p16 mRNA及其蛋白、EGFR在脑胶质瘤中的表达
作者：金永健 金玉兰 李龙山
单位：(吉林省延边大学医学院病理学教研室，延吉 133000)
关键词：脑肿瘤；神经；胶质瘤；p16；受体，表皮生长因子
临床与实验病理学杂志000112 摘要 目的:通过观察脑胶质瘤中p16 mRNA及其蛋白、EGFR的表达，探讨其在脑胶质瘤发生、发展中的作用。方法:应用原位杂交技术和免疫组织化学方法在38例人脑胶质瘤中检测p16 mRNA及其蛋白、EGFR的表达。以7例正常组织作为对照。结果:p16mRNA和p16蛋白在Ⅲ～Ⅳ级、Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织中的阳性表达率分别为8.3%, 16.7%; 57.7%, 57.7%; 71.4%, 85.7%。EGFR在Ⅲ～Ⅳ级、Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织中的阳性表达率分别为83.3%, 38.5%, 14.3%。结论:p16基因缺失引起的p16蛋白的表达降低、EGFR的过表达在脑胶质瘤的发生中起重要的作用。
, 百拇医药
中图分类号 R739.41 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)01-0038-03
Expression of p16 mRNA and its protein, EGFR in the cerebral glioma
Jin Yongjian， Jin Yulan， Li Longshan
(Dept of Pathol, Yanbian University Medical College, Yanbian 133000)
ABSTRACT Purpose To investigate the effects of p16 mRNA and its protein, EGFR in the tumorigenesis of the cerebral glioma.Methods The expression of p16 mRNA and its protein, EGFR was detected in 38 cases of the cerebral glioma using in situ hybridization and immunohistochemical staining. Seven normal brain tissues were used as control. Results The positive expression rate of p16 mRNA and p16 protein in Ⅲ～Ⅳ、Ⅰ～Ⅱgroups of glioma and normal tissues was 8.3%, 16.7% ; 57.7%，57.7% ; 71.4%, 85.7%, respectively. The positive expression rate of EGFR in Ⅲ～Ⅳ、Ⅰ～Ⅱgroups of glioma and normal tissues was 83.3%, 38.5%, 14.3%, respectively. Conclusion Descended expression of p16 protein is due to the deletion of p16 mRNA.Descended expression of p16 protein and excessive expression of EGFR may play an important role in the tumorigenesis of cerebral glioma.
, 百拇医药
KEY WORDS brain neoplasms; glioma；p16；receptors,epidermal growth factor
脑胶质瘤是发病率较高的神经系统疾病之一，目前对胶质瘤的治疗主要依靠手术、放疗及化疗等方法。由于胶质瘤有极易复发的特性，治疗效果不能令人满意，迄今对胶质瘤的致病机制尚无确切了解。作者通过原位杂交技术和免疫组织化学方法检测原发性脑胶质瘤中的p16 mRNA及其蛋白和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的表达，并探讨其在胶质瘤发生、发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 收集我院附属医院病理科存档的脑胶质瘤标本38例，包括Ⅰ级17例、Ⅱ级9例、Ⅲ级8例、Ⅳ级4例(按1993年WHO分类)。男女比例为21∶17，平均年龄40.3岁。另取7例正常脑组织(来自新鲜尸体解剖脑组织标本)作为正常对照。全部标本均为10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。
, 百拇医药
1.2 试剂 原位杂交用生物素标记p16mRNA探针购自北京医科大学病理学教研室。p16、EGFR抗体、S-P试剂盒均为美国Zymed公司产品。
1.3 方法
1.3.1 原位杂交 (1)石蜡切片脱蜡至水；(2)0.1 mol/L甘氨酸洗5 min; (3)0.4% Triton X-100洗5 min；(4)PBS冲洗后蛋白酶K消化30 min；(5)4%多聚甲醛后固定15 min；(6)PBS冲洗后，新鲜配制的乙酸酐处理15 min；(7)2×SSC冲洗10 min；(8)滴加不含探针的杂交液在37℃孵育1～2 h；(9)滴加含p16 mRNA探针的杂交液，95℃变性5 min；(10)37℃水浴进行杂交反应12～16 h；(11)冲洗过剩的探针；(12)加碱性磷酸酶卵白素(1∶200稀释)37℃，30 min；(13) PBS洗5 min 3次；(14)NBT/BCIP显色；(15)逐级脱水、透明、中性树胶封片。
, 百拇医药
1.3. 2 免疫组织化学染色 实验操作按S-P试剂盒说明书进行，并略加修正。其步骤如下：(1) 石蜡切片脱蜡至水；(2) 3% H2O2、甲醇， 37℃, 10 min；(3)PBS洗5 min 3次；(4)微波抗原修复；(5)10%羊血清20 min；(6)加一抗(工作浓度p16、EGFR为1∶50)4℃，过夜；(7) PBS洗5 min 3次；(8)加二抗(工作浓度1∶200), 37℃, 20 min；(9)PBS洗5 min 3次；(10)加三抗(工作浓度1∶200)，37℃, 20 min；(11)PBS洗5 min 3次；(12)DAB显色；(13)流水充分冲洗；(14)苏木精复染；(15)流水充分冲洗；(16)逐级脱水、透明、中性树胶封片。
1.4 结果判断
1.4.1 p16 mRNA原位杂交阳性信号呈紫蓝色，阴性区域不着色(图1)；p16蛋白阳性信号呈棕黄色，位于细胞浆；EGFR阳性信号呈棕黄色，位于细胞膜(图2)。
, 百拇医药
1.4.2 免疫组织化学染色中阳性细胞数<10%为阴性，>10%为阳性。
1.5 统计学处理 统计学处理应用确切概率法进行比较。
图1 脑胶质瘤中p16 mRNA的表达。ISH×400
图2 脑胶质瘤中EGFR的表达。S-P×400
2 结果
2.1 p16 mRNA、p16蛋白在人脑胶质瘤中的表达 p16 mRNA及其蛋白在人脑胶质瘤及正常组织中均有一定程度的表达，其阳性表达率见表1、2。
, 百拇医药 表1 p16 mRNA在人脑胶质瘤中的表达 组 织
n
阳性例数
阳性率(%)
Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤
12
1
8.3*
Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤
26
15
57.7
, 百拇医药 正常组织
7
5
71.4
*与Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织比较，P<0.025表2 p16蛋白在人脑胶质瘤中的表达 组 织
n
阳性例数
阳性率(%)
Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤
12
2
16.7*
, 百拇医药
Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤
26
15
57.7
正常组织
7
6
85.7
*与Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织比较，P<0.025
2.2 EGFR在人脑胶质瘤中的表达 EGFR在人脑胶质瘤中呈现较高的阳性表达，见表3。
表3 EGFR在人脑胶质瘤中的表达 组 织
, 百拇医药
n
阳性例数
阳性率(%)
Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤
12
10
83.3*
Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤
26
10
38.5
正常组织
7
, http://www.100md.com
1
14.3
*与Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织比较，P<0.025
2.3 胶质瘤中p16蛋白阴性伴EGFR阳性的协同表达 见表4。
表4 胶质瘤中p16蛋白阴性伴EGFR阳性的协同表达 组 织
n
p16蛋白(-)伴EGFR(+)例数
表达率(%)
Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤
12
8
, 百拇医药
66.7*
Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤
26
2
7.6
正常组织
7
0
0
*与Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织比较，P<0.0253 讨论
p16又称MTS1(multiple tumor suppressor 1)是人们发现的第一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因，其产物p16蛋白能特异地抑制细胞周期依赖激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)的活性，使之不能解除视网膜母细胞瘤基因蛋白( Rb)对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖。故p16蛋白在细胞周期的调控中起负性调节作用。p16蛋白的丢失和突变在多种恶性肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用〔1～3〕。研究发现，在人原发性脑肿瘤中，特别是恶性度高的胶质瘤中常有p16基因的缺失〔4〕。本实验结果表明，p16 mRNA及其蛋白在Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中的表达率低于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤和正常组织, 且两者表达呈正相关。因此，推测恶性胶质瘤的发生与p16基因缺失引起的p16蛋白的表达降低有密切关系。
, http://www.100md.com
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)作为原癌基因c-erb-1的基因产物，是一种具有磷酸化功能的跨膜蛋白，在上皮增生过程的膜信息转换中起重要作用〔5〕。多数学者的研究认为EGFR激活并过表达时通过邻近和自泌机制促进癌细胞自身及邻近细胞不断增殖，导致瘤细胞不断生长并表现恶性行为。本实验结果表明，EGFR随着脑胶质瘤的恶性度增高，其阳性率也显著增高，在Ⅲ～Ⅳ级中胶质瘤的EGFR阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤和正常组织。这一结果与Fullerr等的研究结果基本一致〔6〕。由此说明胶质瘤的恶性转化与EGFR的过表达有关。
结合p16蛋白的表达和EGFR的表达进行观察，发现p16蛋白的表达与EGFR的表达成负相关，同时出现两者异常改变多存在于Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤，与Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤和正常组织比较有显著差异。从而提示，p16蛋白的表达降低和EGFR的过表达，特别是两者同时异常表达时可能有协同和促进胶质瘤恶性发展的作用。
, 百拇医药
作者简介：金永健，男，32岁，主治医师
参考文献
1，Kamb A, Gruis NA, Weaver Feldhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994; 265: 436～440
2，Marx J. New tumor suppressor may rival p53.Science, 1994; 264: 344～345
3，Serrano M, Hannon GJ, Beach D et al. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993; 366: 704～707
, 百拇医药
4，Gomi A, Saksi R, Ogawa S et al. Frequent loss of the cyclin-dependent Kinase-4 inhibitor gene in human gliomas. Jpn J Cancer Res, 1995; 86 (4): 342～346
5，Ibrahim GK, Kerns BM, McDonald JA et al. Differential immunoreactivity of epidermal growth factor receptor in benign dysplastic and malignant prostatic tissues. J Urol, 1993; 149:170～173
6，Fuller GN, Bigner SH. Amplified cellular oncogenes in neoplasms of the human central nervous system. Mutat Res, 1992;276(3): 299～306
收稿日期：1999-09-15, 百拇医药
单位：(吉林省延边大学医学院病理学教研室，延吉 133000)
关键词：脑肿瘤；神经；胶质瘤；p16；受体，表皮生长因子
临床与实验病理学杂志000112 摘要 目的:通过观察脑胶质瘤中p16 mRNA及其蛋白、EGFR的表达，探讨其在脑胶质瘤发生、发展中的作用。方法:应用原位杂交技术和免疫组织化学方法在38例人脑胶质瘤中检测p16 mRNA及其蛋白、EGFR的表达。以7例正常组织作为对照。结果:p16mRNA和p16蛋白在Ⅲ～Ⅳ级、Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织中的阳性表达率分别为8.3%, 16.7%; 57.7%, 57.7%; 71.4%, 85.7%。EGFR在Ⅲ～Ⅳ级、Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织中的阳性表达率分别为83.3%, 38.5%, 14.3%。结论:p16基因缺失引起的p16蛋白的表达降低、EGFR的过表达在脑胶质瘤的发生中起重要的作用。
, 百拇医药
中图分类号 R739.41 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)01-0038-03
Expression of p16 mRNA and its protein, EGFR in the cerebral glioma
Jin Yongjian， Jin Yulan， Li Longshan
(Dept of Pathol, Yanbian University Medical College, Yanbian 133000)
ABSTRACT Purpose To investigate the effects of p16 mRNA and its protein, EGFR in the tumorigenesis of the cerebral glioma.Methods The expression of p16 mRNA and its protein, EGFR was detected in 38 cases of the cerebral glioma using in situ hybridization and immunohistochemical staining. Seven normal brain tissues were used as control. Results The positive expression rate of p16 mRNA and p16 protein in Ⅲ～Ⅳ、Ⅰ～Ⅱgroups of glioma and normal tissues was 8.3%, 16.7% ; 57.7%，57.7% ; 71.4%, 85.7%, respectively. The positive expression rate of EGFR in Ⅲ～Ⅳ、Ⅰ～Ⅱgroups of glioma and normal tissues was 83.3%, 38.5%, 14.3%, respectively. Conclusion Descended expression of p16 protein is due to the deletion of p16 mRNA.Descended expression of p16 protein and excessive expression of EGFR may play an important role in the tumorigenesis of cerebral glioma.
, 百拇医药
KEY WORDS brain neoplasms; glioma；p16；receptors,epidermal growth factor
脑胶质瘤是发病率较高的神经系统疾病之一，目前对胶质瘤的治疗主要依靠手术、放疗及化疗等方法。由于胶质瘤有极易复发的特性，治疗效果不能令人满意，迄今对胶质瘤的致病机制尚无确切了解。作者通过原位杂交技术和免疫组织化学方法检测原发性脑胶质瘤中的p16 mRNA及其蛋白和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的表达，并探讨其在胶质瘤发生、发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 收集我院附属医院病理科存档的脑胶质瘤标本38例，包括Ⅰ级17例、Ⅱ级9例、Ⅲ级8例、Ⅳ级4例(按1993年WHO分类)。男女比例为21∶17，平均年龄40.3岁。另取7例正常脑组织(来自新鲜尸体解剖脑组织标本)作为正常对照。全部标本均为10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。
, 百拇医药
1.2 试剂 原位杂交用生物素标记p16mRNA探针购自北京医科大学病理学教研室。p16、EGFR抗体、S-P试剂盒均为美国Zymed公司产品。
1.3 方法
1.3.1 原位杂交 (1)石蜡切片脱蜡至水；(2)0.1 mol/L甘氨酸洗5 min; (3)0.4% Triton X-100洗5 min；(4)PBS冲洗后蛋白酶K消化30 min；(5)4%多聚甲醛后固定15 min；(6)PBS冲洗后，新鲜配制的乙酸酐处理15 min；(7)2×SSC冲洗10 min；(8)滴加不含探针的杂交液在37℃孵育1～2 h；(9)滴加含p16 mRNA探针的杂交液，95℃变性5 min；(10)37℃水浴进行杂交反应12～16 h；(11)冲洗过剩的探针；(12)加碱性磷酸酶卵白素(1∶200稀释)37℃，30 min；(13) PBS洗5 min 3次；(14)NBT/BCIP显色；(15)逐级脱水、透明、中性树胶封片。
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1.3. 2 免疫组织化学染色 实验操作按S-P试剂盒说明书进行，并略加修正。其步骤如下：(1) 石蜡切片脱蜡至水；(2) 3% H2O2、甲醇， 37℃, 10 min；(3)PBS洗5 min 3次；(4)微波抗原修复；(5)10%羊血清20 min；(6)加一抗(工作浓度p16、EGFR为1∶50)4℃，过夜；(7) PBS洗5 min 3次；(8)加二抗(工作浓度1∶200), 37℃, 20 min；(9)PBS洗5 min 3次；(10)加三抗(工作浓度1∶200)，37℃, 20 min；(11)PBS洗5 min 3次；(12)DAB显色；(13)流水充分冲洗；(14)苏木精复染；(15)流水充分冲洗；(16)逐级脱水、透明、中性树胶封片。
1.4 结果判断
1.4.1 p16 mRNA原位杂交阳性信号呈紫蓝色，阴性区域不着色(图1)；p16蛋白阳性信号呈棕黄色，位于细胞浆；EGFR阳性信号呈棕黄色，位于细胞膜(图2)。
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1.4.2 免疫组织化学染色中阳性细胞数<10%为阴性，>10%为阳性。
1.5 统计学处理 统计学处理应用确切概率法进行比较。
图1 脑胶质瘤中p16 mRNA的表达。ISH×400
图2 脑胶质瘤中EGFR的表达。S-P×400
2 结果
2.1 p16 mRNA、p16蛋白在人脑胶质瘤中的表达 p16 mRNA及其蛋白在人脑胶质瘤及正常组织中均有一定程度的表达，其阳性表达率见表1、2。
, 百拇医药 表1 p16 mRNA在人脑胶质瘤中的表达 组 织
n
阳性例数
阳性率(%)
Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤
12
1
8.3*
Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤
26
15
57.7
, 百拇医药 正常组织
7
5
71.4
*与Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织比较，P<0.025表2 p16蛋白在人脑胶质瘤中的表达 组 织
n
阳性例数
阳性率(%)
Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤
12
2
16.7*
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Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤
26
15
57.7
正常组织
7
6
85.7
*与Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织比较，P<0.025
2.2 EGFR在人脑胶质瘤中的表达 EGFR在人脑胶质瘤中呈现较高的阳性表达，见表3。
表3 EGFR在人脑胶质瘤中的表达 组 织
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n
阳性例数
阳性率(%)
Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤
12
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83.3*
Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤
26
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38.5
正常组织
7
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1
14.3
*与Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织比较，P<0.025
2.3 胶质瘤中p16蛋白阴性伴EGFR阳性的协同表达 见表4。
表4 胶质瘤中p16蛋白阴性伴EGFR阳性的协同表达 组 织
n
p16蛋白(-)伴EGFR(+)例数
表达率(%)
Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤
12
8
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66.7*
Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤
26
2
7.6
正常组织
7
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*与Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤、正常组织比较，P<0.0253 讨论
p16又称MTS1(multiple tumor suppressor 1)是人们发现的第一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因，其产物p16蛋白能特异地抑制细胞周期依赖激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)的活性，使之不能解除视网膜母细胞瘤基因蛋白( Rb)对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖。故p16蛋白在细胞周期的调控中起负性调节作用。p16蛋白的丢失和突变在多种恶性肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用〔1～3〕。研究发现，在人原发性脑肿瘤中，特别是恶性度高的胶质瘤中常有p16基因的缺失〔4〕。本实验结果表明，p16 mRNA及其蛋白在Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中的表达率低于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤和正常组织, 且两者表达呈正相关。因此，推测恶性胶质瘤的发生与p16基因缺失引起的p16蛋白的表达降低有密切关系。
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表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)作为原癌基因c-erb-1的基因产物，是一种具有磷酸化功能的跨膜蛋白，在上皮增生过程的膜信息转换中起重要作用〔5〕。多数学者的研究认为EGFR激活并过表达时通过邻近和自泌机制促进癌细胞自身及邻近细胞不断增殖，导致瘤细胞不断生长并表现恶性行为。本实验结果表明，EGFR随着脑胶质瘤的恶性度增高，其阳性率也显著增高，在Ⅲ～Ⅳ级中胶质瘤的EGFR阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤和正常组织。这一结果与Fullerr等的研究结果基本一致〔6〕。由此说明胶质瘤的恶性转化与EGFR的过表达有关。
结合p16蛋白的表达和EGFR的表达进行观察，发现p16蛋白的表达与EGFR的表达成负相关，同时出现两者异常改变多存在于Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤，与Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤和正常组织比较有显著差异。从而提示，p16蛋白的表达降低和EGFR的过表达，特别是两者同时异常表达时可能有协同和促进胶质瘤恶性发展的作用。
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作者简介：金永健，男，32岁，主治医师
参考文献
1，Kamb A, Gruis NA, Weaver Feldhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994; 265: 436～440
2，Marx J. New tumor suppressor may rival p53.Science, 1994; 264: 344～345
3，Serrano M, Hannon GJ, Beach D et al. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993; 366: 704～707
, 百拇医药
4，Gomi A, Saksi R, Ogawa S et al. Frequent loss of the cyclin-dependent Kinase-4 inhibitor gene in human gliomas. Jpn J Cancer Res, 1995; 86 (4): 342～346
5，Ibrahim GK, Kerns BM, McDonald JA et al. Differential immunoreactivity of epidermal growth factor receptor in benign dysplastic and malignant prostatic tissues. J Urol, 1993; 149:170～173
6，Fuller GN, Bigner SH. Amplified cellular oncogenes in neoplasms of the human central nervous system. Mutat Res, 1992;276(3): 299～306
收稿日期：1999-09-15, 百拇医药