去TFA，产物溶于4 mL水中，对蒸馏水透析(500 mL×3)，外液蒸干，然后溶于2 mL水中，上Sephadex G-15柱(90 cm×1.6 cm)，水洗脱，示差法检测，从中得到S1(2.0 mg)和S2(6.0 mg)两个组分，S1用TLC和GC分析确定为单糖混合物，含有L-Ara和D-Glc，摩尔比为：0.42∶1.00，这表明葡萄糖的1→4连接发生了部分水解，若葡萄糖通过1，4连接形成主链，以上水解必然会形成寡糖或较小分子量的多糖，阿拉伯糖因是呋喃型戊糖所以易被水解下来。S2为一寡糖，其1HNMR谱中1，4连接α-D-葡萄糖残基的H-1信号(δ 5.42， 1H)明显减弱，说明它是由葡萄糖间的1，4糖苷键断裂而形成的，根据1HNMR谱中信号的面积和甲基化分析的结构(表1)，该寡糖由6个残基构成结构可能如图1所示。1，3连接的D-Gal也可能位于主链上，但根据已知多糖的结构特征，这种可能性较小。
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图1 S2的化学结构式
不能透析的部分为S3(13.0 mg)，用Sephadex G-75柱纯化，用HPGPC法测得分子量约为2 000，说明由1→4连接的葡萄糖残基构成的主链发生断裂。
3.4 过碘酸盐氧化及产物分析：NIB-1取20 mg用0.017 mol/L NaIO4在5 ℃下于暗处进行氧化，用分光光度法测定NaIO4的消耗量[6]，氧化在4 d后进行完全，加入乙二醇0.2 mL以分解剩余的过碘酸钠，反应液对蒸馏水透析，加入NaBH4 100 mg还原生成的产物(20 ℃，10 h)，用1 mol/L TFA 100 ℃水解10 h，对蒸馏水透析(1 L×3)，不能透析的部分浓缩后冻干，用2 mol/L TFA水解(100 ℃，6 h)，蒸去TFA后依次进行还原，乙酰化，产物用GC进行分析，含有L-Ara，D-Gal，赤藓醇和丙三醇，表明有些阿拉伯糖和半乳糖未被氧化，因为它们在3位发生取代。
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3.5 核磁共振分析：1HNMR谱提供了各种糖基异头碳的构型信息，糖组成分析表明葡萄糖含量高于半乳糖，部分酸水解中葡萄糖部分被除去时，δ 5.45的信号明显减弱，位于δ 5.45(J1，23.0 Hz，3H)和δ 5.02(J1，23.3 Hz，2H)两个信号分别来自于1，4-和1，4，6-连接的葡萄糖，化学位移大于5.0，J1，2在3.0左右表明它们呈α构型，而在δ 4.68(J1，2～7.7 Hz，3H)的信号表明半乳糖呈β构型，阿拉伯糖由于含量较低，观察不到相应的异头质子信号。NIB-1的13CNMR谱在异头碳区有3个信号：δ 106.75对应于β-构型的D-Gal的C1，而δ 102.03和δ 100.16处的信号来源于α-D-Glc，在CH2区有明显的取代信号(δ 68.21)，表明有些葡萄糖的6位发生了取代，主链葡萄糖残基被取代的C-4信号在δ 80.05。
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根据以上结果确定NIB-1具有如下结构特征：以1→4的α-D-葡萄糖残基构成主链，其中约三分之一的6位上有分歧，支链主要是β-D-Galp(1→3)β-D-Galp(1→和β-D-Galp(1→，此外还含有其它含量较少的支链，如：L-Araf(1→3)L-Araf(1→，DGlcp(1→，L-Araf(1→，它们也取代在主链葡萄糖的O-6上。此外部分非还原端的葡萄糖和阿拉伯糖也可能连接于β-D-Gal的3位上。在植物多糖中，α(1→4)连接的葡聚糖通常为淀粉，但NIB-1遇碘不呈蓝色，说明其结构不同于淀粉，可能是由于该多糖较多的分支影响主链的溶液构象，阻碍了碘与多糖的结合。
参考文献
1 中国医学科学院药物研究所编.中草药有效成分的研究.北京：人民卫生出版社，1972：392
, 百拇医药
2 Oezel H Z, et al. Ger Offen De, 1990, 22:3, 915, 999
3 Mueller B K M, et al. Pharmazie, 1991, 46:657
4 魏远安，等.药学学报，1989，24：532
5 方积年，等.化学学报，1988，46：1101
6 Ikenaka T, et al. J Biochem, 1963,54:328
收稿日期：1999-01-11, 百拇医药