呼吸道的生物被膜病
作者：叶枫 陈顺存 钟淑卿
单位：510120 广州呼吸疾病研究所
关键词：
实用医学杂志000136 众所周知，铜绿假单胞菌(pseudomonas aerugino sa，PA)的慢性肺部感染是一种最难治疗的感染。它与机体的免疫功能和呼吸道的局部防御功能低下、病原菌对抗菌药的耐药以及细菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)的形成有关。目前的研究认为，PA生物被膜的形成是难治性肺部感染的重要原因，死后肺组织的电子显微分析亦显示PA在患者的肺部形成微菌落。因此，有的学者提出了“呼吸道生物被膜病(biofilm disease)”概念[1，2]。本文拟就该病有关方面作一综述。
1 细菌生物被膜
BF是指细菌吸附于生物材料或机体腔道表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，包绕其中形成的膜样物，主要由细菌、高水化的多阴离子基质及被俘获的体外的大分子组成。应用扫描同聚焦激光显微技术观察活的生物被膜，证实了这一点，其中细菌占这些附着结构5%～35%的空间。体外常规培养下细菌生物被膜会消失，电镜标本制作过程又易使这些含水的多糖基质被压缩，故很长时间未被认识。1971年开始有学者报道，1978年Costerton首先对此进行了较详细的描述[3～5]。
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1.1 生物被膜的生化组成 BF确切的生化组成仍不清楚。一些PA的生物被膜主要由乙酰化β-D-甘露糖醛酸和α-L-葡萄糖醛酸(如藻酸)组成，形成胞外粘液多糖(Mucoidexop olysaccharide，MEP)[6]。MEP则是一种易适应的聚合物，与慢性呼吸道感染密切相关。藻酸盐的生成受环境条件的影响，如介质的渗透性和营养物的限制。当铜绿假单胞菌PAO568在增加了NaC1浓度的培养基中培养时，可观察到藻酸盐的产物有所增加。有关其生物合成的遗传规则，近年来有学者认为algR基因产生algD基因，以控制一个关键基因的转录，是控制球状细胞在适应环境压力中的功能的一类转录规则[5]。
1.2 生物被膜中细菌的生理机能[4，5] 表面的生物被膜菌与浮游细菌相似，易获得养分和氧气，排出代谢产物，代谢活跃，菌体较大。而位于被膜深部的细菌很难获得充足的养分和氧气，代谢低下，分裂迟缓，甚至处于休眠状态，菌体较小，对外界各种刺激不敏感。浮游细菌的代谢产物易扩散至培养液中，虽不会造成代谢产物的堆积，但易受到抗菌素和吞噬细胞攻击而致命。
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2 呼吸道的生物被膜病
呼吸道的生物被膜病是指在慢性感染中，由于生物被膜的影响，即使反复应用抗菌药，仍不能彻底清除病原菌，主要为PA和肺炎克雷伯杆菌，导致慢性持续性感染或感染反复发作。电子显微镜可观察到慢性肺部感染患者的气道表面的PA通过产生粘液样的藻酸盐互相聚合，紧密地粘附在气道表面[1，2]。
2.1 细菌生物被膜的致病机制
2.1.1 生物被膜对抗机体免疫防御的机制[4] 一方面，细菌形成微菌落包绕于生物被膜内，能限制抗菌药、噬菌体等接近细菌；另一方面，铜绿假单胞菌产生的胞外粘液多糖能抑制中性粒细胞的趋化作用，并可通过抵抗“次氯酸清除”机制而减弱氧介导的细胞内杀菌作用。这些细菌的生物被膜通常不会引起明显的感染，然而它们确实构成一个感染灶。当机体防御系统不能控制它们时，细菌随时从生物被膜中游出，成为浮游细菌，到达其它部位引起感染。常规剂量的抗菌药虽然可以消灭播散的浮游细菌，控制感染症状，但不足以消灭生物被膜菌，于是形成了一个持续的病灶导致感染的复发。
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2.1.2 生物被膜在细菌粘附侵入中的作用[4] BF在细菌的粘附侵入过程中发挥重要作用，主要由细菌的鞭毛及胞外粘液多糖介导。细菌的鞭毛是粘附靶组织受体的特异性介体，但如果粘附的细菌缺乏多糖蛋白复合物，则细菌不足以侵入肺部，因为多糖蛋白复合物能对抗肺表面活性物质和其它重要的机体防御因素，从而使细菌逐步侵入肺部并持续存在。病原菌较少使用胞外粘液多糖介导的非特异性粘附，但其作用更强，粘附更牢固。
2.1.3 生物被膜介导的免疫复合物损伤机制[2，4] 在泛细支气管炎、囊性纤维化基础上并发慢性PA感染中，生物被膜介导的免疫复合物损伤是主要的发病机制。由生物被膜菌或粘液样细菌产生的藻酸盐成分作为抗原，刺激抗体的产生。这些抗体不能渗透生物被膜去除感染，但确实在生物被膜表面形成免疫复合物。中性粒细胞与免疫复合物结合沉积在气道组织内，大量的淋巴细胞浸润在小气道周围，形成慢性炎症反应，导致局部肺组织损伤。在这一过程中，藻酸盐扮演了重要角色。在患者的血中可检测到藻酸盐免疫复合物，其水平高低与临床症状密切相关。
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2.2 生物被膜病的治疗 在BF形成的动力学研究中，发现粘附在固体表面的铜绿假单胞生物被膜菌的数目从第1～5天呈指数地增加，新生物被膜易被抗菌药清除，而老生物被膜难以清除。因此，对于与生物被膜相关的慢性肺部感染，应尽早用药，否则易导致治疗的失败[5，6]。
大量的研究发现生物被膜菌比浮游细菌易对机体产生耐药，现认为与以下几方面有关[4～5，7～10]。(1)生物被膜在细菌表面形成的物理性屏障作用。生物被膜菌产生的多糖物质象离子交换剂那样吸附一部分带电荷的抗生素分子，限制抗菌药渗入生物被膜，致细菌周围药物浓度较低，达不到有效杀菌浓度。(2)多糖蛋白复合物基质可与药物起反应，中和药物的作用。(3)生物被膜菌处于生长不活跃期，分裂迟缓，对抗菌药的通透性及敏感性较差。(4)上述几个因素利于生物被膜启动抗生素耐药基因，如β-内酰胺酶的表达及诱发耐药突变。
由于生物被膜形成的药物渗透屏障是最主要的、最难对付的耐药机制。因此，寻找能有效渗透生物被膜的药物是治疗的关键。体外实验发现鱼精蛋白、磷霉素、克林霉素和14，15环的大环类酯类抗生素可改善生物被膜的渗透性。动物实验及支气管肺泡灌洗液的细胞学分析证实阿奇霉素可使藻酸免疫的小鼠气道周围的淋巴浸润减少。其中磷霉素通过影响细胞壁合成，可改变生物被膜的渗透性；14，15环的大环类酯类抗生素能抑制藻酸生物合成途径中的二磷酸甘露糖尿苷脱氢酶(guanosine diphosphomannose dehydrogenas，GMD)的活性，减少藻酸盐的产生，破坏生物被膜的结构，利于氟喹诺酮类等抗菌药有效渗入被膜内发挥杀菌作用[2，7～9]。此外，国内的研究还发现阿奇霉素能提高氟罗沙星对BF的渗透从而增强其对生物被膜上的PA的抑菌活性[11]。在各种抗菌药中，氟喹诺酮类对生物被膜的渗透性最佳，左旋氧氟沙星能更迅速、广泛地渗入生物被膜，但其作用也是有限的[12]。所以，仅用一种抗菌药难以治愈与生物被膜相关的慢性感染，但联合用药则能有效去除生物被膜菌。在应用抗菌药的基础上，增加相对小的直流电以对抗生物被膜将大大增强灭菌效果[13]。
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抗菌药物治疗的失败与剂量不足有关。为此，有人建议其抗菌效率应采用生物被膜去除浓度(biofilm eradicationg concentration，BEC)进行评价，即去除位于被膜深部的老生物被膜菌所需的抗菌药的浓度。合并可能影响生物被膜生理状态的关键生长参数，包括缓慢的生长速率、铁的限制、生物被膜的生长方式，以确定抗菌药的活性是非常重要的。合并了这些参数的体外化学系统已被成功地用于研究生物被膜菌与抗菌药的相互作用，以确定BEC。临床医师将能更精确地估计慢性感染治疗所需的有效抗菌药的浓度，从而确保疗效[7]。■
参考文献：
[1]Ohgaki N. Bacterial biofilm in chronic airway infection. Kansenshog aku Zasshi,1994,68:138～151.
[2]Kobayashi H. Biofilm Disease:its clinical manifestation and therape utic possibilities of macrolides. Am J Med,1995,99(6A):26S～36S.
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[3]王睿，方向群. 细菌生物被膜相关感染的特点与防治. 国外医药抗生素分 册，1998，19：50～52.
[4]Costeton JW,Chen KJ,Geesey GG,et al. Bacterial biofilms in nature a nd disease. Ann Rev Microbiol,1987,41:435～464.
[5]Anwar H, Strap JL,Costerton JW. Establishment of aging biofilms:pos sible mechanism of bacterial resistance to antimicrobial therapy. Antimicrob Age nts Chemother,1992,36:1347～1351.
[6]Anwar H,Dasgupta MK,Costerton JW. Testing the susceptibility of ba cteria in biofilms to antibacterial agents. Antimicrob Agents Chemother,1990,34: 2043～2046.
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[7]Hoyle BD,Alcantara J,Costerton JW. Pseudomonas aeruginosa biofilm as a diffusion barrier to piperacillin. Antimicrob Agents Chemother,1992,36:2054 ～2056.
[8]Kumon H,Ono N,Iida M,et al. Combination effect of fosfomycin and of loxacin against pseudomonas aeruginosa growing in a biofilm. Antimicrob Agents C hemother,1995,39:1038～1044.
[9]Soboh F,Khoury AE,Zamboni AC,et al. Effects of ciprofloxacin and pr otamine sulfate combinations against catheter-associated pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother,1995,39:1281～1286.
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[10]Giwercman B,Jensen ET,Hoiby N,et al. Induction of β-lactam ase production in pseudomonas aeruginosa biofilm. Antimicrob Agents Chemother,19 91,35:1008～1010.
[11]方向群，刘又宁，陈迁，等. 阿奇霉素对生物被膜的抑制及对氟罗沙星的增效作用.中华结核和呼吸杂志，1998，21：538～540.
[12]Ishida H,Ishida Y,Kurosaka Y,et al. In vitro and in vivo a ctivities of levofloxacin against biofilm-producing pseudomonas aeruginosa. Ant imicrob Agents Chemother,1998,42:1641～1645.
[13]Stoodley P,Beer DD,Lappin-scott HM. Influence of electric fields and pH on biofilm structure as related to the bioelectric effect. Antimi crob Agents Chemother,1997,41:1876～1879., http://www.100md.com
单位：510120 广州呼吸疾病研究所
关键词：
实用医学杂志000136 众所周知，铜绿假单胞菌(pseudomonas aerugino sa，PA)的慢性肺部感染是一种最难治疗的感染。它与机体的免疫功能和呼吸道的局部防御功能低下、病原菌对抗菌药的耐药以及细菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)的形成有关。目前的研究认为，PA生物被膜的形成是难治性肺部感染的重要原因，死后肺组织的电子显微分析亦显示PA在患者的肺部形成微菌落。因此，有的学者提出了“呼吸道生物被膜病(biofilm disease)”概念[1，2]。本文拟就该病有关方面作一综述。
1 细菌生物被膜
BF是指细菌吸附于生物材料或机体腔道表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，包绕其中形成的膜样物，主要由细菌、高水化的多阴离子基质及被俘获的体外的大分子组成。应用扫描同聚焦激光显微技术观察活的生物被膜，证实了这一点，其中细菌占这些附着结构5%～35%的空间。体外常规培养下细菌生物被膜会消失，电镜标本制作过程又易使这些含水的多糖基质被压缩，故很长时间未被认识。1971年开始有学者报道，1978年Costerton首先对此进行了较详细的描述[3～5]。
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1.1 生物被膜的生化组成 BF确切的生化组成仍不清楚。一些PA的生物被膜主要由乙酰化β-D-甘露糖醛酸和α-L-葡萄糖醛酸(如藻酸)组成，形成胞外粘液多糖(Mucoidexop olysaccharide，MEP)[6]。MEP则是一种易适应的聚合物，与慢性呼吸道感染密切相关。藻酸盐的生成受环境条件的影响，如介质的渗透性和营养物的限制。当铜绿假单胞菌PAO568在增加了NaC1浓度的培养基中培养时，可观察到藻酸盐的产物有所增加。有关其生物合成的遗传规则，近年来有学者认为algR基因产生algD基因，以控制一个关键基因的转录，是控制球状细胞在适应环境压力中的功能的一类转录规则[5]。
1.2 生物被膜中细菌的生理机能[4，5] 表面的生物被膜菌与浮游细菌相似，易获得养分和氧气，排出代谢产物，代谢活跃，菌体较大。而位于被膜深部的细菌很难获得充足的养分和氧气，代谢低下，分裂迟缓，甚至处于休眠状态，菌体较小，对外界各种刺激不敏感。浮游细菌的代谢产物易扩散至培养液中，虽不会造成代谢产物的堆积，但易受到抗菌素和吞噬细胞攻击而致命。
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2 呼吸道的生物被膜病
呼吸道的生物被膜病是指在慢性感染中，由于生物被膜的影响，即使反复应用抗菌药，仍不能彻底清除病原菌，主要为PA和肺炎克雷伯杆菌，导致慢性持续性感染或感染反复发作。电子显微镜可观察到慢性肺部感染患者的气道表面的PA通过产生粘液样的藻酸盐互相聚合，紧密地粘附在气道表面[1，2]。
2.1 细菌生物被膜的致病机制
2.1.1 生物被膜对抗机体免疫防御的机制[4] 一方面，细菌形成微菌落包绕于生物被膜内，能限制抗菌药、噬菌体等接近细菌；另一方面，铜绿假单胞菌产生的胞外粘液多糖能抑制中性粒细胞的趋化作用，并可通过抵抗“次氯酸清除”机制而减弱氧介导的细胞内杀菌作用。这些细菌的生物被膜通常不会引起明显的感染，然而它们确实构成一个感染灶。当机体防御系统不能控制它们时，细菌随时从生物被膜中游出，成为浮游细菌，到达其它部位引起感染。常规剂量的抗菌药虽然可以消灭播散的浮游细菌，控制感染症状，但不足以消灭生物被膜菌，于是形成了一个持续的病灶导致感染的复发。
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2.1.2 生物被膜在细菌粘附侵入中的作用[4] BF在细菌的粘附侵入过程中发挥重要作用，主要由细菌的鞭毛及胞外粘液多糖介导。细菌的鞭毛是粘附靶组织受体的特异性介体，但如果粘附的细菌缺乏多糖蛋白复合物，则细菌不足以侵入肺部，因为多糖蛋白复合物能对抗肺表面活性物质和其它重要的机体防御因素，从而使细菌逐步侵入肺部并持续存在。病原菌较少使用胞外粘液多糖介导的非特异性粘附，但其作用更强，粘附更牢固。
2.1.3 生物被膜介导的免疫复合物损伤机制[2，4] 在泛细支气管炎、囊性纤维化基础上并发慢性PA感染中，生物被膜介导的免疫复合物损伤是主要的发病机制。由生物被膜菌或粘液样细菌产生的藻酸盐成分作为抗原，刺激抗体的产生。这些抗体不能渗透生物被膜去除感染，但确实在生物被膜表面形成免疫复合物。中性粒细胞与免疫复合物结合沉积在气道组织内，大量的淋巴细胞浸润在小气道周围，形成慢性炎症反应，导致局部肺组织损伤。在这一过程中，藻酸盐扮演了重要角色。在患者的血中可检测到藻酸盐免疫复合物，其水平高低与临床症状密切相关。
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2.2 生物被膜病的治疗 在BF形成的动力学研究中，发现粘附在固体表面的铜绿假单胞生物被膜菌的数目从第1～5天呈指数地增加，新生物被膜易被抗菌药清除，而老生物被膜难以清除。因此，对于与生物被膜相关的慢性肺部感染，应尽早用药，否则易导致治疗的失败[5，6]。
大量的研究发现生物被膜菌比浮游细菌易对机体产生耐药，现认为与以下几方面有关[4～5，7～10]。(1)生物被膜在细菌表面形成的物理性屏障作用。生物被膜菌产生的多糖物质象离子交换剂那样吸附一部分带电荷的抗生素分子，限制抗菌药渗入生物被膜，致细菌周围药物浓度较低，达不到有效杀菌浓度。(2)多糖蛋白复合物基质可与药物起反应，中和药物的作用。(3)生物被膜菌处于生长不活跃期，分裂迟缓，对抗菌药的通透性及敏感性较差。(4)上述几个因素利于生物被膜启动抗生素耐药基因，如β-内酰胺酶的表达及诱发耐药突变。
由于生物被膜形成的药物渗透屏障是最主要的、最难对付的耐药机制。因此，寻找能有效渗透生物被膜的药物是治疗的关键。体外实验发现鱼精蛋白、磷霉素、克林霉素和14，15环的大环类酯类抗生素可改善生物被膜的渗透性。动物实验及支气管肺泡灌洗液的细胞学分析证实阿奇霉素可使藻酸免疫的小鼠气道周围的淋巴浸润减少。其中磷霉素通过影响细胞壁合成，可改变生物被膜的渗透性；14，15环的大环类酯类抗生素能抑制藻酸生物合成途径中的二磷酸甘露糖尿苷脱氢酶(guanosine diphosphomannose dehydrogenas，GMD)的活性，减少藻酸盐的产生，破坏生物被膜的结构，利于氟喹诺酮类等抗菌药有效渗入被膜内发挥杀菌作用[2，7～9]。此外，国内的研究还发现阿奇霉素能提高氟罗沙星对BF的渗透从而增强其对生物被膜上的PA的抑菌活性[11]。在各种抗菌药中，氟喹诺酮类对生物被膜的渗透性最佳，左旋氧氟沙星能更迅速、广泛地渗入生物被膜，但其作用也是有限的[12]。所以，仅用一种抗菌药难以治愈与生物被膜相关的慢性感染，但联合用药则能有效去除生物被膜菌。在应用抗菌药的基础上，增加相对小的直流电以对抗生物被膜将大大增强灭菌效果[13]。
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抗菌药物治疗的失败与剂量不足有关。为此，有人建议其抗菌效率应采用生物被膜去除浓度(biofilm eradicationg concentration，BEC)进行评价，即去除位于被膜深部的老生物被膜菌所需的抗菌药的浓度。合并可能影响生物被膜生理状态的关键生长参数，包括缓慢的生长速率、铁的限制、生物被膜的生长方式，以确定抗菌药的活性是非常重要的。合并了这些参数的体外化学系统已被成功地用于研究生物被膜菌与抗菌药的相互作用，以确定BEC。临床医师将能更精确地估计慢性感染治疗所需的有效抗菌药的浓度，从而确保疗效[7]。■
参考文献：
[1]Ohgaki N. Bacterial biofilm in chronic airway infection. Kansenshog aku Zasshi,1994,68:138～151.
[2]Kobayashi H. Biofilm Disease:its clinical manifestation and therape utic possibilities of macrolides. Am J Med,1995,99(6A):26S～36S.
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[3]王睿，方向群. 细菌生物被膜相关感染的特点与防治. 国外医药抗生素分 册，1998，19：50～52.
[4]Costeton JW,Chen KJ,Geesey GG,et al. Bacterial biofilms in nature a nd disease. Ann Rev Microbiol,1987,41:435～464.
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[6]Anwar H,Dasgupta MK,Costerton JW. Testing the susceptibility of ba cteria in biofilms to antibacterial agents. Antimicrob Agents Chemother,1990,34: 2043～2046.
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[7]Hoyle BD,Alcantara J,Costerton JW. Pseudomonas aeruginosa biofilm as a diffusion barrier to piperacillin. Antimicrob Agents Chemother,1992,36:2054 ～2056.
[8]Kumon H,Ono N,Iida M,et al. Combination effect of fosfomycin and of loxacin against pseudomonas aeruginosa growing in a biofilm. Antimicrob Agents C hemother,1995,39:1038～1044.
[9]Soboh F,Khoury AE,Zamboni AC,et al. Effects of ciprofloxacin and pr otamine sulfate combinations against catheter-associated pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother,1995,39:1281～1286.
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[10]Giwercman B,Jensen ET,Hoiby N,et al. Induction of β-lactam ase production in pseudomonas aeruginosa biofilm. Antimicrob Agents Chemother,19 91,35:1008～1010.
[11]方向群，刘又宁，陈迁，等. 阿奇霉素对生物被膜的抑制及对氟罗沙星的增效作用.中华结核和呼吸杂志，1998，21：538～540.
[12]Ishida H,Ishida Y,Kurosaka Y,et al. In vitro and in vivo a ctivities of levofloxacin against biofilm-producing pseudomonas aeruginosa. Ant imicrob Agents Chemother,1998,42:1641～1645.
[13]Stoodley P,Beer DD,Lappin-scott HM. Influence of electric fields and pH on biofilm structure as related to the bioelectric effect. Antimi crob Agents Chemother,1997,41:1876～1879., http://www.100md.com