人乳头瘤病毒感染、P53、ras癌基因异常与大肠癌
作者：任占平
单位：任占平(广西柳州市人民医院 柳州 545001)
关键词：
右江民族医学院学报0001125 大肠癌是我国十分常见的恶性肿瘤，占全部胃肠道癌的第1～2位[1]，最新的统计资料表明，随着我国人民生活水平的提高及生活方式、饮食、环境的变化，我国大肠癌的发病率呈明显上升的趋势，在华北、西北几个主要城镇十余万无症状人群的普查结果显示，大肠癌的发病率已达23.31/10万，居世界中等发病水平。1992～1995年我国恶性肿瘤死亡抽样调查显示，恶性肿瘤是我国人口第二位死亡的原因，而大肠癌、肺癌是两个死亡率上升最快的恶性肿瘤[2,3]。大肠癌的发生主要认为与环境、饮食、肠息肉、慢性结肠炎、遗传、癌基因等因素密切相关，但其确切的病因及发病机理仍尚不十分清楚。近年来，随着分子生物学技术的应用，人们在大肠癌组织中已证实有人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)DNA的存在。此外，大量的研究亦证实抑癌基因P53的突变，多个癌基因如ras，c-myc等的激活均与大肠癌的发生机制密切相关[4,5]。现结合有关文献对HPV及癌基因与大肠癌的关系综述如下。
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1 HPV的结构及其致癌作用
HPV是一种引起人皮肤、粘膜增生性损害的DNA病毒，其基因组是一闭环、双链DNA，约8000个碱基对，分子量为5.2×103KD，它们原属于人乳多空病毒科成员，但随着HPV基因结构和生物学特性研究的深入，现已认为是一类独立的病毒[6]，所有的HPV都显示相似的线性基因结构，由上游区(UPR)及随后的5～8个早期(E)基因和2个晚期(L)基因组成的HPV开放读码框架(ORF)位于同一条DNA链上，排列顺序为3′-URR-E6-E7-E1-E2-E3-E4-E5-L2-L1-5′。所有的ORF编码产生功能不同的多种病毒蛋白，E1区涉及病毒DNA的复制；E2涉及病毒NDA转录的反式激活；E3功能不清；E4与病毒成熟胞浆蛋白有关；E5在牛乳头瘤病毒(BPV)中参与细胞转化，而在HPV，它可刺激易感细胞的增生，最近的研究认为E5可能是人细胞永生化和转化的潜在介质；E6、E7主要与病毒细胞转化功能及致癌性有关，是病毒的主要癌蛋白。晚期区L1、L2主要编码衣壳蛋白。上游调节区功能不很确定，可能对病毒的复制与转录起调节作用。根据DNA杂交试验和酶谱分析，已有70多型HPV被鉴定。HPV引起的病变有非癌性和癌性两种，根据其能否致癌以及在癌发生中的潜在作用，HPV已被分为：低危(Lower risk)型，如HPV6，11型；中危(Intermediate risk)型，如HPV33，35，39，51，52型和高危(High risk)型，如HPV16，18，31，45，56型。而高危型中HPV16、HPV18两型已被证实与人宫颈癌、肛门癌、肺癌、食管癌、膀胱癌、大肠癌等恶性肿瘤的病因学密切相关[4,6,7]。
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研究表明，HPV感染宿主细胞后的致瘤作用与HPVDNA整合入宿主细胞DNA有关。HPV在感染细胞中有两种存在形态：与细胞染色体整合状态和染色体外的游离状态。游离状态多见于生殖道湿疣和癌前病变中。在与HPV6，11型有关的病变中HPVDNA的整合形式非常罕见，而在HPV16，18型感染的宫颈癌肿瘤细胞中，其DNA以单拷贝或多拷贝整合于细胞基因组中，整合部位常发生在E1，E2，E4和E5区，结果在整合中这些区域DNA片段随整合丢失，而下游区域E6和E7基因整合入宿主细胞中，对HPV16，18来说，E2似乎主要充当转录E6和E7基因启动子的随遏物。由于E2基因的破裂，病毒基因的结合方式有可能为E6，E7基因表达失调而导致细胞增生失控。体外实验已证实HPV16，18的E6、E7能使人细胞永生化，永生化细胞株传代培养中细胞有瘤变样生长。而瘤细胞系的E6、E7表达受阻后则组织生长和肿瘤发生相应受阻[7,8]。
HPV感染宿主后进入上皮基底细胞的方式尚不十分清楚，通过粘膜微小破损处进入上皮基底层是一种解释，病毒进入后脱去外层衣壳蛋白，病毒DNA进入细胞核内，HPVDNA复制过程与细胞DNA同步并随细胞分裂而分裂[9]。HPV对宿主有特异性的嗜上皮性，几乎见于人体每个部位的鳞状上皮内(包括起源的和化生的)。以往研究HPV与肿瘤的关系仅局限于与鳞状上皮癌相关的领域，但近年来，已有较多的研究证实在腺上皮起源的肿瘤中有HPV16，18型DNA的存在[8]。1988年，Wilczynski[10]用HPV6，11，16，18，19，31混合型探针检测11例宫颈腺癌，63.6%(7/11)阳性，其中HPV16，18是致癌的主要类型。因而，探讨HPV感染与腺上皮肿瘤病因学之间的关系已成为目前研究的热点。
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2 HPV16、18，P53，ras与大肠癌
肿瘤病因学资料表明，大肠癌实际上是环境和遗传因素共同影响的恶性肿瘤，因而研究大肠癌及其高危对象的环境因素将有助于揭示大肠癌的癌变机理，并为癌前监控和早期发现提供有力的证据。鉴于大肠癌的发生是一个多步骤、多因素参与的过程，这包括结肠上皮增生、肠腺瘤、腺癌，其间涉及多个抑癌基因的失活及癌基因的激活，那么，作为与环境因素密切相关的HPV感染是否作为一个病因学因素以及HPV感染后是否通过激活/灭活(抑)癌基因，参与了大肠癌的发生过程，对于揭示大肠癌的病因及病理发生机制并为今后临床早期防治以及基因治疗提供依据则是十分关键的。
1990年，Kirgan等[4]首先采用免疫组化技术和分子原位杂交技术，在23%(7/30)的正常肠粘膜，60%(18/30)的结肠良性腺瘤，100%(13/13)的结肠原位癌和97%(29/30)结肠浸润性腺癌中检出HPV抗原，应用HPV6、11、16、18、31、33、35混合型DNA探针，对上述HPV抗原阳性材料进行分子原位杂交，结果显示：7例HPV抗原阳性的正常肠粘膜，HPVDNA均为阴性；腺瘤组18例HPV抗原阳性者，HPVDNA阳性率为27%(5/18)；原位癌中为69%(9/13)，浸润性癌中为31%(9/29)。经统计学处理，结肠肿瘤与正常粘膜组织之间HPV的阳性率差异有高度显著性(P<0.001)。提出HPV可感染结肠粘膜上皮细胞，HPV感染与结肠肿瘤有着密切的联系，认为HPV感染可能是结肠癌发生的病因之一，同时提出了一种假设，癌基因异常既然已被证实在大肠癌中，那么是否象宫颈癌发生机理一样，HPV感染后通过激活癌基因，参与了从粘膜—腺瘤—恶性改变的进展过程。1991年，Manalo等用电子显微镜在大肠癌癌细胞核内显示有HPV病毒颗粒的存在。1996年，陈建华等[11]采用PCR技术，应用HPV16E6的基因引物，检测17例结直肠癌，13例腺瘤，结果52.9%(9/17)的结肠腺癌和30.8%(4/13)的结肠腺瘤出现HPV16DNA阳性，认为HPV16参与了结直肠腺瘤和腺癌的形成。HPV因感染在癌与腺瘤、部位、分化程度之间差异无显著性(P>0.05)，但他们注意到随着腺癌分化程度的降低，HPV16阳性率呈升高趋势，预示着HPV16感染引起的腺癌恶性程度往往较高。唐金海等[12]应用PCR技术检测21例大肠癌中HPV16、18及c-erbB-2基因，结果：4例(19.05%)HPV16阳性，其中1例为HPV16、18双阳性；6例(28.57%)c-erbB-2基因拷贝数增加，在2例HPV16阳性者同时有c-erbB-2基因拷贝数增加。认为：我国大肠癌组织中存在着HPV感染的现象，部分HPV感染的病例可能同时存在着c-erbB-2基因的扩增。周宇等[13]采用PCR和Southern blot杂交技术检测50例大肠腺癌，38例大肠腺瘤及20例正常大肠组织中HPV16DNA，结果显示：三组病例的阳性率分别为42.0%、31.6%和0，前二者HPV16DNA的阳性率分别显著高于正常粘膜组(P<0.05)，而大肠癌与腺瘤组之间HPV16阳性率差异无显著性(P>0.05)，但HPV16DNA阳性的12例大肠腺瘤均伴有组织异常增生，推测HPV16可能开始作用于癌前病变并在其它因素协同下导致癌前病变逐渐癌变。此外，在4例腺癌病人，在原发癌及转移淋巴结组织中均检到HPV16DNA，表明HPV是大肠癌的病因之一。然而，也有少数报道认为HPV感染与大肠腺癌无关。Kneneth[14]采用PCR方法检测22例结肠癌，无一例有HPVDNA存在，且各地报道的阳性率也不一致，这些差异现认为可能与地区性及研究的方法、探针的类型、标本中HPVsDNA拷贝的高低等因素有关[13]。
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与大肠癌的发生密切相关的抑癌基因除MCC、APC、DCC等外，主要有P53，是定位于17号染色体短臂的肿瘤抑制基因，其在细胞增殖、分化和凋亡中起着关键的作用，由于突变和等位基因缺失使其功能失活在许多肿瘤发生中是十分重要的，大量的研究已证实P53在大肠癌的突变率高达50%～90%，其突变位点多发生于相对保守的第5～8外显子上[15]，腺瘤伴重度不典型性增生为8.7%～69%，轻度异型增生为0～18%。在大肠腺瘤、不典型性增生、大肠癌中，P53的阳性率呈逐渐上升的趋势。段国辰等[16]应用流式细胞术检测8例正常肠粘膜，22例肠腺瘤，28例腺瘤癌变，28例大肠腺癌中P53和ras，结果正常组中P53、ras均为阴性；腺瘤组中ras阳性率为31.82%，P53阳性率为40.91%；腺瘤癌变组中ras阳性率为42.86%，P53阳性率为64.28%；腺癌组中ras阳性率为75.00%，P53阳性率为67.86%。Goh等[17]检测187例结直肠癌，其中55.0%有P53点突变，同时检测了80例癌中P53蛋白，其中76.0%显示P53蛋白阳性表达。而曹江等[18]采用P53反义RNA对人大肠癌细胞株SWN16(内源性突变型P53)观察到其增殖速度显著下降，认为P53反义RNA可能有效地抑制大肠癌细胞的致癌性，提示P53突变在大肠癌发生中和基因治疗中的重要意义。ras基因由K-ras，H-ras和N-ras家族构成，其编码的蛋白质高度相似，分子量均为21KDa，该蛋白在胞浆内合成，经翻译后与类脂结合，然后转移到质膜，位于胞浆膜内面，它具有与鸟氨酸结合的能力及GTP酶活性能将GTP水合成GDP，在正常情况下，大部分P21蛋白与GDP结合后以非激活形式存在，当信号传递通路中的某一蛋白发生改变，GDP改转变为GPT，呈活化态，活化的P21与效应分子相互作用，使GTP失活成GDP。当ras基因发生突变时，P21便一直处于激活状态，最终导致细胞突变。ras基因突变最常见于大肠癌，在大肠癌中转化基因主要为K-ras，其在第12密码子上的G-T转换，40%～65%的大肠癌及中晚期的腺瘤中有ras基因的突变。梁智勇[5]检测30例大肠腺瘤及74例大肠腺癌，P21ras的阳性率分别为53.3%和72.9%，其中31例癌中有ras基因的突变，ras基因的突变被认为在癌变过程中起启动作用并是一个早期事件[19]。这些研究结果均证实了P53、ras基因的异常均参与了人大肠癌的发生过程。然而，在大肠癌及腺瘤中，这两个重要的基因的激活、失活是否与HPV感染有关，在HPV16、18型阳性的大肠腺瘤、大肠腺癌中P53、ras基因的表达协同关系如何，HPV16、18感染在大肠癌发生机制中的机理是否与宫颈癌发生的机理相似，目前国内尚未见这方面的报道。我们受到高危型HPV16、18型感染后，通过影响P53、ras等多个癌基因的功能，协同参与了宫颈癌发生、发展过程的启示，应用HPV16、18E6、P53、ras单克隆抗休，检测正常大肠组织、肠腺癌、大肠癌组织，探讨高危HPV16、18型感染与P53、ras(抑)癌基因协同在大肠癌病因及发生机制中的作用。
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1992年，Cooper等[20]应用地高辛标记的HPV6，11，16，18，31，33，35型探针，检测了38例宫颈腺癌，53%(20/38)腺癌中含有HPVDNA，其中16例为HPV18，4例为HPV16，且其阳性颗粒主要以整合的形式存在。HPV16、18DNA在宫颈腺癌细胞核内的整合现已被较多的研究所证实[21]。HPV16、18型感染人腺上皮后，其病毒基因整合到宿主细胞的基因组中，病毒基因的整合导致其E6、E7基因片段得以持续的转录和表达，HPV16、18致癌的中心环节是其转化蛋白E6、E7与细胞癌基因、抑癌基因相互作用的结果。HPV16E6蛋白单独可转化NIH3T3细胞，反式激活腺病毒E2启动子，点突变的E6ORF(227核苷酸G-A)与活化的ras基因共转染，可转化BRK细胞。E6蛋白致癌的关键是E6与细胞内野生型P53结合形成复合物并在一种E6-AP的辅助下通过酶，促使P53降解，且HPV16、18E6可经插入等方式整合到人染色体某一位点而导致P53基因突变[7,22]，HPV16、18的E6所致的P53灭活(或)突变使得P53对细胞增殖周期相关因子P21WAF1、Cyclins、PCNA、Cdks的调节作用丧失，细胞中DNA损伤累积，造成细胞癌变。而E7蛋白可干扰抑癌蛋白RB与E2F结合导致细胞增殖周期的紊乱，细胞增殖、分裂加速并有恶变倾向。最近的研究还证实E6可通过激活端粒酶而使正常细胞永生化[23]。因而，HPV16、18感染后所致抑癌基因P53的灭活(或)突变可能是大肠腺瘤上皮中、重度不典型性增生发展、大肠腺瘤癌变转化过程中的关键步骤。值得注意的是，传统的观点认为：P53基因突变是肿瘤晚期阶段发生的事件。但我们检测53例大肠癌及10例腺瘤恶变组，二者P53阳性表达差异无显著性并且HPV16、18E6与P53的阳性表达均具显著相关性，在大肠腺瘤，随着上皮伴不典型性增生程度的加重，E6、P53的阳性率呈逐渐升高的趋势。因而，我们认为在高危HPV16、18感染因素下P53突变及表达可发生在大肠癌的早期阶段，尤其在腺瘤癌变过程中起重要的作用。余心如检测34例大肠腺瘤早期癌变材料，P53蛋白的阳性率为50%，其中5例同时在腺瘤区有P53阳性表达，认为P53的检测对判断腺瘤有无恶变具有重要的参考价值，是腺瘤细胞进入癌变的分子信号。国内朱有法等[23]的研究也提出P53突变发生在大肠癌形成早期阶段。此外，HPV16、18的E6、E7的致癌作用需在活化的癌基因协同下进行，HPV16的E7能激活ras癌基因，HPV16、18DNA的整合多位于c-myc基因的附件，从而导致c-myc的局部扩增和高表达。研究证实，HPV16、18的E6、E7永生化小鼠原始肾细胞的能力需在活化的ras、c-myc的协同下进行且活化的ras基因能与E6、E7及突变的P53基因协同转化原代细胞[7,24]。因而，HPV16、18型感染后所致ras基因的激活、P53抑癌基因的失活(或)突变，协同可能涉及了HPV16、18感染后大肠粘膜柱状上皮细胞癌变的发生机理。
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3 大肠癌前病变及癌中HPV16、18E6，P53，ras检测的意义
大肠癌的发生是一个缓慢的发展过程，从病理组织学上经历息肉形成，腺瘤形成，最后发展为癌。既然在大肠癌形成的前期存在高危HPV16、18型的感染并可通过激活或灭活ras、P53(抑)癌基因而涉及了大肠癌的发生过程，那么在大肠腺瘤阶段的HPV感染及基因变异是否意味着其具有使腺上皮向中、重度不典型性增生及癌变发展的趋势，在此期间检测HPV16、18E6及P53、ras基因变异作为早期诊断的依据对于大肠癌的早期防治是十分有意义的。我们检测了53例大肠癌，10例腺瘤恶变，30例大肠腺瘤和30例正常大肠组织，结果证实在腺癌，腺瘤恶变，腺瘤组中HPV16、18E6，P53，P21ras的阳性表达分别为54.7%(29/53)、62.2%(33/53)，71.7%(38/53)，60.0%(6/10)、60.0%(6/10)、70.0%(7/10)和36.7%(11/30)、33.3%(10/30)、40.0%(12/30)，而正常组均呈阴性表达且三组材料中E6与P53，E6与P21ras的阳性表达均具显著相关性。此外，在研究中我们注意到，从随着大肠腺瘤伴不典型性增生的加重以及在腺瘤恶变、大肠癌中，HPV16、18E6，P53，P21ras的阳性率呈逐渐升高的趋势，表明在不典型性增生病变中HPV16、18感染同时细胞内抑癌基因P53的灭活(或)突变程度以及ras基因的激活程序已启动，这或许可作为病变向癌变发展早期预测的形态学和免疫学指标，这将有助于早期筛选高危人群，及时阻断高危型HPV感染—癌基因激活、抑癌基因失活(或)突变—上皮不典型性增生—癌的发展顺序以及为今后开展基因治疗提供了科学的依据。
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综上所述，分子生物学和免疫组化技术均证实了HPV16、18型感染，P53、ras基因表达在大肠癌及癌前病变组织中的存在，表明高危HPV16、18感染后通过影响P53基因的负调控功能并与活化的ras癌基因协同，在大肠癌的病理发生机制中可能起到十分关键的作用。随着人们对高危HPV感染后多个癌基因激活，协同在大肠癌发生机理中的深入研究，将为大肠癌的早期防治、开展免疫治疗和基因治疗，提高大肠癌术后生存率提供有效的帮助。■
参考文献：
[1]郑芝田.胃肠病学.第2版.北京：人民卫生出版社，1993：711
[2]李世荣.开展群众性普查工作提高大肠癌早诊水平.中国肿瘤，1997；6(3)：20
[3]俞顺章.我国肿瘤的一级预防.中国肿瘤，1997；6(1)：6
, 百拇医药
[4]Kirgan D, Manalo P, Hall M, et al. Association of human papillomavirus and colon neoplasms. Arch Sury，1990；125：862
[5]梁智勇，柳风轩，罗光辉，等.大肠腺瘤与腺癌P21，P53，P185蛋白表达及ras，P53基因突变的检测.中华病理学杂志，1995；24(6)：352
[6]Herrington CS. Human papillomaviruses and cervical neoplasia. I. Classification, virology, pathology and epidemiology. J Clin Pathol，1994；47：1066
[7]Herrington CS. Human papillomaviruses and cervical neoplasia. II. Interation of HPV with other factors. J Clin Pathol，1995；48(1)：1
, 百拇医药
[8]Arends MJ, Buckley CH, Wells M. Aetiology, pathogenesis, and pathology of cervical neoplasia. J Clin Pathol，1998；51：96
[9]金叶，陈涤瑕.人乳头瘤病毒与妇女生殖道肿瘤.国外医学(妇产科分册)，1993；20(5)：271
[10]Wilczynski SP, Walker J, Liao SY, et al. Adenocarcinoma of the cervix associated with human papillomavirus. Cancer，1998；62：1331
[11]陈建华，于皆平，沈志祥.HPV与人结直肠的关系.胃肠病学和肝病学杂志，1996；5(1)：45
[12]唐金海，王亚平，周建农，等.大肠癌组织中HPV和c-erbB-2基因的检测及其关系研究.中华实验外科杂志，1998；15(4)：296
, 百拇医药
[13]周宇，于皆平，沈祥志，等.HPV16型DNA在大肠腺癌组织中表达的研究.中国肿瘤临床，1998；25(7)：505
[14]战忠利，王平善，张连郁，等.结肠癌与人乳头状瘤病毒相关性研究.中华肿瘤杂志，1998；20(5)：393
[15]孙延平，曹雪涛.胃肠道肿瘤的基因治疗研究进展.国外医学(肿瘤学分册)，1996；23(1)：60
[16]段国辰，武锡辰，左连富.大肠肿瘤癌基因蛋白产物的定量研究.肿瘤，1997；17(4)：221
[17]Goh HS, Chan CS, Khine K, et al. P53 and behaviour of colorectal cancer. Lancet，1994；344(8917)：233
, 百拇医药
[18]曹江，滕理送，蔡心涵，等.P53反义RNA对癌细胞恶性表型的抑制作用.中华肿瘤杂志，1997；19(2)：123
[19]朱人敏，张予蜀.ras癌基因和大肠癌关系的研究.江苏医药，1997；23(2)：103
[20]Cooper K, Herrington CS, Lo ES-F, et al. Integration of human papillomavirus type 16 and 18 in cervical adenocarcinoma. J Clin Pathol，1992；45：382
[21]Cooper K, Mc Gee JO'D. Human papillomavirus, integration and cervical carcinogenesis: a clinicopathological perspective. J Clin Pathol，1997；50：1
, 百拇医药
[22]笪冀平，胡益云，陈乐真，等.肺癌人乳头瘤病毒感染与P53基因突变的研究.中华肿瘤杂志，1996；18(1)：27
[23]朱有法，朱景旭，许敬尧，等.大肠腺瘤不典型性增生及癌变组织中P53基因的表达及意义.中华病理学杂志，1996；25(5)：306
[24]陈华波，于修平.人乳头瘤病毒E6及E7蛋白研究进展.国外医学(微生物学分册)，1998；21(5)：11
收稿日期：1999-08-10
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单位：任占平(广西柳州市人民医院 柳州 545001)
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右江民族医学院学报0001125 大肠癌是我国十分常见的恶性肿瘤，占全部胃肠道癌的第1～2位[1]，最新的统计资料表明，随着我国人民生活水平的提高及生活方式、饮食、环境的变化，我国大肠癌的发病率呈明显上升的趋势，在华北、西北几个主要城镇十余万无症状人群的普查结果显示，大肠癌的发病率已达23.31/10万，居世界中等发病水平。1992～1995年我国恶性肿瘤死亡抽样调查显示，恶性肿瘤是我国人口第二位死亡的原因，而大肠癌、肺癌是两个死亡率上升最快的恶性肿瘤[2,3]。大肠癌的发生主要认为与环境、饮食、肠息肉、慢性结肠炎、遗传、癌基因等因素密切相关，但其确切的病因及发病机理仍尚不十分清楚。近年来，随着分子生物学技术的应用，人们在大肠癌组织中已证实有人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)DNA的存在。此外，大量的研究亦证实抑癌基因P53的突变，多个癌基因如ras，c-myc等的激活均与大肠癌的发生机制密切相关[4,5]。现结合有关文献对HPV及癌基因与大肠癌的关系综述如下。
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1 HPV的结构及其致癌作用
HPV是一种引起人皮肤、粘膜增生性损害的DNA病毒，其基因组是一闭环、双链DNA，约8000个碱基对，分子量为5.2×103KD，它们原属于人乳多空病毒科成员，但随着HPV基因结构和生物学特性研究的深入，现已认为是一类独立的病毒[6]，所有的HPV都显示相似的线性基因结构，由上游区(UPR)及随后的5～8个早期(E)基因和2个晚期(L)基因组成的HPV开放读码框架(ORF)位于同一条DNA链上，排列顺序为3′-URR-E6-E7-E1-E2-E3-E4-E5-L2-L1-5′。所有的ORF编码产生功能不同的多种病毒蛋白，E1区涉及病毒DNA的复制；E2涉及病毒NDA转录的反式激活；E3功能不清；E4与病毒成熟胞浆蛋白有关；E5在牛乳头瘤病毒(BPV)中参与细胞转化，而在HPV，它可刺激易感细胞的增生，最近的研究认为E5可能是人细胞永生化和转化的潜在介质；E6、E7主要与病毒细胞转化功能及致癌性有关，是病毒的主要癌蛋白。晚期区L1、L2主要编码衣壳蛋白。上游调节区功能不很确定，可能对病毒的复制与转录起调节作用。根据DNA杂交试验和酶谱分析，已有70多型HPV被鉴定。HPV引起的病变有非癌性和癌性两种，根据其能否致癌以及在癌发生中的潜在作用，HPV已被分为：低危(Lower risk)型，如HPV6，11型；中危(Intermediate risk)型，如HPV33，35，39，51，52型和高危(High risk)型，如HPV16，18，31，45，56型。而高危型中HPV16、HPV18两型已被证实与人宫颈癌、肛门癌、肺癌、食管癌、膀胱癌、大肠癌等恶性肿瘤的病因学密切相关[4,6,7]。
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研究表明，HPV感染宿主细胞后的致瘤作用与HPVDNA整合入宿主细胞DNA有关。HPV在感染细胞中有两种存在形态：与细胞染色体整合状态和染色体外的游离状态。游离状态多见于生殖道湿疣和癌前病变中。在与HPV6，11型有关的病变中HPVDNA的整合形式非常罕见，而在HPV16，18型感染的宫颈癌肿瘤细胞中，其DNA以单拷贝或多拷贝整合于细胞基因组中，整合部位常发生在E1，E2，E4和E5区，结果在整合中这些区域DNA片段随整合丢失，而下游区域E6和E7基因整合入宿主细胞中，对HPV16，18来说，E2似乎主要充当转录E6和E7基因启动子的随遏物。由于E2基因的破裂，病毒基因的结合方式有可能为E6，E7基因表达失调而导致细胞增生失控。体外实验已证实HPV16，18的E6、E7能使人细胞永生化，永生化细胞株传代培养中细胞有瘤变样生长。而瘤细胞系的E6、E7表达受阻后则组织生长和肿瘤发生相应受阻[7,8]。
HPV感染宿主后进入上皮基底细胞的方式尚不十分清楚，通过粘膜微小破损处进入上皮基底层是一种解释，病毒进入后脱去外层衣壳蛋白，病毒DNA进入细胞核内，HPVDNA复制过程与细胞DNA同步并随细胞分裂而分裂[9]。HPV对宿主有特异性的嗜上皮性，几乎见于人体每个部位的鳞状上皮内(包括起源的和化生的)。以往研究HPV与肿瘤的关系仅局限于与鳞状上皮癌相关的领域，但近年来，已有较多的研究证实在腺上皮起源的肿瘤中有HPV16，18型DNA的存在[8]。1988年，Wilczynski[10]用HPV6，11，16，18，19，31混合型探针检测11例宫颈腺癌，63.6%(7/11)阳性，其中HPV16，18是致癌的主要类型。因而，探讨HPV感染与腺上皮肿瘤病因学之间的关系已成为目前研究的热点。
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2 HPV16、18，P53，ras与大肠癌
肿瘤病因学资料表明，大肠癌实际上是环境和遗传因素共同影响的恶性肿瘤，因而研究大肠癌及其高危对象的环境因素将有助于揭示大肠癌的癌变机理，并为癌前监控和早期发现提供有力的证据。鉴于大肠癌的发生是一个多步骤、多因素参与的过程，这包括结肠上皮增生、肠腺瘤、腺癌，其间涉及多个抑癌基因的失活及癌基因的激活，那么，作为与环境因素密切相关的HPV感染是否作为一个病因学因素以及HPV感染后是否通过激活/灭活(抑)癌基因，参与了大肠癌的发生过程，对于揭示大肠癌的病因及病理发生机制并为今后临床早期防治以及基因治疗提供依据则是十分关键的。
1990年，Kirgan等[4]首先采用免疫组化技术和分子原位杂交技术，在23%(7/30)的正常肠粘膜，60%(18/30)的结肠良性腺瘤，100%(13/13)的结肠原位癌和97%(29/30)结肠浸润性腺癌中检出HPV抗原，应用HPV6、11、16、18、31、33、35混合型DNA探针，对上述HPV抗原阳性材料进行分子原位杂交，结果显示：7例HPV抗原阳性的正常肠粘膜，HPVDNA均为阴性；腺瘤组18例HPV抗原阳性者，HPVDNA阳性率为27%(5/18)；原位癌中为69%(9/13)，浸润性癌中为31%(9/29)。经统计学处理，结肠肿瘤与正常粘膜组织之间HPV的阳性率差异有高度显著性(P<0.001)。提出HPV可感染结肠粘膜上皮细胞，HPV感染与结肠肿瘤有着密切的联系，认为HPV感染可能是结肠癌发生的病因之一，同时提出了一种假设，癌基因异常既然已被证实在大肠癌中，那么是否象宫颈癌发生机理一样，HPV感染后通过激活癌基因，参与了从粘膜—腺瘤—恶性改变的进展过程。1991年，Manalo等用电子显微镜在大肠癌癌细胞核内显示有HPV病毒颗粒的存在。1996年，陈建华等[11]采用PCR技术，应用HPV16E6的基因引物，检测17例结直肠癌，13例腺瘤，结果52.9%(9/17)的结肠腺癌和30.8%(4/13)的结肠腺瘤出现HPV16DNA阳性，认为HPV16参与了结直肠腺瘤和腺癌的形成。HPV因感染在癌与腺瘤、部位、分化程度之间差异无显著性(P>0.05)，但他们注意到随着腺癌分化程度的降低，HPV16阳性率呈升高趋势，预示着HPV16感染引起的腺癌恶性程度往往较高。唐金海等[12]应用PCR技术检测21例大肠癌中HPV16、18及c-erbB-2基因，结果：4例(19.05%)HPV16阳性，其中1例为HPV16、18双阳性；6例(28.57%)c-erbB-2基因拷贝数增加，在2例HPV16阳性者同时有c-erbB-2基因拷贝数增加。认为：我国大肠癌组织中存在着HPV感染的现象，部分HPV感染的病例可能同时存在着c-erbB-2基因的扩增。周宇等[13]采用PCR和Southern blot杂交技术检测50例大肠腺癌，38例大肠腺瘤及20例正常大肠组织中HPV16DNA，结果显示：三组病例的阳性率分别为42.0%、31.6%和0，前二者HPV16DNA的阳性率分别显著高于正常粘膜组(P<0.05)，而大肠癌与腺瘤组之间HPV16阳性率差异无显著性(P>0.05)，但HPV16DNA阳性的12例大肠腺瘤均伴有组织异常增生，推测HPV16可能开始作用于癌前病变并在其它因素协同下导致癌前病变逐渐癌变。此外，在4例腺癌病人，在原发癌及转移淋巴结组织中均检到HPV16DNA，表明HPV是大肠癌的病因之一。然而，也有少数报道认为HPV感染与大肠腺癌无关。Kneneth[14]采用PCR方法检测22例结肠癌，无一例有HPVDNA存在，且各地报道的阳性率也不一致，这些差异现认为可能与地区性及研究的方法、探针的类型、标本中HPVsDNA拷贝的高低等因素有关[13]。
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与大肠癌的发生密切相关的抑癌基因除MCC、APC、DCC等外，主要有P53，是定位于17号染色体短臂的肿瘤抑制基因，其在细胞增殖、分化和凋亡中起着关键的作用，由于突变和等位基因缺失使其功能失活在许多肿瘤发生中是十分重要的，大量的研究已证实P53在大肠癌的突变率高达50%～90%，其突变位点多发生于相对保守的第5～8外显子上[15]，腺瘤伴重度不典型性增生为8.7%～69%，轻度异型增生为0～18%。在大肠腺瘤、不典型性增生、大肠癌中，P53的阳性率呈逐渐上升的趋势。段国辰等[16]应用流式细胞术检测8例正常肠粘膜，22例肠腺瘤，28例腺瘤癌变，28例大肠腺癌中P53和ras，结果正常组中P53、ras均为阴性；腺瘤组中ras阳性率为31.82%，P53阳性率为40.91%；腺瘤癌变组中ras阳性率为42.86%，P53阳性率为64.28%；腺癌组中ras阳性率为75.00%，P53阳性率为67.86%。Goh等[17]检测187例结直肠癌，其中55.0%有P53点突变，同时检测了80例癌中P53蛋白，其中76.0%显示P53蛋白阳性表达。而曹江等[18]采用P53反义RNA对人大肠癌细胞株SWN16(内源性突变型P53)观察到其增殖速度显著下降，认为P53反义RNA可能有效地抑制大肠癌细胞的致癌性，提示P53突变在大肠癌发生中和基因治疗中的重要意义。ras基因由K-ras，H-ras和N-ras家族构成，其编码的蛋白质高度相似，分子量均为21KDa，该蛋白在胞浆内合成，经翻译后与类脂结合，然后转移到质膜，位于胞浆膜内面，它具有与鸟氨酸结合的能力及GTP酶活性能将GTP水合成GDP，在正常情况下，大部分P21蛋白与GDP结合后以非激活形式存在，当信号传递通路中的某一蛋白发生改变，GDP改转变为GPT，呈活化态，活化的P21与效应分子相互作用，使GTP失活成GDP。当ras基因发生突变时，P21便一直处于激活状态，最终导致细胞突变。ras基因突变最常见于大肠癌，在大肠癌中转化基因主要为K-ras，其在第12密码子上的G-T转换，40%～65%的大肠癌及中晚期的腺瘤中有ras基因的突变。梁智勇[5]检测30例大肠腺瘤及74例大肠腺癌，P21ras的阳性率分别为53.3%和72.9%，其中31例癌中有ras基因的突变，ras基因的突变被认为在癌变过程中起启动作用并是一个早期事件[19]。这些研究结果均证实了P53、ras基因的异常均参与了人大肠癌的发生过程。然而，在大肠癌及腺瘤中，这两个重要的基因的激活、失活是否与HPV感染有关，在HPV16、18型阳性的大肠腺瘤、大肠腺癌中P53、ras基因的表达协同关系如何，HPV16、18感染在大肠癌发生机制中的机理是否与宫颈癌发生的机理相似，目前国内尚未见这方面的报道。我们受到高危型HPV16、18型感染后，通过影响P53、ras等多个癌基因的功能，协同参与了宫颈癌发生、发展过程的启示，应用HPV16、18E6、P53、ras单克隆抗休，检测正常大肠组织、肠腺癌、大肠癌组织，探讨高危HPV16、18型感染与P53、ras(抑)癌基因协同在大肠癌病因及发生机制中的作用。
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1992年，Cooper等[20]应用地高辛标记的HPV6，11，16，18，31，33，35型探针，检测了38例宫颈腺癌，53%(20/38)腺癌中含有HPVDNA，其中16例为HPV18，4例为HPV16，且其阳性颗粒主要以整合的形式存在。HPV16、18DNA在宫颈腺癌细胞核内的整合现已被较多的研究所证实[21]。HPV16、18型感染人腺上皮后，其病毒基因整合到宿主细胞的基因组中，病毒基因的整合导致其E6、E7基因片段得以持续的转录和表达，HPV16、18致癌的中心环节是其转化蛋白E6、E7与细胞癌基因、抑癌基因相互作用的结果。HPV16E6蛋白单独可转化NIH3T3细胞，反式激活腺病毒E2启动子，点突变的E6ORF(227核苷酸G-A)与活化的ras基因共转染，可转化BRK细胞。E6蛋白致癌的关键是E6与细胞内野生型P53结合形成复合物并在一种E6-AP的辅助下通过酶，促使P53降解，且HPV16、18E6可经插入等方式整合到人染色体某一位点而导致P53基因突变[7,22]，HPV16、18的E6所致的P53灭活(或)突变使得P53对细胞增殖周期相关因子P21WAF1、Cyclins、PCNA、Cdks的调节作用丧失，细胞中DNA损伤累积，造成细胞癌变。而E7蛋白可干扰抑癌蛋白RB与E2F结合导致细胞增殖周期的紊乱，细胞增殖、分裂加速并有恶变倾向。最近的研究还证实E6可通过激活端粒酶而使正常细胞永生化[23]。因而，HPV16、18感染后所致抑癌基因P53的灭活(或)突变可能是大肠腺瘤上皮中、重度不典型性增生发展、大肠腺瘤癌变转化过程中的关键步骤。值得注意的是，传统的观点认为：P53基因突变是肿瘤晚期阶段发生的事件。但我们检测53例大肠癌及10例腺瘤恶变组，二者P53阳性表达差异无显著性并且HPV16、18E6与P53的阳性表达均具显著相关性，在大肠腺瘤，随着上皮伴不典型性增生程度的加重，E6、P53的阳性率呈逐渐升高的趋势。因而，我们认为在高危HPV16、18感染因素下P53突变及表达可发生在大肠癌的早期阶段，尤其在腺瘤癌变过程中起重要的作用。余心如检测34例大肠腺瘤早期癌变材料，P53蛋白的阳性率为50%，其中5例同时在腺瘤区有P53阳性表达，认为P53的检测对判断腺瘤有无恶变具有重要的参考价值，是腺瘤细胞进入癌变的分子信号。国内朱有法等[23]的研究也提出P53突变发生在大肠癌形成早期阶段。此外，HPV16、18的E6、E7的致癌作用需在活化的癌基因协同下进行，HPV16的E7能激活ras癌基因，HPV16、18DNA的整合多位于c-myc基因的附件，从而导致c-myc的局部扩增和高表达。研究证实，HPV16、18的E6、E7永生化小鼠原始肾细胞的能力需在活化的ras、c-myc的协同下进行且活化的ras基因能与E6、E7及突变的P53基因协同转化原代细胞[7,24]。因而，HPV16、18型感染后所致ras基因的激活、P53抑癌基因的失活(或)突变，协同可能涉及了HPV16、18感染后大肠粘膜柱状上皮细胞癌变的发生机理。
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3 大肠癌前病变及癌中HPV16、18E6，P53，ras检测的意义
大肠癌的发生是一个缓慢的发展过程，从病理组织学上经历息肉形成，腺瘤形成，最后发展为癌。既然在大肠癌形成的前期存在高危HPV16、18型的感染并可通过激活或灭活ras、P53(抑)癌基因而涉及了大肠癌的发生过程，那么在大肠腺瘤阶段的HPV感染及基因变异是否意味着其具有使腺上皮向中、重度不典型性增生及癌变发展的趋势，在此期间检测HPV16、18E6及P53、ras基因变异作为早期诊断的依据对于大肠癌的早期防治是十分有意义的。我们检测了53例大肠癌，10例腺瘤恶变，30例大肠腺瘤和30例正常大肠组织，结果证实在腺癌，腺瘤恶变，腺瘤组中HPV16、18E6，P53，P21ras的阳性表达分别为54.7%(29/53)、62.2%(33/53)，71.7%(38/53)，60.0%(6/10)、60.0%(6/10)、70.0%(7/10)和36.7%(11/30)、33.3%(10/30)、40.0%(12/30)，而正常组均呈阴性表达且三组材料中E6与P53，E6与P21ras的阳性表达均具显著相关性。此外，在研究中我们注意到，从随着大肠腺瘤伴不典型性增生的加重以及在腺瘤恶变、大肠癌中，HPV16、18E6，P53，P21ras的阳性率呈逐渐升高的趋势，表明在不典型性增生病变中HPV16、18感染同时细胞内抑癌基因P53的灭活(或)突变程度以及ras基因的激活程序已启动，这或许可作为病变向癌变发展早期预测的形态学和免疫学指标，这将有助于早期筛选高危人群，及时阻断高危型HPV感染—癌基因激活、抑癌基因失活(或)突变—上皮不典型性增生—癌的发展顺序以及为今后开展基因治疗提供了科学的依据。
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综上所述，分子生物学和免疫组化技术均证实了HPV16、18型感染，P53、ras基因表达在大肠癌及癌前病变组织中的存在，表明高危HPV16、18感染后通过影响P53基因的负调控功能并与活化的ras癌基因协同，在大肠癌的病理发生机制中可能起到十分关键的作用。随着人们对高危HPV感染后多个癌基因激活，协同在大肠癌发生机理中的深入研究，将为大肠癌的早期防治、开展免疫治疗和基因治疗，提高大肠癌术后生存率提供有效的帮助。■
参考文献：
[1]郑芝田.胃肠病学.第2版.北京：人民卫生出版社，1993：711
[2]李世荣.开展群众性普查工作提高大肠癌早诊水平.中国肿瘤，1997；6(3)：20
[3]俞顺章.我国肿瘤的一级预防.中国肿瘤，1997；6(1)：6
, 百拇医药
[4]Kirgan D, Manalo P, Hall M, et al. Association of human papillomavirus and colon neoplasms. Arch Sury，1990；125：862
[5]梁智勇，柳风轩，罗光辉，等.大肠腺瘤与腺癌P21，P53，P185蛋白表达及ras，P53基因突变的检测.中华病理学杂志，1995；24(6)：352
[6]Herrington CS. Human papillomaviruses and cervical neoplasia. I. Classification, virology, pathology and epidemiology. J Clin Pathol，1994；47：1066
[7]Herrington CS. Human papillomaviruses and cervical neoplasia. II. Interation of HPV with other factors. J Clin Pathol，1995；48(1)：1
, 百拇医药
[8]Arends MJ, Buckley CH, Wells M. Aetiology, pathogenesis, and pathology of cervical neoplasia. J Clin Pathol，1998；51：96
[9]金叶，陈涤瑕.人乳头瘤病毒与妇女生殖道肿瘤.国外医学(妇产科分册)，1993；20(5)：271
[10]Wilczynski SP, Walker J, Liao SY, et al. Adenocarcinoma of the cervix associated with human papillomavirus. Cancer，1998；62：1331
[11]陈建华，于皆平，沈志祥.HPV与人结直肠的关系.胃肠病学和肝病学杂志，1996；5(1)：45
[12]唐金海，王亚平，周建农，等.大肠癌组织中HPV和c-erbB-2基因的检测及其关系研究.中华实验外科杂志，1998；15(4)：296
, 百拇医药
[13]周宇，于皆平，沈祥志，等.HPV16型DNA在大肠腺癌组织中表达的研究.中国肿瘤临床，1998；25(7)：505
[14]战忠利，王平善，张连郁，等.结肠癌与人乳头状瘤病毒相关性研究.中华肿瘤杂志，1998；20(5)：393
[15]孙延平，曹雪涛.胃肠道肿瘤的基因治疗研究进展.国外医学(肿瘤学分册)，1996；23(1)：60
[16]段国辰，武锡辰，左连富.大肠肿瘤癌基因蛋白产物的定量研究.肿瘤，1997；17(4)：221
[17]Goh HS, Chan CS, Khine K, et al. P53 and behaviour of colorectal cancer. Lancet，1994；344(8917)：233
, 百拇医药
[18]曹江，滕理送，蔡心涵，等.P53反义RNA对癌细胞恶性表型的抑制作用.中华肿瘤杂志，1997；19(2)：123
[19]朱人敏，张予蜀.ras癌基因和大肠癌关系的研究.江苏医药，1997；23(2)：103
[20]Cooper K, Herrington CS, Lo ES-F, et al. Integration of human papillomavirus type 16 and 18 in cervical adenocarcinoma. J Clin Pathol，1992；45：382
[21]Cooper K, Mc Gee JO'D. Human papillomavirus, integration and cervical carcinogenesis: a clinicopathological perspective. J Clin Pathol，1997；50：1
, 百拇医药
[22]笪冀平，胡益云，陈乐真，等.肺癌人乳头瘤病毒感染与P53基因突变的研究.中华肿瘤杂志，1996；18(1)：27
[23]朱有法，朱景旭，许敬尧，等.大肠腺瘤不典型性增生及癌变组织中P53基因的表达及意义.中华病理学杂志，1996；25(5)：306
[24]陈华波，于修平.人乳头瘤病毒E6及E7蛋白研究进展.国外医学(微生物学分册)，1998；21(5)：11
收稿日期：1999-08-10
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