雄黄抗白血病细胞多药耐药及其凋亡诱导关系的研究
作者：张 晨，黄世林
单位：中国人民解放军第210医院血液病中医研究所，大连 116021
关键词：雄黄；多药耐药；细胞凋亡
中国中医基础医学杂志991215 摘要：目的：研究抗白血病细胞耐药与细胞凋亡的关系。方法：采用MTT法测定细胞的敏感性，流式细胞仪测定细胞摄取DNR的荧光强度，以及bcl-2和P-gp的表达。采用AnnexinV细胞凋亡试剂盒，分析雄黄与DNR的协同作用。结果：雄黄对K562及K562/ADM的IC50无显著差异，且增加细胞内DNR含量，增强DNR的细胞毒作用，下调bcl-2和P-gp的表达。结论：雄黄与化疗药物间无交叉耐药性，而其抗细胞耐药有可能与bcl-2和P-gp下调有关。
中图分类号：R733.705 文献标识码：B
, 百拇医药
文章编号：1006-3250(1999)12-0064-03
近年来在对肿瘤细胞凋亡的研究中发现，许多肿瘤在形成多药耐药后，化疗药物诱导其凋亡过程也相应受阻[1]，提示肿瘤细胞的耐药形成与细胞凋亡存在着密切关系。中药雄黄主要成分为硫化砷，研究表明，雄黄对化疗药物耐药的复发急性早幼粒细胞白血病(APL)仍然有效，且有诱导细胞凋亡的作用[2、3]。本文采用K562细胞株及相应耐阿霉素的细胞株K562/ADM做实验模型，观察雄黄与化疗药物的协同作用。探讨耐药细胞的逆转与细胞凋亡的关系，为雄黄的临床应用提供实验基础和理论依据。
材料与方法
1 制剂
1%雄黄溶液由本研究所制备，方法参考文献[3]。
, 百拇医药
2 细胞培养
K562及K562/ADM细胞由大连医科大学提供。K562细胞常规培养于含10%小牛血清RPMI1640完全培养基中。K562/ADM细胞另加入阿霉素(1.0ug/ml)维持培养，取指数生长期细胞进行实验。
3 MTT法测定细胞毒性
将1-5×105/ml细胞植入96孔培养板内(200μl/孔)，同时加入不同浓度药物，常规培养48h，测定前4h加入MTT液(5mg/ml10ul，培养结束后加入0.04N盐酸异丙醇100ul，于全自动酶标光度计(595nm)测定每孔吸光度。由此求出细胞生长抑制50%的药物浓度，即IC50。
4 流式细胞仪(FCM)测定细胞内柔红霉素(DNR)萤光强度
, 百拇医药
24孔培养板内植入细胞1×106，加入DNR2μg/ml，除对照组外另加雄黄10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml。孵育3h后洗去游离DNR，上机检测。
5 雄黄与DNR的协同作用
采用AnnexinV凋亡试剂盒(Genzyme公司，具体操作按说明书进行。DNR浓度为2ug/ml，雄黄浓度分别为10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml。细胞数为1-5×106，37℃孵育3h后FCM检测。
6 bcl-2及p-gp的检测
药物作用不同时间收集细胞，PBS洗两遍，多聚甲醛固定。bc-l-2采用0.05%TritionX-100预处理，bcl-2和p-gp测定采用直按标记法(FITC标记的bc1-2及同型对照小鼠lgG1为Ancell公司产品；PE标记的P-gp和同型对照小鼠的lgG2a为Immuntech公司产品)，FCM检测。
, 百拇医药
结果
1 细胞毒性试验
K562和K562/ADM细胞的DNRIC50分别为0.63ug/ml和79.3ug/ml。K562/ADM细胞对DNR有明显的抗性。而K562和K562/ADM对雄黄的IC50接近，分别为69.7ug/ml和53.1ug/ml。
2 FCM测定细胞内DNR萤光强度
由图1可见雄黄明显增加了K562细胞DNR的摄入量。
图1 雄黄对K562/ADM细胞摄取DNR的影响(药物ug/ml)
, http://www.100md.com
3 雄黄与DNR的协同作用
DNR结合雄黄对K562/ADM细胞的影响见表1，其中AnnexinV阳性细胞为调亡细胞，PI阳性细胞为死亡细胞。
4 bcl-2和P-gp表达的测定
K562细胞bcl-2和P-gp表达分别为6.3%和9.1%，与其耐药细胞株K562/ADM有显著差异。由表2可见雄黄具有显著下调bcl-2和P-gp的表达。
表1 DNR结合雄黄对K562/ADM细胞的影响(
±s) 药物(ug/ml)
AnnexinV阳性(%)
, http://www.100md.com
PI阳性(%)
DNR2.0
6.57±3.56*
12.10±3.20*
DNR2.0+雄黄10.0
7.0±3.37
52.83±14.66**
DNR2.0+雄黄20.0
12.87±3.01**
69.67±10.99**
, 百拇医药
DNR2.0+雄黄30.0
13.53±3.61**
89.43±2.06**
注：**与*比较：P<0.05，N=3。讨论
中药雄黄辛温有毒，入肝胃经，具有解毒杀虫、燥湿祛风、化瘀消积作用。自60年代以来，我国一些医疗工作者采用含有雄黄的传统古方和单味雄黄，清热解毒，化瘀散积和以毒攻毒来治疗白血病，取得了一定疗效。我们研究所从80年代始用雄黄为主的复方青黛片治疗APL，临床上取得了良好的疗效[4]。实验研究表明，雄黄对HL-60、NB4、K562和K562/ADM细胞均有促凋亡的作用[3、5、6]。
表2 雄黄对K562/ADM细胞bcl-2,P-gp表达的影响(±s) 时间(h)
, 百拇医药
阳性率(%)
bcl-2
P-gp
0
53.23±10.22
64.23±8.86
24
52.1± 6.42
65.57±8.09
48
29.73±8.95*
52.27±5.33
, 百拇医药
72
28.0±9.61*
30.97±9.91*
注：*与对照组比较：P<0.05，N=3。
细胞凋亡是目前血液学研究的热点之一。bcl-2作为细胞凋亡的关键调控物在一些急性白血病呈高表达，而这些高表达的急性白血病对化疗药敏感性较差[7]。细胞内bcl-2水平升高所引发的耐药不同于mdr-1和P-gp为特征的经典耐药，两者共同或单独过度表达，均能导致患者对化疗药物的耐受。本研究结果发现，耐药的K562/ADM细胞bcl-2和P-gp均呈高表达，且对化疗药物有明显抗性，而对雄黄未见明显抗性，说明雄黄与化疗药无交叉耐药现象。另外经雄黄作用后，细胞摄取DNR的量增加，增加了DNR对K562/ADM的细胞毒作用，对bcl-2和P-gp也有显著的下调作用。上述结果提示，雄黄有可能作为一种良好的耐药逆转剂，应用于临床。
, http://www.100md.com
作者简介：张晨(1963-)，男，(汉族)，中国人民解放军第210医院主治医师，医学硕士，主要从事中医药抗白血病作用机理的研究。
参考文献
[1] Bourgeois S,Gruol DJ,Newby RF.Exprssion of an mdrgene is associated with a new form of resistance to dexanmet hasone-induced apoptosis.Mol Endo crino l,1993,7:840-851.
[2] 孔凡盛，蔡新吉，迟翠芳.复方青黛片治疗复发性急性早幼粒细胞白血病疗效观察.临床血液学杂志，1997，10(3)：103.
[3] 白月辉，黄世林.雄黄对NB4及HL-60细胞的促凋亡作用.中华血液学杂志，1998，19(9)：477-480.
, http://www.100md.com
[4] 黄世林，郭爱霞，向阳，等.复方青黛片为主治疗急性早幼粒细胞白血病的临床研究.中华血液学杂志，1995，16(1)：26-28.
[5] 张晨，黄世林，卢步蜂，等.雄黄诱导K562细胞凋亡的研究.中国中医基础医学杂志，1999，165(3)：30-31.
[6] 张晨，黄世林，邹丽娟，等.雄黄诱导K562/ADM细胞凋亡的研究.大连医科大学学报，1999，21(1)：11-12.
[7] Campos L,Roualut JP,Sabido O,et al.High exprssion of bcl-2 proteininacute my el oid leukemica cells in associated with poor response tochomotherapy.Blood,199 3,81:3091-3096.
(收稿日期 1998—06—28 修回日期：1999—08—12), 百拇医药
单位：中国人民解放军第210医院血液病中医研究所，大连 116021
关键词：雄黄；多药耐药；细胞凋亡
中国中医基础医学杂志991215 摘要：目的：研究抗白血病细胞耐药与细胞凋亡的关系。方法：采用MTT法测定细胞的敏感性，流式细胞仪测定细胞摄取DNR的荧光强度，以及bcl-2和P-gp的表达。采用AnnexinV细胞凋亡试剂盒，分析雄黄与DNR的协同作用。结果：雄黄对K562及K562/ADM的IC50无显著差异，且增加细胞内DNR含量，增强DNR的细胞毒作用，下调bcl-2和P-gp的表达。结论：雄黄与化疗药物间无交叉耐药性，而其抗细胞耐药有可能与bcl-2和P-gp下调有关。
中图分类号：R733.705 文献标识码：B
, 百拇医药
文章编号：1006-3250(1999)12-0064-03
近年来在对肿瘤细胞凋亡的研究中发现，许多肿瘤在形成多药耐药后，化疗药物诱导其凋亡过程也相应受阻[1]，提示肿瘤细胞的耐药形成与细胞凋亡存在着密切关系。中药雄黄主要成分为硫化砷，研究表明，雄黄对化疗药物耐药的复发急性早幼粒细胞白血病(APL)仍然有效，且有诱导细胞凋亡的作用[2、3]。本文采用K562细胞株及相应耐阿霉素的细胞株K562/ADM做实验模型，观察雄黄与化疗药物的协同作用。探讨耐药细胞的逆转与细胞凋亡的关系，为雄黄的临床应用提供实验基础和理论依据。
材料与方法
1 制剂
1%雄黄溶液由本研究所制备，方法参考文献[3]。
, 百拇医药
2 细胞培养
K562及K562/ADM细胞由大连医科大学提供。K562细胞常规培养于含10%小牛血清RPMI1640完全培养基中。K562/ADM细胞另加入阿霉素(1.0ug/ml)维持培养，取指数生长期细胞进行实验。
3 MTT法测定细胞毒性
将1-5×105/ml细胞植入96孔培养板内(200μl/孔)，同时加入不同浓度药物，常规培养48h，测定前4h加入MTT液(5mg/ml10ul，培养结束后加入0.04N盐酸异丙醇100ul，于全自动酶标光度计(595nm)测定每孔吸光度。由此求出细胞生长抑制50%的药物浓度，即IC50。
4 流式细胞仪(FCM)测定细胞内柔红霉素(DNR)萤光强度
, 百拇医药
24孔培养板内植入细胞1×106，加入DNR2μg/ml，除对照组外另加雄黄10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml。孵育3h后洗去游离DNR，上机检测。
5 雄黄与DNR的协同作用
采用AnnexinV凋亡试剂盒(Genzyme公司，具体操作按说明书进行。DNR浓度为2ug/ml，雄黄浓度分别为10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml。细胞数为1-5×106，37℃孵育3h后FCM检测。
6 bcl-2及p-gp的检测
药物作用不同时间收集细胞，PBS洗两遍，多聚甲醛固定。bc-l-2采用0.05%TritionX-100预处理，bcl-2和p-gp测定采用直按标记法(FITC标记的bc1-2及同型对照小鼠lgG1为Ancell公司产品；PE标记的P-gp和同型对照小鼠的lgG2a为Immuntech公司产品)，FCM检测。
, 百拇医药
结果
1 细胞毒性试验
K562和K562/ADM细胞的DNRIC50分别为0.63ug/ml和79.3ug/ml。K562/ADM细胞对DNR有明显的抗性。而K562和K562/ADM对雄黄的IC50接近，分别为69.7ug/ml和53.1ug/ml。
2 FCM测定细胞内DNR萤光强度
由图1可见雄黄明显增加了K562细胞DNR的摄入量。
图1 雄黄对K562/ADM细胞摄取DNR的影响(药物ug/ml)
, http://www.100md.com
3 雄黄与DNR的协同作用
DNR结合雄黄对K562/ADM细胞的影响见表1，其中AnnexinV阳性细胞为调亡细胞，PI阳性细胞为死亡细胞。
4 bcl-2和P-gp表达的测定
K562细胞bcl-2和P-gp表达分别为6.3%和9.1%，与其耐药细胞株K562/ADM有显著差异。由表2可见雄黄具有显著下调bcl-2和P-gp的表达。
表1 DNR结合雄黄对K562/ADM细胞的影响(
±s) 药物(ug/ml)AnnexinV阳性(%)
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PI阳性(%)
DNR2.0
6.57±3.56*
12.10±3.20*
DNR2.0+雄黄10.0
7.0±3.37
52.83±14.66**
DNR2.0+雄黄20.0
12.87±3.01**
69.67±10.99**
, 百拇医药
DNR2.0+雄黄30.0
13.53±3.61**
89.43±2.06**
注：**与*比较：P<0.05，N=3。讨论
中药雄黄辛温有毒，入肝胃经，具有解毒杀虫、燥湿祛风、化瘀消积作用。自60年代以来，我国一些医疗工作者采用含有雄黄的传统古方和单味雄黄，清热解毒，化瘀散积和以毒攻毒来治疗白血病，取得了一定疗效。我们研究所从80年代始用雄黄为主的复方青黛片治疗APL，临床上取得了良好的疗效[4]。实验研究表明，雄黄对HL-60、NB4、K562和K562/ADM细胞均有促凋亡的作用[3、5、6]。
表2 雄黄对K562/ADM细胞bcl-2,P-gp表达的影响(
±s) 时间(h), 百拇医药
阳性率(%)
bcl-2
P-gp
0
53.23±10.22
64.23±8.86
24
52.1± 6.42
65.57±8.09
48
29.73±8.95*
52.27±5.33
, 百拇医药
72
28.0±9.61*
30.97±9.91*
注：*与对照组比较：P<0.05，N=3。
细胞凋亡是目前血液学研究的热点之一。bcl-2作为细胞凋亡的关键调控物在一些急性白血病呈高表达，而这些高表达的急性白血病对化疗药敏感性较差[7]。细胞内bcl-2水平升高所引发的耐药不同于mdr-1和P-gp为特征的经典耐药，两者共同或单独过度表达，均能导致患者对化疗药物的耐受。本研究结果发现，耐药的K562/ADM细胞bcl-2和P-gp均呈高表达，且对化疗药物有明显抗性，而对雄黄未见明显抗性，说明雄黄与化疗药无交叉耐药现象。另外经雄黄作用后，细胞摄取DNR的量增加，增加了DNR对K562/ADM的细胞毒作用，对bcl-2和P-gp也有显著的下调作用。上述结果提示，雄黄有可能作为一种良好的耐药逆转剂，应用于临床。
, http://www.100md.com
作者简介：张晨(1963-)，男，(汉族)，中国人民解放军第210医院主治医师，医学硕士，主要从事中医药抗白血病作用机理的研究。
参考文献
[1] Bourgeois S,Gruol DJ,Newby RF.Exprssion of an mdrgene is associated with a new form of resistance to dexanmet hasone-induced apoptosis.Mol Endo crino l,1993,7:840-851.
[2] 孔凡盛，蔡新吉，迟翠芳.复方青黛片治疗复发性急性早幼粒细胞白血病疗效观察.临床血液学杂志，1997，10(3)：103.
[3] 白月辉，黄世林.雄黄对NB4及HL-60细胞的促凋亡作用.中华血液学杂志，1998，19(9)：477-480.
, http://www.100md.com
[4] 黄世林，郭爱霞，向阳，等.复方青黛片为主治疗急性早幼粒细胞白血病的临床研究.中华血液学杂志，1995，16(1)：26-28.
[5] 张晨，黄世林，卢步蜂，等.雄黄诱导K562细胞凋亡的研究.中国中医基础医学杂志，1999，165(3)：30-31.
[6] 张晨，黄世林，邹丽娟，等.雄黄诱导K562/ADM细胞凋亡的研究.大连医科大学学报，1999，21(1)：11-12.
[7] Campos L,Roualut JP,Sabido O,et al.High exprssion of bcl-2 proteininacute my el oid leukemica cells in associated with poor response tochomotherapy.Blood,199 3,81:3091-3096.
(收稿日期 1998—06—28 修回日期：1999—08—12), 百拇医药