线粒体肌病和脑肌病患者线粒体基因缺失的研究
作者：高枫 李晓东 陈清棠
单位：高枫(北京医科大学第一医院神经内科 邮政编码100034)；李晓东(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院神经内科)；陈清棠(北京医科大学第一医院神经内科 邮政编码100034)
关键词：线粒体肌病；骨骼肌线粒体；脑肌病
摘 要摘 要：目的 探讨线粒体肌病和脑肌病的骨骼肌线粒体DNA(mtDNA)缺失情况。方法 从1例线粒体肌病和1例脑肌病(MERRF)患者骨骼肌活检标本中，提取总DNA，以限制性内切酶Pvu Ⅱ酶切，与mtDNA全长探针进行分子杂交。结果 线粒体肌病和MERRF患者分别有15kb和5kb的mtDNA基因缺失。结论 mtDNA基因缺失是线粒体肌病和脑肌病的重要病因之一。
Study in mitochondrial gene defect of patients with mitochondrial myopathy and encephalomyopathy
, 百拇医药
Gao Feng Li Xiaodong Chen Qingtang
(Department of Neurology,the First Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034)
Abstract：Objective Research in the gene defect of mitochondrial DNA (mtDNA) from skeletal muscles of patients with mitochondrial myopathy and encephalomyopathy.Methods By using total mtDNA abstracted from skeletal muscles in the patient with mitochondrial myopathy and encephalomyopathy.Results A mtDNA deletion of 15kb was found from a cose with mitochondrial myopathy.In the other case with MERRF,a mtDNA deletion of 5kb was confirmed.Conclusion The mtDNA deletion is considered to be an important cause of mitochondrial diseases.
, 百拇医药
Key words：Mitochondrial myopathy Mitochondrial DNA Encephalomyopathy▲
自1988年以来，已发现部分线粒体肌病和脑肌病患者的发病与mtDNA突变相关，证实了mtDNA基因突变也是人类疾病的一个重要病因[1]。我们通过分析线粒体肌病和脑肌病患者骨骼肌mtDNA突变情况，试图寻找mtDNA突变与发病的相关性。
临床资料
一、对象
2例患者和12例对照者。
例1，女，50岁。因四肢无力7年来我院就诊。主要表现为活动后全身乏力，四肢酸痛，休息后难以缓解。症状逐渐加重。既往史和家族史均无特殊。查体：颅神经未见异常，四肢近端肌力Ⅲ级、远端Ⅳ级，肌张力低，未见明显肌萎缩，腱反射低下，未引出病理征。做左三角肌活检，冰冻切片组化染色，光镜下可见不整边红纤维(RRF)，并有大量糖原、脂肪堆积；铅轴双染色，电镜下观察可见膜下和肌丝间大量糖原和异常线粒体堆积。临床诊断为线粒体肌病。
, 百拇医药
例2，女，30岁。因走路不稳伴阵发性抖动10年，加重3个月而来我院就诊。既往史和家族史均无特殊。查体：颅神经未见异常，感觉正常，四肢肌力Ⅳ级，肌张力双上肢适中，未引出病理征，指鼻试验和跟膝胫试验欠稳准，有肌阵挛发作。脑电图示广泛轻度异常，脑脊液常规和生化正常，头颅MRI正常。做右股四头肌活检，冰冻切片，组化染色，光镜下可见少量RRF，并有较多糖原和脂肪。超薄切片，铅轴双染色，电镜下观察可见肌膜下和肌丝间异常线粒体及糖原和脂肪堆积。临床诊断为线粒体脑肌病，肌阵挛性癫痫合并破碎红纤维(MERRF)型。
12例对照者，其中正常对照者检查4例、重症肌无力患者4例、多发性肌炎患者2例、肌营养不良患者2例。
二、材料
mtDNA全长探针由意大利Mariotti教授惠赠，蛋白酶K、琼脂糖、限制性内切酶Pvu Ⅱ等生化试剂购自北京华美生物工程公司，随机引物标记试剂盒购自美国Promega公司。
, http://www.100md.com
三、方法
使用蛋白酶、酚/氯仿抽提法从骨骼肌活检标本中提取高分子量DNA，以PvuⅡ进行酶切，电泳转膜后，与mtDNA全长探针进行分子杂交。常规洗膜及放射自显影。将X线片用激光密度扫描仪进行扫描，分析异常条带所占比例。
结 果
杂交结果显示每例标本在X线片上均有一条16.5kb带，为正常mtDNA片段。例1还出现一条1.5kb的异常片段，说明有部分mtDNA发生了15kb的基因缺失。剂量分析缺失型mtDNA占总DNA的10.7%。例2除正常mtDNA外，出现一条11.5kb异常带，表明部分mtDNA有5kb的基因缺失。剂量分析表明该片段占总mtDNA的19.3%。对照组未见异常条带，说明其mtDNA未发生缺失。
讨 论
mtDNA缺失是人类线粒体所特有的突变之一，目前尚不十分清楚其起源，推测发生的机制可能有两个：①来自母亲的遗传；②在卵母细胞期或受精卵期发生散发性mtDNA突变。有许多资料都支持后者[2]。本文2例患者家系中未发现患有同类疾病的亲属，但是还不能完全排除有母系遗传的可能性，因为要产生临床症状，缺失型mtDNA的比例必须达到一定阈值，这2例患者的母亲可能有小于阈值的缺失型mtDNA，因而无临床症状。患者的缺失型DNA比例在不同组织中有差异，一般在骨骼肌和中枢神经系统中均较高，二者对氧化磷酸化的依赖性较大，极易受损出现临床症状。
, 百拇医药
本试验发现1例患者有15kb的mtDNA缺失，较为少见，如此大片段的基因缺失必然会对线粒体基因组上某些编码基因产生影响，损害线粒体蛋白质的翻译，使氧化磷酸化功能受损而出现临床症状。从杂交图谱上看，本患者骨骼肌标本中的mtDNA缺失是异质性的，剂量分析表明缺失型mtDNA的比例为10.7%，符合一般线粒体肌病mtDNA突变的特点。
MERRF一般报道由mtDNA第8344位点编码tRNA的基因发生A→G的点突变引起[3]。本文例2患者标本中发现有5kb的mtDNA缺失。从杂交图谱上看，本患者mtDNA缺失也是异质性的，占总mtDNA的19.8%，符合线粒体脑肌病的mtDNA突变特点。多年以来，人们一直试图寻找线粒体疾病的基因型与表现型变化的相互关系[4]，所得的结果还不一致。就mtDNA缺失来说，一般引起线粒体肌病和慢性进行性眼外肌瘫痪，已有不少文献报道不同患者mtDNA缺失的片段大小、位置、占总mtDNA的比例可以不相同，而且缺失与临床症状、疾病严重程度及线粒体生化功能障碍无明显相关性，即基因型与表现型还缺乏必然的联系，这可能是例2患者虽有mtDNA缺失，却表现为MERRF的原因。■
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]Wallace DC.Diseases of the mitochondrial DNA.Ann Rev Biochem,1992,61:1175.
[2]Holt IJ,Harding AE,Morgan-Hughes JA.Deletions of mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.Nature,1988,331:717.
[3]Shoffner JM,Poulton J,Hattori Y,et al.Myoclonic epilepsy and ragged-red fibers disease (MERRF) is associated with a mitochondrial DNA tRNALys mutation.Cell,1990,61:931.
[4]Wallace DC.Mitochondrial diseases:genotype versus phenotype.Trends Genet,1993,9:128.
收稿日期：1998-11-26
修改日期：1999-05-17, http://www.100md.com
单位：高枫(北京医科大学第一医院神经内科 邮政编码100034)；李晓东(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院神经内科)；陈清棠(北京医科大学第一医院神经内科 邮政编码100034)
关键词：线粒体肌病；骨骼肌线粒体；脑肌病
摘 要摘 要：目的 探讨线粒体肌病和脑肌病的骨骼肌线粒体DNA(mtDNA)缺失情况。方法 从1例线粒体肌病和1例脑肌病(MERRF)患者骨骼肌活检标本中，提取总DNA，以限制性内切酶Pvu Ⅱ酶切，与mtDNA全长探针进行分子杂交。结果 线粒体肌病和MERRF患者分别有15kb和5kb的mtDNA基因缺失。结论 mtDNA基因缺失是线粒体肌病和脑肌病的重要病因之一。
Study in mitochondrial gene defect of patients with mitochondrial myopathy and encephalomyopathy
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Gao Feng Li Xiaodong Chen Qingtang
(Department of Neurology,the First Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034)
Abstract：Objective Research in the gene defect of mitochondrial DNA (mtDNA) from skeletal muscles of patients with mitochondrial myopathy and encephalomyopathy.Methods By using total mtDNA abstracted from skeletal muscles in the patient with mitochondrial myopathy and encephalomyopathy.Results A mtDNA deletion of 15kb was found from a cose with mitochondrial myopathy.In the other case with MERRF,a mtDNA deletion of 5kb was confirmed.Conclusion The mtDNA deletion is considered to be an important cause of mitochondrial diseases.
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Key words：Mitochondrial myopathy Mitochondrial DNA Encephalomyopathy▲
自1988年以来，已发现部分线粒体肌病和脑肌病患者的发病与mtDNA突变相关，证实了mtDNA基因突变也是人类疾病的一个重要病因[1]。我们通过分析线粒体肌病和脑肌病患者骨骼肌mtDNA突变情况，试图寻找mtDNA突变与发病的相关性。
临床资料
一、对象
2例患者和12例对照者。
例1，女，50岁。因四肢无力7年来我院就诊。主要表现为活动后全身乏力，四肢酸痛，休息后难以缓解。症状逐渐加重。既往史和家族史均无特殊。查体：颅神经未见异常，四肢近端肌力Ⅲ级、远端Ⅳ级，肌张力低，未见明显肌萎缩，腱反射低下，未引出病理征。做左三角肌活检，冰冻切片组化染色，光镜下可见不整边红纤维(RRF)，并有大量糖原、脂肪堆积；铅轴双染色，电镜下观察可见膜下和肌丝间大量糖原和异常线粒体堆积。临床诊断为线粒体肌病。
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例2，女，30岁。因走路不稳伴阵发性抖动10年，加重3个月而来我院就诊。既往史和家族史均无特殊。查体：颅神经未见异常，感觉正常，四肢肌力Ⅳ级，肌张力双上肢适中，未引出病理征，指鼻试验和跟膝胫试验欠稳准，有肌阵挛发作。脑电图示广泛轻度异常，脑脊液常规和生化正常，头颅MRI正常。做右股四头肌活检，冰冻切片，组化染色，光镜下可见少量RRF，并有较多糖原和脂肪。超薄切片，铅轴双染色，电镜下观察可见肌膜下和肌丝间异常线粒体及糖原和脂肪堆积。临床诊断为线粒体脑肌病，肌阵挛性癫痫合并破碎红纤维(MERRF)型。
12例对照者，其中正常对照者检查4例、重症肌无力患者4例、多发性肌炎患者2例、肌营养不良患者2例。
二、材料
mtDNA全长探针由意大利Mariotti教授惠赠，蛋白酶K、琼脂糖、限制性内切酶Pvu Ⅱ等生化试剂购自北京华美生物工程公司，随机引物标记试剂盒购自美国Promega公司。
, http://www.100md.com
三、方法
使用蛋白酶、酚/氯仿抽提法从骨骼肌活检标本中提取高分子量DNA，以PvuⅡ进行酶切，电泳转膜后，与mtDNA全长探针进行分子杂交。常规洗膜及放射自显影。将X线片用激光密度扫描仪进行扫描，分析异常条带所占比例。
结 果
杂交结果显示每例标本在X线片上均有一条16.5kb带，为正常mtDNA片段。例1还出现一条1.5kb的异常片段，说明有部分mtDNA发生了15kb的基因缺失。剂量分析缺失型mtDNA占总DNA的10.7%。例2除正常mtDNA外，出现一条11.5kb异常带，表明部分mtDNA有5kb的基因缺失。剂量分析表明该片段占总mtDNA的19.3%。对照组未见异常条带，说明其mtDNA未发生缺失。
讨 论
mtDNA缺失是人类线粒体所特有的突变之一，目前尚不十分清楚其起源，推测发生的机制可能有两个：①来自母亲的遗传；②在卵母细胞期或受精卵期发生散发性mtDNA突变。有许多资料都支持后者[2]。本文2例患者家系中未发现患有同类疾病的亲属，但是还不能完全排除有母系遗传的可能性，因为要产生临床症状，缺失型mtDNA的比例必须达到一定阈值，这2例患者的母亲可能有小于阈值的缺失型mtDNA，因而无临床症状。患者的缺失型DNA比例在不同组织中有差异，一般在骨骼肌和中枢神经系统中均较高，二者对氧化磷酸化的依赖性较大，极易受损出现临床症状。
, 百拇医药
本试验发现1例患者有15kb的mtDNA缺失，较为少见，如此大片段的基因缺失必然会对线粒体基因组上某些编码基因产生影响，损害线粒体蛋白质的翻译，使氧化磷酸化功能受损而出现临床症状。从杂交图谱上看，本患者骨骼肌标本中的mtDNA缺失是异质性的，剂量分析表明缺失型mtDNA的比例为10.7%，符合一般线粒体肌病mtDNA突变的特点。
MERRF一般报道由mtDNA第8344位点编码tRNA的基因发生A→G的点突变引起[3]。本文例2患者标本中发现有5kb的mtDNA缺失。从杂交图谱上看，本患者mtDNA缺失也是异质性的，占总mtDNA的19.8%，符合线粒体脑肌病的mtDNA突变特点。多年以来，人们一直试图寻找线粒体疾病的基因型与表现型变化的相互关系[4]，所得的结果还不一致。就mtDNA缺失来说，一般引起线粒体肌病和慢性进行性眼外肌瘫痪，已有不少文献报道不同患者mtDNA缺失的片段大小、位置、占总mtDNA的比例可以不相同，而且缺失与临床症状、疾病严重程度及线粒体生化功能障碍无明显相关性，即基因型与表现型还缺乏必然的联系，这可能是例2患者虽有mtDNA缺失，却表现为MERRF的原因。■
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参考文献：
[1]Wallace DC.Diseases of the mitochondrial DNA.Ann Rev Biochem,1992,61:1175.
[2]Holt IJ,Harding AE,Morgan-Hughes JA.Deletions of mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.Nature,1988,331:717.
[3]Shoffner JM,Poulton J,Hattori Y,et al.Myoclonic epilepsy and ragged-red fibers disease (MERRF) is associated with a mitochondrial DNA tRNALys mutation.Cell,1990,61:931.
[4]Wallace DC.Mitochondrial diseases:genotype versus phenotype.Trends Genet,1993,9:128.
收稿日期：1998-11-26
修改日期：1999-05-17, http://www.100md.com