吸烟对外源性弹性蛋白酶诱发的大白鼠肺气肿的影响
作者：孔英君 张一梅 王 敏 石玉枝
单位：孔英君 张一梅 王 敏 石玉枝 哈尔滨医科大学第一临床医院呼吸内科，150001
关键词：吸烟；弹性蛋白酶；肺气肿
New Page 1 [摘 要]目的 探讨吸烟在肺气肿发病中的作用。方法 将实验大白鼠分为香烟组、弹性酶组、复合组及对照组四组，分别给予吸烟、气管内注入弹性蛋白酶，7周后测定大白鼠的肺泡平均线性截距(MLI)、平均肺泡数(MAN)、肺置换水容量(TLV)。测定血清弹性蛋白酶抑制力(SEIC)及血清胰蛋白酶抑制力(STIC)。应用方差分析进行统计学处理。结果 形态学变化：肉眼及光镜下可见复合组有明显肺气肿表现，弹性酶组有轻度肺气肿变化，香烟组及对照组无变化。复合组及弹性酶组动物的MLI、MAN有明显变化，P<0.01，香烟组变化不明显，P>0.05。血清学结果：各组动物的SEIC及STIC无明显变化，P>0.05。结论 吸烟增强外源性弹性蛋白酶诱发的大白鼠的肺气肿。
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[中图分类号]R 563.3；R 363.2 [文献标识码]A [文章编号]1002-1949(1999)12-0704-03
A study of the influence of smoking on white rats′ pneumonectasis induced by exogenous proelastase
KONG Ying-jun,ZHANG Yi-mei,WANG Min,et al. Department of Respiratory Disease,First Clinical Medical College,Harbin Medical University,Harbin 150001, China
[Abstract]Objective To explore the influence of smoking on the pathogeny of peneumonectasis.Methods Divided the experiment white rats into four groups-smoking group,exogenous proelastase group,combined group and control group.Given the groups smoking,exogenous proelastase injected through tracchea,respectively.Seven weeks later,detected MLI and of these white rats* pulmonary alveoli,TLV,SEIC and STIC,then analyzed the data statistically by analysis of variance.Results ①Morphological change pneumonectasis was noticed under naked eyes and optical microscope in combined;only slight pncumonectasis change could be seen in exogenous proelastase group MLI,MAN in both combined exogenous proelastase group have changed noticeably,P<0.01 While no obvious change happened in smoking group,P>0.05. ②Serolgical results:In the four groups,no great change in SEIC and STIC happened.Conclusion Smoking can increase white rats* pneumonectasis induced by exogeaous proelastase.
, 百拇医药
[Key words]Smoking； Exogenous proelastase； Pneumonectasis
肺气肿是呼吸系统中危害较大的疾病，发病机理仍在探讨中。人们逐渐认识到，肺气肿的发生除了与遗传、肺损伤、感染和营养不良等多种因素有关外，吸烟也是肺蛋白酶—抗蛋白酶平衡失调导致肺气肿的主要因素之一[1]。本研究观察了吸烟对外源性弹性蛋白酶引起肺气肿的影响。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作及取材
40只纯种雄性Wistar大白鼠(100～150 g)，随机分为四组，每组10只。
香烟组：每日暴露于香烟雾中2小时，持续7周，第4周时气管内注入0.85%生理盐水1 ml。
, 百拇医药
弹性酶组：正常喂养7周，第4周时气管内注入弹性酶溶液1 ml(180 U/ml)[2]。
复合组：每日暴露于香烟雾中2小时，持续7周，第4周时气管内注入弹性酶溶液1 ml(180 U/ml)。
对照组：正常喂养7周，第4周时气管内注入0.85%生理盐水1 ml。
试验7周后，戊巴比妥麻醉动物，右心房采血2 ml，离心得血清。主动脉放血处死，肺脏用10%福尔马林溶液灌注固定，保持25 cmH2O压力30分钟，置于10%福尔马林溶液固定24小时以上，测肺置换水容量(TLV)，每只动物肺脏矢状面取材四块，酒精、正丁醇脱水，HE、Wegert纤维染色，光学显微镜下观察。
1.2 定量分析
1.2.1 平均线性截距(MLI)[3]：光镜下观察肺泡间隔数。
, 百拇医药
1.2.2 平均肺泡数(MAN)[4]：光镜下观察单位面积内平均肺泡数。
1.2.3 肺置换水容量(TLV)：肺脏置于水中排出的水量。
1.2.4 血清弹性蛋白酶抑制力(SEIC)测定[5]：应用琼脂扩散法(mg/ml)。
1.2.5 血清胰蛋白酶抑制力(STIC)测定[5]：应用分光光度法(mg/ml)。
1.3 应用方差分析进行统计学处理。
2 结果
2.1 形态学结果
香烟组和复合组肺脏肉眼观察变黄，局部有焦油点沉积，复合组的肺脏可见有局部区域脏层胸膜下气腔增大，而弹性酶组仅有轻度变化，对照组及香烟组肉眼见无肺气肿征象。
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光镜下，香烟组动物可见有肺泡巨噬细胞及少量中性白细胞在终末细支气管内聚集。复合组动物出现肺泡管、肺泡囊及肺泡发生扩张及破坏，弹性纤维减少、破碎，巨噬细胞及中性粒细胞在终末细支气管内聚集。弹性酶组有同样但程度较轻的变化。对照组无变化。
测定各组动物MLI、MAN及TLV。见表1。
表1 四组动物MLI、MAN及TLV
MLI(cm×10-4)
MAN(cm2×10-4)
TLV(ml)
对照组
51.38±1.61
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60.88±3.03
7.19±0.85
香烟组
50.01±1.83
58.40±1.20
8.001±1.000
弹性酶组
30.07±1.24
41.64±2.57
10.55±1.13
复合组
18.06±2.34
, 百拇医药
24.76±6.27
11.59±1.586
统计学意义详见图1，2，3。
图1 平均线性截距MLI(cm×10-4)
图2 平均肺泡数MAN(cm2×10-4)
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图3 肺置换水容量TLV(ml)
2.2 生化学结果(见表2)
表2 四组实验动物SEIC及STIC
SEIC(mg/ml)
STIC(mg/ml)
香烟组
1.430±0.042
0.52±0.10
弹性酶组
1.415±0.036
0.43±0.13
, 百拇医药
复合组
1.450±0.030
0.40±0.25
对照组
1.410±0.038
0.44±0.25
试验动物各组SEIC及STIC均无统计学差异(P>0.05)。
3 讨论
本研究的一个重要结论是单纯吸烟不能引起肺气肿，但吸烟结合其它因素诱发肺气肿时可作为一个辅助因素。本实验中起作用的第一因素是外源性弹性蛋白酶。而在人类肺疾病中没有类似的损伤形成，但是急性损伤，如可以发生感染的急性损伤(支气管炎等)，人类肺脏需承受相当量的内源性的主要由巨噬细胞和中性白细胞产生的弹性蛋白酶。我们认为，伴随吸烟的这些损伤可能导致肺气肿。
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形态学显示，经弹性酶处置后的动物暴露于香烟雾中，肺气肿程度明显大于单纯气管内注入弹性酶的动物，而单纯暴露于香烟雾中的动物只有肺泡炎性细胞浸润，无明显的肺气肿病变，从而证明香烟吸入可促进弹性蛋白酶诱发的肺气肿进展。其机制可能是：①动物由气管内注入弹性酶后，肺内弹力纤维断裂、破坏，引起肺泡腔扩大，肺弹性回缩力下降。②吸烟可引起肺泡巨噬细胞和中性白细胞聚集，许多研究证明，这两种细胞是弹性蛋白酶的主要来源，而且香烟的气相烟雾中富含氧化剂，这两种来源的氧化剂可以抑制α1-AT的活性，从而引起肺内弹性蛋白酶-抗蛋白酶失衡，致使肺弹力纤维破坏。同时，吸烟可以抑制弹性蛋白的合成和修复，加重肺气肿的病变。③本实验中单纯吸烟的动物未能引起肺气肿的病变，可能是由于吸烟只作为一个辅助因素在诱发肺气肿中起作用，或者可能因为相对短期吸烟，未能使动物产生肺气肿的病变，或者与易于患肺气肿的种属有关。但可以肯定，吸烟可以强化弹性蛋白酶引起的大白鼠的肺气肿。
测定血清SEIC和STIC结果表明，弹性酶组、香烟组、复合组及对照组动物间的SEIC及STIC无显著差异。
, 百拇医药
已经明确，α1-AT是一种急性相反应蛋白质，感染等应激因素使其迅速增高。而SEIC主要由α1-AT决定，α1-AT升高一定会导致SEIC增加。给动物注入弹性酶属于一种应激因素，但本实验注入弹性酶组的动物SEIC未升高，可能与病期较长，机体应激反映阶段已经结束有关。
香烟组实验动物SEIC没有降低，并非说明香烟对α1-AT缺乏氧化作用。它可能体现了吸烟者循环中的抗蛋白酶的补偿机制。因为香烟可引起肺内弹性酶活性增高，并可氧化α1-AT，二者均可以引起机体代偿性产生和释放α1-AT增加，使弹性酶与抑制因子在高水平上达到平衡，由于一些因素的影响，又可在高水平上达到平衡。已经证明，体内α1-AT具有功能和无功能两部分，α1-AT浓度与SEIC呈正相关[6]，由于氧化失活α1-AT在吸烟时功能活性下降，α1-AT浓度代偿性增高，血清中α1-AT不具有活性的比例增加，有功能部分代偿性在正常范围内，所以SEIC也可表现为不降低。我们认为吸烟者血中α1-AT含量和功能不低于正常是不足以说明α1-AT功能未受其影响的。此时发生了代偿性α1-AT浓度和活性增高，弹性酶活力也显著增高，甚至超过α1-AT可以将其抑制的水平。
, 百拇医药
结果显示各实验组动物间的STIC无明显差异。弹性酶组及复合组的STIC正常，可能是由于α1-AT抑制胰蛋白酶和弹性蛋白酶的机制不同，香烟组中的STIC正常可能是香烟中的氧化物浓度不高或烟雾中有某种对α1-AT的胰蛋白酶抑制部位有保护作用的物质存在有关，具体机制尚不清楚。
肺气肿的发展是一个慢性过程，吸烟作为一个辅助因素可加快其病程。
参考文献
[1]Himan LM,Stevens CA,Matthay RA,et al.Elastase and lysocyme activities in human alveolar macrophages[J].Am Rev Respir Dis,1980，121：263-271.
[2]Raub JA,Mercer RR,Miller FJ,et al.Does responnse of elastase-induced emphysema in humsters[J].Am Rev Respir Dis,1982，125：432-435.
, 百拇医药
[3]Dunnill MS.Quantitative methods in the study of pulmonary pathology[J].Thorax,1962，17：320-328.
[4]Snider GL,Agnes L,Korthy.Internai surface area and number of resperatory air space in elastase-induced emphyseman hamsters[J].Am Rev Respir Dis，1978，117：685-693.
[5]周双文.人血清抗胰蛋白酶功能测定的研究[J].中华结核和呼吸杂志，1987，10：342-343.
[6]Bridges RB,Kimmel DA,Wyatt RJ,et al.Serum antiproteases in smokers an nonsmokers[J].Am Rev Respir Dis，1985，132：1162-1169.
收稿：1999-04-25，修回：1999-06-29, 百拇医药
单位：孔英君 张一梅 王 敏 石玉枝 哈尔滨医科大学第一临床医院呼吸内科，150001
关键词：吸烟；弹性蛋白酶；肺气肿
New Page 1 [摘 要]目的 探讨吸烟在肺气肿发病中的作用。方法 将实验大白鼠分为香烟组、弹性酶组、复合组及对照组四组，分别给予吸烟、气管内注入弹性蛋白酶，7周后测定大白鼠的肺泡平均线性截距(MLI)、平均肺泡数(MAN)、肺置换水容量(TLV)。测定血清弹性蛋白酶抑制力(SEIC)及血清胰蛋白酶抑制力(STIC)。应用方差分析进行统计学处理。结果 形态学变化：肉眼及光镜下可见复合组有明显肺气肿表现，弹性酶组有轻度肺气肿变化，香烟组及对照组无变化。复合组及弹性酶组动物的MLI、MAN有明显变化，P<0.01，香烟组变化不明显，P>0.05。血清学结果：各组动物的SEIC及STIC无明显变化，P>0.05。结论 吸烟增强外源性弹性蛋白酶诱发的大白鼠的肺气肿。
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[中图分类号]R 563.3；R 363.2 [文献标识码]A [文章编号]1002-1949(1999)12-0704-03
A study of the influence of smoking on white rats′ pneumonectasis induced by exogenous proelastase
KONG Ying-jun,ZHANG Yi-mei,WANG Min,et al. Department of Respiratory Disease,First Clinical Medical College,Harbin Medical University,Harbin 150001, China
[Abstract]Objective To explore the influence of smoking on the pathogeny of peneumonectasis.Methods Divided the experiment white rats into four groups-smoking group,exogenous proelastase group,combined group and control group.Given the groups smoking,exogenous proelastase injected through tracchea,respectively.Seven weeks later,detected MLI and of these white rats* pulmonary alveoli,TLV,SEIC and STIC,then analyzed the data statistically by analysis of variance.Results ①Morphological change pneumonectasis was noticed under naked eyes and optical microscope in combined;only slight pncumonectasis change could be seen in exogenous proelastase group MLI,MAN in both combined exogenous proelastase group have changed noticeably,P<0.01 While no obvious change happened in smoking group,P>0.05. ②Serolgical results:In the four groups,no great change in SEIC and STIC happened.Conclusion Smoking can increase white rats* pneumonectasis induced by exogeaous proelastase.
, 百拇医药
[Key words]Smoking； Exogenous proelastase； Pneumonectasis
肺气肿是呼吸系统中危害较大的疾病，发病机理仍在探讨中。人们逐渐认识到，肺气肿的发生除了与遗传、肺损伤、感染和营养不良等多种因素有关外，吸烟也是肺蛋白酶—抗蛋白酶平衡失调导致肺气肿的主要因素之一[1]。本研究观察了吸烟对外源性弹性蛋白酶引起肺气肿的影响。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作及取材
40只纯种雄性Wistar大白鼠(100～150 g)，随机分为四组，每组10只。
香烟组：每日暴露于香烟雾中2小时，持续7周，第4周时气管内注入0.85%生理盐水1 ml。
, 百拇医药
弹性酶组：正常喂养7周，第4周时气管内注入弹性酶溶液1 ml(180 U/ml)[2]。
复合组：每日暴露于香烟雾中2小时，持续7周，第4周时气管内注入弹性酶溶液1 ml(180 U/ml)。
对照组：正常喂养7周，第4周时气管内注入0.85%生理盐水1 ml。
试验7周后，戊巴比妥麻醉动物，右心房采血2 ml，离心得血清。主动脉放血处死，肺脏用10%福尔马林溶液灌注固定，保持25 cmH2O压力30分钟，置于10%福尔马林溶液固定24小时以上，测肺置换水容量(TLV)，每只动物肺脏矢状面取材四块，酒精、正丁醇脱水，HE、Wegert纤维染色，光学显微镜下观察。
1.2 定量分析
1.2.1 平均线性截距(MLI)[3]：光镜下观察肺泡间隔数。
, 百拇医药
1.2.2 平均肺泡数(MAN)[4]：光镜下观察单位面积内平均肺泡数。
1.2.3 肺置换水容量(TLV)：肺脏置于水中排出的水量。
1.2.4 血清弹性蛋白酶抑制力(SEIC)测定[5]：应用琼脂扩散法(mg/ml)。
1.2.5 血清胰蛋白酶抑制力(STIC)测定[5]：应用分光光度法(mg/ml)。
1.3 应用方差分析进行统计学处理。
2 结果
2.1 形态学结果
香烟组和复合组肺脏肉眼观察变黄，局部有焦油点沉积，复合组的肺脏可见有局部区域脏层胸膜下气腔增大，而弹性酶组仅有轻度变化，对照组及香烟组肉眼见无肺气肿征象。
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光镜下，香烟组动物可见有肺泡巨噬细胞及少量中性白细胞在终末细支气管内聚集。复合组动物出现肺泡管、肺泡囊及肺泡发生扩张及破坏，弹性纤维减少、破碎，巨噬细胞及中性粒细胞在终末细支气管内聚集。弹性酶组有同样但程度较轻的变化。对照组无变化。
测定各组动物MLI、MAN及TLV。见表1。
表1 四组动物MLI、MAN及TLV
MLI(cm×10-4)
MAN(cm2×10-4)
TLV(ml)
对照组
51.38±1.61
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60.88±3.03
7.19±0.85
香烟组
50.01±1.83
58.40±1.20
8.001±1.000
弹性酶组
30.07±1.24
41.64±2.57
10.55±1.13
复合组
18.06±2.34
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24.76±6.27
11.59±1.586
统计学意义详见图1，2，3。
图1 平均线性截距MLI(cm×10-4)
图2 平均肺泡数MAN(cm2×10-4)
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图3 肺置换水容量TLV(ml)
2.2 生化学结果(见表2)
表2 四组实验动物SEIC及STIC
SEIC(mg/ml)
STIC(mg/ml)
香烟组
1.430±0.042
0.52±0.10
弹性酶组
1.415±0.036
0.43±0.13
, 百拇医药
复合组
1.450±0.030
0.40±0.25
对照组
1.410±0.038
0.44±0.25
试验动物各组SEIC及STIC均无统计学差异(P>0.05)。
3 讨论
本研究的一个重要结论是单纯吸烟不能引起肺气肿，但吸烟结合其它因素诱发肺气肿时可作为一个辅助因素。本实验中起作用的第一因素是外源性弹性蛋白酶。而在人类肺疾病中没有类似的损伤形成，但是急性损伤，如可以发生感染的急性损伤(支气管炎等)，人类肺脏需承受相当量的内源性的主要由巨噬细胞和中性白细胞产生的弹性蛋白酶。我们认为，伴随吸烟的这些损伤可能导致肺气肿。
, http://www.100md.com
形态学显示，经弹性酶处置后的动物暴露于香烟雾中，肺气肿程度明显大于单纯气管内注入弹性酶的动物，而单纯暴露于香烟雾中的动物只有肺泡炎性细胞浸润，无明显的肺气肿病变，从而证明香烟吸入可促进弹性蛋白酶诱发的肺气肿进展。其机制可能是：①动物由气管内注入弹性酶后，肺内弹力纤维断裂、破坏，引起肺泡腔扩大，肺弹性回缩力下降。②吸烟可引起肺泡巨噬细胞和中性白细胞聚集，许多研究证明，这两种细胞是弹性蛋白酶的主要来源，而且香烟的气相烟雾中富含氧化剂，这两种来源的氧化剂可以抑制α1-AT的活性，从而引起肺内弹性蛋白酶-抗蛋白酶失衡，致使肺弹力纤维破坏。同时，吸烟可以抑制弹性蛋白的合成和修复，加重肺气肿的病变。③本实验中单纯吸烟的动物未能引起肺气肿的病变，可能是由于吸烟只作为一个辅助因素在诱发肺气肿中起作用，或者可能因为相对短期吸烟，未能使动物产生肺气肿的病变，或者与易于患肺气肿的种属有关。但可以肯定，吸烟可以强化弹性蛋白酶引起的大白鼠的肺气肿。
测定血清SEIC和STIC结果表明，弹性酶组、香烟组、复合组及对照组动物间的SEIC及STIC无显著差异。
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已经明确，α1-AT是一种急性相反应蛋白质，感染等应激因素使其迅速增高。而SEIC主要由α1-AT决定，α1-AT升高一定会导致SEIC增加。给动物注入弹性酶属于一种应激因素，但本实验注入弹性酶组的动物SEIC未升高，可能与病期较长，机体应激反映阶段已经结束有关。
香烟组实验动物SEIC没有降低，并非说明香烟对α1-AT缺乏氧化作用。它可能体现了吸烟者循环中的抗蛋白酶的补偿机制。因为香烟可引起肺内弹性酶活性增高，并可氧化α1-AT，二者均可以引起机体代偿性产生和释放α1-AT增加，使弹性酶与抑制因子在高水平上达到平衡，由于一些因素的影响，又可在高水平上达到平衡。已经证明，体内α1-AT具有功能和无功能两部分，α1-AT浓度与SEIC呈正相关[6]，由于氧化失活α1-AT在吸烟时功能活性下降，α1-AT浓度代偿性增高，血清中α1-AT不具有活性的比例增加，有功能部分代偿性在正常范围内，所以SEIC也可表现为不降低。我们认为吸烟者血中α1-AT含量和功能不低于正常是不足以说明α1-AT功能未受其影响的。此时发生了代偿性α1-AT浓度和活性增高，弹性酶活力也显著增高，甚至超过α1-AT可以将其抑制的水平。
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结果显示各实验组动物间的STIC无明显差异。弹性酶组及复合组的STIC正常，可能是由于α1-AT抑制胰蛋白酶和弹性蛋白酶的机制不同，香烟组中的STIC正常可能是香烟中的氧化物浓度不高或烟雾中有某种对α1-AT的胰蛋白酶抑制部位有保护作用的物质存在有关，具体机制尚不清楚。
肺气肿的发展是一个慢性过程，吸烟作为一个辅助因素可加快其病程。
参考文献
[1]Himan LM,Stevens CA,Matthay RA,et al.Elastase and lysocyme activities in human alveolar macrophages[J].Am Rev Respir Dis,1980，121：263-271.
[2]Raub JA,Mercer RR,Miller FJ,et al.Does responnse of elastase-induced emphysema in humsters[J].Am Rev Respir Dis,1982，125：432-435.
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[3]Dunnill MS.Quantitative methods in the study of pulmonary pathology[J].Thorax,1962，17：320-328.
[4]Snider GL,Agnes L,Korthy.Internai surface area and number of resperatory air space in elastase-induced emphyseman hamsters[J].Am Rev Respir Dis，1978，117：685-693.
[5]周双文.人血清抗胰蛋白酶功能测定的研究[J].中华结核和呼吸杂志，1987，10：342-343.
[6]Bridges RB,Kimmel DA,Wyatt RJ,et al.Serum antiproteases in smokers an nonsmokers[J].Am Rev Respir Dis，1985，132：1162-1169.
收稿：1999-04-25，修回：1999-06-29, 百拇医药