鼻咽癌中EB病毒和p53蛋白表达的检测
作者：姚敏 刘强 康苏娅
单位：姚敏 刘强(苏州医学院病理学教研室，苏州，215007)；康苏娅(苏州医学院附属第一医院病理科)
关键词：鼻咽癌；EB病毒；p53蛋白
苏州医学院学报991211 摘要 目的 检测43例鼻咽癌组织中EB病毒感染和p53蛋白表达情况，并探讨它们与鼻咽癌发生的关系。方法 EBER-1核酸原位杂交及LMP-1和p53免疫组织化学技术。结果 29例EBER-1阳性(67.4%)，22例LMP-1阳性(51%)，42例p53蛋白阳性(97%)。EBER-1和LMP-1阳性率低分化癌(分别为77.8%和59.3%)高于角化型鳞癌(分别为37.5%和12.5%，P<0.05)，p53蛋白阳性程度在不同组织学类型中也有一定的差别。结论 EB病毒感染和p53蛋白过度表达与鼻咽癌的发生关系密切。
中图法分类 R739.63
, http://www.100md.com
Detectionof EB Virus and p53 Overexpression in Naso pharyngeal Carcinoma
Yao Min,Liu Qiang,Kang Suya
(Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective To investigate EB virus infection and p53 p rotein overexpression in 43 cases of nasopharyngeal carcinoma.Methods EBER-1 in situ hybridization and immunohistochemistry with antibody to L MP-1 and p53 protein were applied.Results 29 cases were EBER-1 positive;22 were LMP-1 positive and 42 were p53 protein positive.EBER-1 and LMP-1 were more likely to be positive in poorly differentiated cases than in well differentiated ones.And the degree of p53 protein positivity was also varied in different histological types.Conclusion EB virus infection and p53 protein overexpression are closely a ssociated with the dovelopment of nasopharyngeal carcinoma.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal carcinoma； EB virus； p53 protein
鼻咽癌是中国东南沿海地区常见恶性肿瘤之一，患者的血清学检查和肿瘤组织的核酸杂交检测均表明EB病毒与其发生有密切关系。p53抑癌基因的功能异常与人类多种癌肿的发生有关，鼻咽癌组织中也常有p53蛋白的过度表达。但EB病毒感染和p53蛋白过度表达的关系尚不清楚。我们检测了鼻咽癌组织中EB病毒的感染状态和p53蛋白的表达情况，并探讨它们之间的关系。
1 材料和方法
1.1 病例资料：苏州医学院附属第一医院病理科鼻咽癌石蜡保存组织43例，其中男25例，女18例，年龄18～72岁，平均49岁。经重新包埋、切片，常规HE染色。鼻咽癌组织学分类依WHO方法分为角化型鳞癌8例，非角化型鳞癌8例，未分化癌27例。14例癌旁带有正常上皮。另5例鳞状上皮不典型增生。
, http://www.100md.com
1.2 免疫组化：使用单抗为抗EBVLMP-1(CS1-4)(Dakopatts产品)和抗p53蛋白(DO-7，1801)(Novocastra产品)，采用Strep-avidin-biotion方法，碱性磷酸酶底物反应呈红色。
1.3 核酸原位杂交：2μm石蜡切片经脱蜡，蛋白酶K消化，FITC标记EBER-1探针预杂交和杂交处理，抗FITC抗体免疫反应显色。阳性者呈深紫兰色反应，位于细胞核内。
2 结果
2.1 原位杂交显示29例EBER-1阳性表达均位于肿瘤细胞核内，其中14例癌旁正常上皮和5例不典型增生上皮均为阴性。2例癌组织EBER-1阴性的病例，间质中少数淋巴细胞EBER-1阳性。绝大多数EBER-1阳性病例中，阳性表达见于几乎所有癌细胞；2例阳性癌细胞约占50%；4例阳性表达见于极少数癌细胞，其中2例是角化型鳞癌。LMP-1免疫组化染色见癌细胞呈胞膜和胞浆阳性反应，14例正常上皮和5例不典型增生上皮均阴性。EBER-1和LMP-1阳性表达在不同组织学类型中有显著性差别(见表1)。
, 百拇医药
表1 43例鼻咽癌EBER-1和LMP-1阳性结果〔n(%)〕 组织学类型
n
EBER-1(+)
LMP-1(+)
SCC
NKC
UC
总计
8
8
27
43
, http://www.100md.com 3(37.5)
5(62.5)
21(77.8)*
29(67.4)
1(12.5)
5(62.5)*
16(59.3)*
22(51.2)
SCC为角化型鳞癌，NKC为非角化型鳞癌，UC为未分化癌；*与SCC比较，P<0.05
2.2 p53蛋白阳性表达见于癌细胞核内。依据p53阳性癌细胞比例进行半定量[6]，1%～10%为+，10%～50%为++，>50%为+++。两种抗p53蛋白单抗免疫组化染色结果见表2。5例不典型性增生上皮亦为阳性，14例正常上皮阴性。D0-7总阳性率为98%，1801总阳性率为84%，两种抗体有较好的相关性。角化型鳞癌P53蛋白阳性程度低于非角化型鳞癌和未分化癌，但差别无显著性意义(P>0.05)。
, http://www.100md.com
表2 43例鼻咽癌p53蛋白阳性结果 组织学类型
n
D0-7
1801
+
++
+++
+
++
+++
SCC
NKC
UC
, 百拇医药
总计
8
8
27
43
3
2
7
12
3
2
10
15
2
, 百拇医药
4
9
15
4
5
14
23
1
1
7
9
0
2
2
, 百拇医药
4
2.3 22例LMP-1阳性病例p53蛋白均阳性，21例LMP-1阴性病例中20例p53蛋白均有多少不等的阳性表达。
3 讨论
3.1 目前检测组织EB病毒DNA或RNA存在的方法有PCR和原位杂交等。EBER-1是EB病毒编码的一种RNA，在病毒潜在感染的细胞内有大量拷贝(可达108)，因此原位杂交检测EBER-1是确定EB病毒感染的一个敏感可靠的方法。鼻咽癌组织中EB病毒检出率因实验方法、地区差别和癌组织学类型而不同，从59%至84%不等[1～4]。本组43例鼻咽癌，29例癌组织中检出EBER-1(67.4%)，且阳性病例绝大多数癌细胞内均见病毒核酸存在，而14例癌旁正常上皮细胞中未见EBER-1阳性表达，说明鼻咽癌的生长与EB病毒感染关系密切，特别是在未分化癌和低分化癌，EB病毒阳性率高于分化较好的角化型鳞癌，且后者多为少部分癌细胞有病毒存在。
, 百拇医药
3.2 LMP-1是EB病毒编码的一种潜在膜蛋白(EBV latent membrane protein 1)，在体外有转化上皮细胞的作用，并可能与EB病毒致癌作用有关。本组中LMP-1在鼻咽癌组织中的表达约51%，且非角化鳞癌和未分化癌明显高于角化型鳞癌，说明LMP-1的表达与肿瘤细胞的分化程度有关。
3.3 p53基因功能异常与人类多种恶性肿瘤的发生有关。免疫组化方法测定鼻咽癌组织p53蛋白过度表达结果差别很大，从23%至96%不等[1，5，6]，这种巨大差异与抗体的选用、免疫组化方法的不同及石蜡包埋组织抗原修复的程度有关。本组鼻咽癌p53蛋白阳性率达98%。在不同组织学类型，p53蛋白阳性程度有差别，癌组织分化差者，p53蛋白阳性癌细胞比例升高。从这点上说，p53蛋白以及上述EBER-1和LMP-1的表达及其阳性程度对了解鼻咽癌的恶性程度和患者预后有参考价值。另外，在鼻咽正常上皮到不典型增生直至癌这个发展过程中，p53蛋白的表达由阴性到阳性，提示p53蛋白检测对癌前状态的判断有一定的辅助意义。
, http://www.100md.com
癌肿的发生是多因素多阶段的复杂过程。目前的资料说明，EB病毒感染和p53异常与鼻咽癌的发生发展有关，但两者之间的关系尚不清楚。鼻咽癌组织p53基因的突变率很低，因此多数鼻咽癌p53蛋白过度表达与p53基因突变关系不大[7]，其过度表达可能发生在蛋白水平。本研究显示LMP-1与p53过度表达无显著相关性。而且5例不典型增生鳞状上皮p53蛋白阳性，EB病毒有关表达阴性，说明除EB病毒外尚有其它因素与p53过度表达有关，EB病毒和p53蛋白过度表达均与鼻咽癌发生关系密切。有研究[8，9]表明，EB病毒编码的蛋白BZLF和EBNA5可能与p53蛋白结合，使之积聚并失活，这些可能性将有待进一步研究。
(本实验部分工作完成于日本福冈大学医学部第1病理室，在此对菊池昌弘教授 和大岛孝一教授表示感谢)
参考文献
1 Niedobitek G,et al.P53 overexpression and Epstein-Barr virus infection in undifferentiated and squamous cell nasopharyngeal carcinomas.J path ol,1993,170∶457
, 百拇医药
2 陈小毅，等.良、恶性鼻咽活检组织中EB病毒DNA检测、EBNA的分型及表达.中华 病理学杂志，1994，23∶220
3 郭琳琅，等.抗凋亡基因bcl-2在EB病毒相关性鼻咽癌中的表达.临床与实验病理 学杂志，1997，13∶123
4 Gulley ML,et al.Epstein-Barr virus infection is associated with P53 a ccumulation in nasopharyngeal carcinoma.Hum Pathol,1998,29∶252
5 郑天荣，等.98例鼻咽癌8项免疫组化检测和癌基因研究.福建医药杂志，1996， 18∶1
6 Sheu LF,et al.Expression of P53 protein in nasopharyngeal carcinoma.J pathol,1994,172∶294
, 百拇医药
7 Chakrani F,et al.Mutations clustered in exon 5 of the P53 gene in prim ary nasopharyngeal carcinomas from southeastern Asia.Int J Cancer,1995,61∶316
8 Zhang Q,et al.Functional and physical interaction between P53 and BILF 1∶implications for Epstein-Barr virus latency.Mol cell Biol,1994,14∶1929
9 Szekely L,et al.EBNA-5,an Epstein-Barr virus encoded nuclear antigen, binds to the retinoblastoma and P53 proteins.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90∶545 5
(1999年6月25日收稿), 百拇医药
单位：姚敏 刘强(苏州医学院病理学教研室，苏州，215007)；康苏娅(苏州医学院附属第一医院病理科)
关键词：鼻咽癌；EB病毒；p53蛋白
苏州医学院学报991211 摘要 目的 检测43例鼻咽癌组织中EB病毒感染和p53蛋白表达情况，并探讨它们与鼻咽癌发生的关系。方法 EBER-1核酸原位杂交及LMP-1和p53免疫组织化学技术。结果 29例EBER-1阳性(67.4%)，22例LMP-1阳性(51%)，42例p53蛋白阳性(97%)。EBER-1和LMP-1阳性率低分化癌(分别为77.8%和59.3%)高于角化型鳞癌(分别为37.5%和12.5%，P<0.05)，p53蛋白阳性程度在不同组织学类型中也有一定的差别。结论 EB病毒感染和p53蛋白过度表达与鼻咽癌的发生关系密切。
中图法分类 R739.63
, http://www.100md.com
Detectionof EB Virus and p53 Overexpression in Naso pharyngeal Carcinoma
Yao Min,Liu Qiang,Kang Suya
(Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective To investigate EB virus infection and p53 p rotein overexpression in 43 cases of nasopharyngeal carcinoma.Methods EBER-1 in situ hybridization and immunohistochemistry with antibody to L MP-1 and p53 protein were applied.Results 29 cases were EBER-1 positive;22 were LMP-1 positive and 42 were p53 protein positive.EBER-1 and LMP-1 were more likely to be positive in poorly differentiated cases than in well differentiated ones.And the degree of p53 protein positivity was also varied in different histological types.Conclusion EB virus infection and p53 protein overexpression are closely a ssociated with the dovelopment of nasopharyngeal carcinoma.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal carcinoma； EB virus； p53 protein
鼻咽癌是中国东南沿海地区常见恶性肿瘤之一，患者的血清学检查和肿瘤组织的核酸杂交检测均表明EB病毒与其发生有密切关系。p53抑癌基因的功能异常与人类多种癌肿的发生有关，鼻咽癌组织中也常有p53蛋白的过度表达。但EB病毒感染和p53蛋白过度表达的关系尚不清楚。我们检测了鼻咽癌组织中EB病毒的感染状态和p53蛋白的表达情况，并探讨它们之间的关系。
1 材料和方法
1.1 病例资料：苏州医学院附属第一医院病理科鼻咽癌石蜡保存组织43例，其中男25例，女18例，年龄18～72岁，平均49岁。经重新包埋、切片，常规HE染色。鼻咽癌组织学分类依WHO方法分为角化型鳞癌8例，非角化型鳞癌8例，未分化癌27例。14例癌旁带有正常上皮。另5例鳞状上皮不典型增生。
, http://www.100md.com
1.2 免疫组化：使用单抗为抗EBVLMP-1(CS1-4)(Dakopatts产品)和抗p53蛋白(DO-7，1801)(Novocastra产品)，采用Strep-avidin-biotion方法，碱性磷酸酶底物反应呈红色。
1.3 核酸原位杂交：2μm石蜡切片经脱蜡，蛋白酶K消化，FITC标记EBER-1探针预杂交和杂交处理，抗FITC抗体免疫反应显色。阳性者呈深紫兰色反应，位于细胞核内。
2 结果
2.1 原位杂交显示29例EBER-1阳性表达均位于肿瘤细胞核内，其中14例癌旁正常上皮和5例不典型增生上皮均为阴性。2例癌组织EBER-1阴性的病例，间质中少数淋巴细胞EBER-1阳性。绝大多数EBER-1阳性病例中，阳性表达见于几乎所有癌细胞；2例阳性癌细胞约占50%；4例阳性表达见于极少数癌细胞，其中2例是角化型鳞癌。LMP-1免疫组化染色见癌细胞呈胞膜和胞浆阳性反应，14例正常上皮和5例不典型增生上皮均阴性。EBER-1和LMP-1阳性表达在不同组织学类型中有显著性差别(见表1)。
, 百拇医药
表1 43例鼻咽癌EBER-1和LMP-1阳性结果〔n(%)〕 组织学类型
n
EBER-1(+)
LMP-1(+)
SCC
NKC
UC
总计
8
8
27
43
, http://www.100md.com 3(37.5)
5(62.5)
21(77.8)*
29(67.4)
1(12.5)
5(62.5)*
16(59.3)*
22(51.2)
SCC为角化型鳞癌，NKC为非角化型鳞癌，UC为未分化癌；*与SCC比较，P<0.05
2.2 p53蛋白阳性表达见于癌细胞核内。依据p53阳性癌细胞比例进行半定量[6]，1%～10%为+，10%～50%为++，>50%为+++。两种抗p53蛋白单抗免疫组化染色结果见表2。5例不典型性增生上皮亦为阳性，14例正常上皮阴性。D0-7总阳性率为98%，1801总阳性率为84%，两种抗体有较好的相关性。角化型鳞癌P53蛋白阳性程度低于非角化型鳞癌和未分化癌，但差别无显著性意义(P>0.05)。
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表2 43例鼻咽癌p53蛋白阳性结果 组织学类型
n
D0-7
1801
+
++
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+
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+++
SCC
NKC
UC
, 百拇医药
总计
8
8
27
43
3
2
7
12
3
2
10
15
2
, 百拇医药
4
9
15
4
5
14
23
1
1
7
9
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2
, 百拇医药
4
2.3 22例LMP-1阳性病例p53蛋白均阳性，21例LMP-1阴性病例中20例p53蛋白均有多少不等的阳性表达。
3 讨论
3.1 目前检测组织EB病毒DNA或RNA存在的方法有PCR和原位杂交等。EBER-1是EB病毒编码的一种RNA，在病毒潜在感染的细胞内有大量拷贝(可达108)，因此原位杂交检测EBER-1是确定EB病毒感染的一个敏感可靠的方法。鼻咽癌组织中EB病毒检出率因实验方法、地区差别和癌组织学类型而不同，从59%至84%不等[1～4]。本组43例鼻咽癌，29例癌组织中检出EBER-1(67.4%)，且阳性病例绝大多数癌细胞内均见病毒核酸存在，而14例癌旁正常上皮细胞中未见EBER-1阳性表达，说明鼻咽癌的生长与EB病毒感染关系密切，特别是在未分化癌和低分化癌，EB病毒阳性率高于分化较好的角化型鳞癌，且后者多为少部分癌细胞有病毒存在。
, 百拇医药
3.2 LMP-1是EB病毒编码的一种潜在膜蛋白(EBV latent membrane protein 1)，在体外有转化上皮细胞的作用，并可能与EB病毒致癌作用有关。本组中LMP-1在鼻咽癌组织中的表达约51%，且非角化鳞癌和未分化癌明显高于角化型鳞癌，说明LMP-1的表达与肿瘤细胞的分化程度有关。
3.3 p53基因功能异常与人类多种恶性肿瘤的发生有关。免疫组化方法测定鼻咽癌组织p53蛋白过度表达结果差别很大，从23%至96%不等[1，5，6]，这种巨大差异与抗体的选用、免疫组化方法的不同及石蜡包埋组织抗原修复的程度有关。本组鼻咽癌p53蛋白阳性率达98%。在不同组织学类型，p53蛋白阳性程度有差别，癌组织分化差者，p53蛋白阳性癌细胞比例升高。从这点上说，p53蛋白以及上述EBER-1和LMP-1的表达及其阳性程度对了解鼻咽癌的恶性程度和患者预后有参考价值。另外，在鼻咽正常上皮到不典型增生直至癌这个发展过程中，p53蛋白的表达由阴性到阳性，提示p53蛋白检测对癌前状态的判断有一定的辅助意义。
, http://www.100md.com
癌肿的发生是多因素多阶段的复杂过程。目前的资料说明，EB病毒感染和p53异常与鼻咽癌的发生发展有关，但两者之间的关系尚不清楚。鼻咽癌组织p53基因的突变率很低，因此多数鼻咽癌p53蛋白过度表达与p53基因突变关系不大[7]，其过度表达可能发生在蛋白水平。本研究显示LMP-1与p53过度表达无显著相关性。而且5例不典型增生鳞状上皮p53蛋白阳性，EB病毒有关表达阴性，说明除EB病毒外尚有其它因素与p53过度表达有关，EB病毒和p53蛋白过度表达均与鼻咽癌发生关系密切。有研究[8，9]表明，EB病毒编码的蛋白BZLF和EBNA5可能与p53蛋白结合，使之积聚并失活，这些可能性将有待进一步研究。
(本实验部分工作完成于日本福冈大学医学部第1病理室，在此对菊池昌弘教授 和大岛孝一教授表示感谢)
参考文献
1 Niedobitek G,et al.P53 overexpression and Epstein-Barr virus infection in undifferentiated and squamous cell nasopharyngeal carcinomas.J path ol,1993,170∶457
, 百拇医药
2 陈小毅，等.良、恶性鼻咽活检组织中EB病毒DNA检测、EBNA的分型及表达.中华 病理学杂志，1994，23∶220
3 郭琳琅，等.抗凋亡基因bcl-2在EB病毒相关性鼻咽癌中的表达.临床与实验病理 学杂志，1997，13∶123
4 Gulley ML,et al.Epstein-Barr virus infection is associated with P53 a ccumulation in nasopharyngeal carcinoma.Hum Pathol,1998,29∶252
5 郑天荣，等.98例鼻咽癌8项免疫组化检测和癌基因研究.福建医药杂志，1996， 18∶1
6 Sheu LF,et al.Expression of P53 protein in nasopharyngeal carcinoma.J pathol,1994,172∶294
, 百拇医药
7 Chakrani F,et al.Mutations clustered in exon 5 of the P53 gene in prim ary nasopharyngeal carcinomas from southeastern Asia.Int J Cancer,1995,61∶316
8 Zhang Q,et al.Functional and physical interaction between P53 and BILF 1∶implications for Epstein-Barr virus latency.Mol cell Biol,1994,14∶1929
9 Szekely L,et al.EBNA-5,an Epstein-Barr virus encoded nuclear antigen, binds to the retinoblastoma and P53 proteins.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90∶545 5
(1999年6月25日收稿), 百拇医药