胸腺基质细胞研究方法的进展
作者：覃淑云
单位：覃淑云(右江民族医学院组胚学教研室 百色 533000)
关键词：
右江民族医学院学报0001126 胸腺基质细胞(thymic stromal cell,TSC)是指胸腺内的非胸腺细胞，主要由上皮细胞(thymi epithelial cell，TEC)、成纤维细胞(thymic fibroblast cell,TFC)、巨噬细胞(thymic macrophage,TM )、树突状细胞(thymic deutrtic cell,TDC)组成[1,2]。近来还发现有肥大细胞(mast cell)[3]和B细胞(thymic B cell,TBC)[4]。
由于胸腺微环境是由胸腺基质细胞和胸腺细胞共同构成[5,6]，而胸腺基质细胞 是提供胸腺细胞增殖、分化的微环境基础[7]，对T细胞的发育有重要的选择作用[8]。近年来对胸腺基质细胞的研究日益引起重视。而研究TSC的方法众多，各有优缺点，从总的发展趋势看，是从整体到细微，从器官水平到分子水平，但均不可缺。器官水平的研究具有人为改变的条件少，结果与实际较为接近的长处，但结论代表的是总体TSC作用的结果，很难阐明某种单一TSC的确切功能；细胞、分子水平的研究虽然弥补了器官水平的不足，但因实验条件与体内的实际环境有相当大的距离，得出的结论不一定符合具体事实。目前对TSC研究有以下几种常用的方法。
, http://www.100md.com
1 放射线照射
用致死量或亚致死量放射线照射后，动物体内处于分裂增殖状态的细胞(尤其是血细胞、胸腺细胞、成血细胞等)死亡，基质细胞因对照射较耐受而影响不大。此后给动物导入某种细胞，可观察TSC对其作用的情况。Iwabuchik,等采用此法研究表明，MHC抗原分子在TSC上的表达与某种亚群胸腺细胞的出现密切相关。
2 TSC原代培养
TSC多具有贴壁生长的特点，经换液等方式将培养中的胸腺细胞去除后，这些短期培养的TSC表型及功能与体内接近，便于从总体上把握。最近，有人用这种原代培养的不均一TSC与CD3-4-8-胸腺细胞共育发现：共同培养后第一天即出现CD4+8+亚群，第2天则观察到CD4+8-和CD4-8+[7]。目前，我国对TSC的培养少且限于原代培养，且证明TSC为混合体[9]。
, 百拇医药
3 胚胎胸腺移植
在胚胎发育早期阶段，TSC主要以TEC为主。通过对胸腺原基用dGuo(deoxyguanosine)进行处理(dGuo-TE)或将其在4℃下培养(4℃-TE)后，胸腺原基中的骨髓来源的细胞被去除。将dGuo-TE或4℃-TE移植裸鼠的肾囊下[10,11]，即可观察TEC的功能。通过这种方法研究发现TEC与免疫耐受有密切关系[10]。
4 TSC的分离、纯化
根据TSC的不同表型特点，可从胸腺中新鲜分离出某种类型的TSC。较常用于TM、TDC、TBC的研究上[12]。
5 细胞建株(系)
采用单一成分进行研究是探讨TSC各组份功能的关键。尽管没有获得TSC的所有类型，所有亚群，但近年来的体外建株工作仍取得可喜的成果。建株主要采用常规和病毒转染两种方法。
, http://www.100md.com
5.1 常规方法 逐步改变TSC的培养条件，使其适应体外普通的培养条件并获得不死性(immortalixation),成为可在体外长期生长的细胞系(株)。在TEC的建系(株)中，国外多数实验室在建株(系)期采用这样的方法：以丝裂霉素处理的3T3成纤维细胞系为滋养层，培养基中加入胎牛血清、上皮生长因子、霍乱毒素、胰岛素、氢化可的松和抑制纤维细胞生长的D-缬氨酸等，此法耗资昂贵。国内舒石庄等创立了无上述添加剂的普通培养基(DMEM+10%-20%NCS)加L-缬氨酸的方法，成功地建成了8个小鼠TSC细胞系MTSC[1～8,13]。
5.2 病毒转染建株法 常规法建细胞系具有耗时长(常为9个月)，细胞成份不均一、不易克隆化等弱点，使得人们探索出建株的另一种方法—病毒转染法。许多病毒可使细胞获得不死性但仍具备原有的基本特征。采用此类病毒转染原代培养的TSC，即有可能获得转染的细胞株，此法的关键在于病毒的选择及其分子的改建，既易于转染又不表达病毒基因产物，不影响原有细胞的各种性质是最理想的结果，通过病毒转染法目前已建成被膜下TEC、TNC等TSC克隆。
, 百拇医药
6 转基因技术
采用转基因技术使某种分子表达在某种TSC上，观察转基因产物的出现与T细胞分化的关系。这种方法具有许多优点：接受分析的TSC处于体内环境中，人为因素少，同时转基因产物具有特殊的标志，易于实验观察。
7 抗原性研究
由于TSC由多细胞组成，各组细胞还存在不用亚群，可用分离纯化方法TSC后制备TSC单抗。1990年，Godfrey D.I.等[14]报道了他们成功研制出16种抗BALB/C品系小鼠TSC单抗，命名为MTS。而国内农高惠等[15]从TSC抗原性的角度研制出大鼠抗小鼠TSC单抗，填补了国内TSC单抗的空白。汪维伟等[16]用免疫组织化学ABC法对TSC的免疫表型进行了分析，并证明了胸腺细胞与TSC存在相互依赖的共生现象[17]和直接接触作用等[18,19]。
, http://www.100md.com
8 形态学观察
具有直观、可定位等优点。不管是普通或特殊染色观察还是电镜超微结构观察，应用都极其广泛。许多的研究方法最终需靠形态学观察得到结论。形态学结果也可指导其他方法的研究。目前对TSC的形态学研究获得相当重要的成果[3]。
当然对于TSC的研究，方法众多，但往往不是单一方法能研究好TSC的形态和功能，往往是几种方法同时使用，才能更深入了解TSC的其他方面的功能。■
(本文经覃志坚副教授审校，特表谢意!)
参考文献：
[1]Wekerle H. Thymic nurse cells. Morohological and serogical characterization. J Exp Med,1980;151:925
, http://www.100md.com
[2]Steinman RM. Dendritic cells of the mouse: Indentification and characterization. J Invest Dermatol,1980;75:14
[3]吴江声，张兰芬，孙品伟，等.小鼠胸腺基质细胞的类型和分布.北京医科大学学报,1991;23(1):6
[4]Spencer J, Choy M, Hussell T. Properties of human thymic Bcells. Immunology,1992;75:596
[5]Boyd BL, Tucek CL, Godfrey LI, et al. The thymic microenvironment. Immunology Today,1993,14:445
[6]Owen JJT, Moore NC. Thymocyte stromal-cell interaction and T cell selection. Immunology Today, 1995,16:336
, http://www.100md.com
[7]Fine JS, Kruisbeek AM. The role of LFA/ICAM-1 interactions during murine T-lymphocyte devlopment. J Immunol,1991;147:2852
[8]Blackman M, The role of the T cell receptor in positive and negative selection of developing T cells. Science,1990;28:1335
[9]孙品伟,吴江声,张兰芬,等.早期培养人胎胸腺基质细胞的组织化学和免疫组织观察.北京医科大学学报,1994;26(2):93
[10]Robinson J.H, Chapman C.J, Loveland B.E. T-cell toleranee induced in nude mice grafted with thymic epithelium: Immunogy,1992;75:318
, 百拇医药
[11]Jordan R.K, Chapman C.J, Mclachlan S.M. IgG antibody and delayed -type hypersensitivity responses in nude mice grafted with thymic epithelium: Immunology，1990;70:453
[12]Galy A.H.M, Spits H, CD40 is functionally expressed onhuman thymic epithelial cells: J. Immunollgy,1992;149:775
[13]舒石庄,陈慰峰,刘视公,等.八株小鼠胸腺基质细胞系的建立及鉴定.北京医科大学学报,1993;25(4):237
[14]Godfrey D.I, Izon D.J, Tucek C.L. The phenotypic heterogeneity of mouse thymic seromal cells: Immunology,1990;70:66
, http://www.100md.com
[15]农高惠,陈慰峰,吴江声.大鼠抗小鼠胸腺基质细胞单克隆抗体的研制与鉴定.北京医科大学学报,1994;26(1):3
[16]汪维伟，张建华，林雪梅，等.人胎儿胸腺淋巴细胞的免疫表型分析.解剖学报,1998,21(4):346
[17]Ritter MA, Boyd RL. Development in thethymus: It takas two to tango.Immunology Tosay,1993；14:462
[18]Boyd RL, Hugo P. Towards an integrated view of thymopoiesis. Immunology Today,1991；12:71
[19]Anderson SJ, Perlumtter RM. A signaling pathway governing early thymocytes maturation.Immunology Today,1995；16:99
收稿日期：1999-04-19
, 百拇医药
单位：覃淑云(右江民族医学院组胚学教研室 百色 533000)
关键词：
右江民族医学院学报0001126 胸腺基质细胞(thymic stromal cell,TSC)是指胸腺内的非胸腺细胞，主要由上皮细胞(thymi epithelial cell，TEC)、成纤维细胞(thymic fibroblast cell,TFC)、巨噬细胞(thymic macrophage,TM )、树突状细胞(thymic deutrtic cell,TDC)组成[1,2]。近来还发现有肥大细胞(mast cell)[3]和B细胞(thymic B cell,TBC)[4]。
由于胸腺微环境是由胸腺基质细胞和胸腺细胞共同构成[5,6]，而胸腺基质细胞 是提供胸腺细胞增殖、分化的微环境基础[7]，对T细胞的发育有重要的选择作用[8]。近年来对胸腺基质细胞的研究日益引起重视。而研究TSC的方法众多，各有优缺点，从总的发展趋势看，是从整体到细微，从器官水平到分子水平，但均不可缺。器官水平的研究具有人为改变的条件少，结果与实际较为接近的长处，但结论代表的是总体TSC作用的结果，很难阐明某种单一TSC的确切功能；细胞、分子水平的研究虽然弥补了器官水平的不足，但因实验条件与体内的实际环境有相当大的距离，得出的结论不一定符合具体事实。目前对TSC研究有以下几种常用的方法。
, http://www.100md.com
1 放射线照射
用致死量或亚致死量放射线照射后，动物体内处于分裂增殖状态的细胞(尤其是血细胞、胸腺细胞、成血细胞等)死亡，基质细胞因对照射较耐受而影响不大。此后给动物导入某种细胞，可观察TSC对其作用的情况。Iwabuchik,等采用此法研究表明，MHC抗原分子在TSC上的表达与某种亚群胸腺细胞的出现密切相关。
2 TSC原代培养
TSC多具有贴壁生长的特点，经换液等方式将培养中的胸腺细胞去除后，这些短期培养的TSC表型及功能与体内接近，便于从总体上把握。最近，有人用这种原代培养的不均一TSC与CD3-4-8-胸腺细胞共育发现：共同培养后第一天即出现CD4+8+亚群，第2天则观察到CD4+8-和CD4-8+[7]。目前，我国对TSC的培养少且限于原代培养，且证明TSC为混合体[9]。
, 百拇医药
3 胚胎胸腺移植
在胚胎发育早期阶段，TSC主要以TEC为主。通过对胸腺原基用dGuo(deoxyguanosine)进行处理(dGuo-TE)或将其在4℃下培养(4℃-TE)后，胸腺原基中的骨髓来源的细胞被去除。将dGuo-TE或4℃-TE移植裸鼠的肾囊下[10,11]，即可观察TEC的功能。通过这种方法研究发现TEC与免疫耐受有密切关系[10]。
4 TSC的分离、纯化
根据TSC的不同表型特点，可从胸腺中新鲜分离出某种类型的TSC。较常用于TM、TDC、TBC的研究上[12]。
5 细胞建株(系)
采用单一成分进行研究是探讨TSC各组份功能的关键。尽管没有获得TSC的所有类型，所有亚群，但近年来的体外建株工作仍取得可喜的成果。建株主要采用常规和病毒转染两种方法。
, http://www.100md.com
5.1 常规方法 逐步改变TSC的培养条件，使其适应体外普通的培养条件并获得不死性(immortalixation),成为可在体外长期生长的细胞系(株)。在TEC的建系(株)中，国外多数实验室在建株(系)期采用这样的方法：以丝裂霉素处理的3T3成纤维细胞系为滋养层，培养基中加入胎牛血清、上皮生长因子、霍乱毒素、胰岛素、氢化可的松和抑制纤维细胞生长的D-缬氨酸等，此法耗资昂贵。国内舒石庄等创立了无上述添加剂的普通培养基(DMEM+10%-20%NCS)加L-缬氨酸的方法，成功地建成了8个小鼠TSC细胞系MTSC[1～8,13]。
5.2 病毒转染建株法 常规法建细胞系具有耗时长(常为9个月)，细胞成份不均一、不易克隆化等弱点，使得人们探索出建株的另一种方法—病毒转染法。许多病毒可使细胞获得不死性但仍具备原有的基本特征。采用此类病毒转染原代培养的TSC，即有可能获得转染的细胞株，此法的关键在于病毒的选择及其分子的改建，既易于转染又不表达病毒基因产物，不影响原有细胞的各种性质是最理想的结果，通过病毒转染法目前已建成被膜下TEC、TNC等TSC克隆。
, 百拇医药
6 转基因技术
采用转基因技术使某种分子表达在某种TSC上，观察转基因产物的出现与T细胞分化的关系。这种方法具有许多优点：接受分析的TSC处于体内环境中，人为因素少，同时转基因产物具有特殊的标志，易于实验观察。
7 抗原性研究
由于TSC由多细胞组成，各组细胞还存在不用亚群，可用分离纯化方法TSC后制备TSC单抗。1990年，Godfrey D.I.等[14]报道了他们成功研制出16种抗BALB/C品系小鼠TSC单抗，命名为MTS。而国内农高惠等[15]从TSC抗原性的角度研制出大鼠抗小鼠TSC单抗，填补了国内TSC单抗的空白。汪维伟等[16]用免疫组织化学ABC法对TSC的免疫表型进行了分析，并证明了胸腺细胞与TSC存在相互依赖的共生现象[17]和直接接触作用等[18,19]。
, http://www.100md.com
8 形态学观察
具有直观、可定位等优点。不管是普通或特殊染色观察还是电镜超微结构观察，应用都极其广泛。许多的研究方法最终需靠形态学观察得到结论。形态学结果也可指导其他方法的研究。目前对TSC的形态学研究获得相当重要的成果[3]。
当然对于TSC的研究，方法众多，但往往不是单一方法能研究好TSC的形态和功能，往往是几种方法同时使用，才能更深入了解TSC的其他方面的功能。■
(本文经覃志坚副教授审校，特表谢意!)
参考文献：
[1]Wekerle H. Thymic nurse cells. Morohological and serogical characterization. J Exp Med,1980;151:925
, http://www.100md.com
[2]Steinman RM. Dendritic cells of the mouse: Indentification and characterization. J Invest Dermatol,1980;75:14
[3]吴江声，张兰芬，孙品伟，等.小鼠胸腺基质细胞的类型和分布.北京医科大学学报,1991;23(1):6
[4]Spencer J, Choy M, Hussell T. Properties of human thymic Bcells. Immunology,1992;75:596
[5]Boyd BL, Tucek CL, Godfrey LI, et al. The thymic microenvironment. Immunology Today,1993,14:445
[6]Owen JJT, Moore NC. Thymocyte stromal-cell interaction and T cell selection. Immunology Today, 1995,16:336
, http://www.100md.com
[7]Fine JS, Kruisbeek AM. The role of LFA/ICAM-1 interactions during murine T-lymphocyte devlopment. J Immunol,1991;147:2852
[8]Blackman M, The role of the T cell receptor in positive and negative selection of developing T cells. Science,1990;28:1335
[9]孙品伟,吴江声,张兰芬,等.早期培养人胎胸腺基质细胞的组织化学和免疫组织观察.北京医科大学学报,1994;26(2):93
[10]Robinson J.H, Chapman C.J, Loveland B.E. T-cell toleranee induced in nude mice grafted with thymic epithelium: Immunogy,1992;75:318
, 百拇医药
[11]Jordan R.K, Chapman C.J, Mclachlan S.M. IgG antibody and delayed -type hypersensitivity responses in nude mice grafted with thymic epithelium: Immunology，1990;70:453
[12]Galy A.H.M, Spits H, CD40 is functionally expressed onhuman thymic epithelial cells: J. Immunollgy,1992;149:775
[13]舒石庄,陈慰峰,刘视公,等.八株小鼠胸腺基质细胞系的建立及鉴定.北京医科大学学报,1993;25(4):237
[14]Godfrey D.I, Izon D.J, Tucek C.L. The phenotypic heterogeneity of mouse thymic seromal cells: Immunology,1990;70:66
, http://www.100md.com
[15]农高惠,陈慰峰,吴江声.大鼠抗小鼠胸腺基质细胞单克隆抗体的研制与鉴定.北京医科大学学报,1994;26(1):3
[16]汪维伟，张建华，林雪梅，等.人胎儿胸腺淋巴细胞的免疫表型分析.解剖学报,1998,21(4):346
[17]Ritter MA, Boyd RL. Development in thethymus: It takas two to tango.Immunology Tosay,1993；14:462
[18]Boyd RL, Hugo P. Towards an integrated view of thymopoiesis. Immunology Today,1991；12:71
[19]Anderson SJ, Perlumtter RM. A signaling pathway governing early thymocytes maturation.Immunology Today,1995；16:99
收稿日期：1999-04-19
, 百拇医药