大鼠肝癌模型CBRH-3的复制及应用
作者：臧宏 方庆安 梅广林 朱建伟 孙永强
单位：南通医学院附属医院普外科，南通226001
关键词：肝细胞肝癌；肝癌模型；大鼠
南通医学院学报000123 [摘 要] 目的：探讨大鼠肝移植性肿瘤CBRH-3模型的复制及应用。方法：选择断奶5天的雄性Wistar大鼠应用开腹肝癌组织埋藏植入法复制CBRH-3肝癌大鼠模型。结果：50只大鼠中移植成功46只(92%)。无1例手术死亡。结论：CBRH-3肝癌模型有良好的可比性，适用于多指标动态观察，是肝癌病理基础研究、药物筛选及实验治疗等研究中有价值的模型。
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)01-0049-02
, 百拇医药
THE REPLICATION AND USAGE OF RAT HEPATOMA MODEL
ZANG Hong FANG Qingan MEI Guanglin ZHU Jianwei SUN Yongqiang
(The Affiliated Hospital of Nantong Medical College,Nantong226001)
[Abstract] Objectives: To evaluate the replication and usage of CBRH-3 rat hepatoma model by transplantation . Methods:Repliated the CBRH-3 rat hepatoma model by hepatoma tissues implantation on male Wistar rat which had weaned 5 days . Results: The method is very simple and available . The rate of success of the method is at a height of 92%(46/50) and not one death because of operation. Conclusions: There is good comparatibility about CBRH-3 rat hepatoma model . It suits to multi-index dynamic.Observation and is a valuable model for hepatoma pathologic fundamental research, drug screening and experimental therapy.
, 百拇医药
[Key words] hepatocellular carcinoma;hephtoma model;rats
肝癌动物模型是肝癌病理基础研究、药物筛选及实验治疗等研究工作中的重要材料。目前，在实验性肿瘤研究中应用最为广泛的肝癌动物模型是鼠类肝癌模型，其中更为人们所重视的是诱发性和移植性肝癌以及裸鼠肝癌模型[1]。关于移植型大鼠肝癌模型国内有2种，一种为CBRH-2，另一种为CBRH-3，后者较前者的建立更快稳定[2]。我们已成功复制了大鼠CBRH-3肝癌模型，并进行治疗，取得了较满意的结果。本文报道该模型的复制过程及其有关的生物学特征。
1 材料和方法
1.1 实验动物 (1)健康雄性WISTAR大鼠，刚断奶5天，体重约50克，共50只。由上海实验动物饲养中心购得，均在标准条件下分笼喂养。(2)肝癌种鼠(已移植成功7天)由中国科学院上海细胞生物研究所谢弘、强家模教授惠赠。
, 百拇医药
1.2 模型复制方法 将移植成活后第7天的肝癌种鼠用乙醚麻醉后，无菌条件下剖腹探查，发现腹腔肠系膜上有块状肿瘤组织。挑选一生长良好的乳白色癌瘤结节，在含有青霉素(100mg/ml),链霉素(200Iu/ml)的Hank`s液中浸泡漂洗2次。除去正常组织，切取生长良好无坏死出血的肿瘤组织，用眼科剪刀剪切成约1mm×1mm×2mm之块状。然后选刚断奶5天的雄性Wistar大鼠先行乙醚麻醉，先将其置于一密闭透明的玻璃容器内。容器内放置浸有乙醚溶液的棉球，待其不能站立，呼吸由浅快变缓慢时即刻取出。取出后将其仰卧固定四肢于操作台上，用棉签清洁呼吸道，将舌头牵出固定于一边防舌根后坠，为使麻醉持续安全，选择一比大鼠口鼻直径稍大的离心管套住其口鼻，离心管内亦放置浸有乙醚的棉球，使其持续少量吸入，根据呼吸心跳情况调节离心管与口鼻之间的距离。腹正中切口，显露出肝左叶，用尖头镊子戳一小孔，压迫片刻无出血后将剪切好的小块肿瘤组织再在Hank`s液中漂洗后埋植于其中，查无活动性出血后关腹。术前禁食12h，术后禁食12h，饲以10%的葡萄糖水，1天后自由进食[3]。
, 百拇医药
1.3 观察指标 (1)所有荷瘤大鼠在不同阶段再进腹观察肿瘤大小，腹水量和性质，转移和局部浸润情况。(2)AFP定性分析：以长有肝癌的大鼠的血清(摘眼球取血约2ml，离心3000r/min，10min后得血清)为待测样品，在用巴比妥缓冲液(0.05mmol/L，pH8.6)配成的1%琼脂糖凝胶板内作AFP免疫电泳定性分析，先将待测血清滴在左侧样品孔内，在巴比妥缓冲液内电泳，待样品移动到一定位置时关闭电源，然后在中间槽内加入兔抗大鼠AFP抗体，放置在一定湿度的容器内，室温下自然扩散过夜，次日可见抗原—抗体结合的沉淀线，用PBS(0.05mmol/L，pH7.0)漂洗多次，以洗去未结合的蛋白，减少背景染色，最后用Connussoe BlueR-250染色[4]。
1.4 细胞形态观察 光镜观察：大鼠肝癌组织以10%福尔马林液固定，石蜡包埋切成10μm的切片，常规苏木素、伊红染色。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 CBRH—3肝癌在大鼠体内自然生长情况 本组46只大鼠肿瘤肝脏移植后生长良好，成活率92%。分批解剖后见肿瘤移植后第4天于肝脏移植部位即有乳白色瘤结节形成。第5天即增殖为移植时1.5倍左右大小。第7天上腹部可扪及包块，肝脏明显肿大，剑突与肝脏浸润严重，腹腔内有少量淡黄色腹水。第9天肿瘤即突破肝包膜向腹膜转移，与胃、脾十二指肠大网膜粘连，肝脏其它部位有转移灶，腹水量增多，且转为血性。第11天腹膜、大网膜和腹腔脏器可见广泛串珠状转移，腹水量进一步增多并开始有大鼠死亡，肿瘤平均直径约1.32±0.25cm。
2.2 AFP定性检测 用免疫电泳方法检测载瘤动物血清的AFP均为阳性。
2.3 细胞形态观察 移植后的癌细胞呈上皮样条索状排列，细胞体积增大核呈异形或圆形、椭圆形，细胞核、浆比例增大，浸润明显部位癌细胞有坏死崩解，在肝内其它部位亦可见癌细胞分布。
3 讨 论
, 百拇医药
3.1 鼠类肝癌模型的选择 尽管国内外已建立了许多不同类型的动物肝癌模型，应用最广的鼠类肝癌模型，其中更为人们所重视的是诱发性和移植性肝癌以及裸鼠肝癌模型[1]。裸鼠人肝癌模型在肿瘤细胞形态、功能和生物学特性上都更接近于人体肝癌，移植性肝癌是通过肝癌组织肝内接种后造成接种局部生长出肝癌。鼠类肝癌模型的选择与所需研究的方向有关，各有其优缺点。移植性肝癌其复制方法简便易行,较诱发性肝癌周期短,可在短期内复制大批模型，而且严格掌握了肿瘤植入量,使个体间更具有可比性,较裸鼠肝癌模型代价低,可适用多方面研究,为很多学者采用。郭亚军等[3]应用移植型肝癌模型进行了正常大鼠不同发育阶段和荷瘤大鼠发展过程中T细胞亚群变化取得满意效果。陈道达等[2]也是通过移植性肝肿瘤模型进行术后药物治疗的研究。
3.2 鼠种的选择 由于模型和实验手段限制，长期以来大多数研究均在小鼠体内进行。我们认为小鼠模型生存期短，死亡率高，特别是小鼠肿瘤体积小，取材困难，无法满足连续动态研究中血和组织标本的需要，只能进行单项指标短期观察。关于大鼠肝癌模型其生存能力较小鼠肝癌模型有更强的耐受性，生存期长，带瘤自然生存期可达14天，死亡率低。尤其是可以多次取血和肿瘤组织，取血可采用经大鼠尾静脉采血和摘眼球采用，每次采血量较小鼠多，可达2ml甚至更多。其中，以摘眼球采血较好，尾静脉采血每次采血较困难，易凝固，采血量较摘眼球少。我们在同一动物模型取血最多达8次以上，绝大多数荷瘤状态下可进行2次以上剖腹取材手术，术后存活良好，可满足反复取材多指标动态研究。
, 百拇医药
3.3 移植性肝癌模型复制方法 国内报道有两种[5]，上海周金熙等采用肝内接种法。我们采用开腹直视下肝脏打洞肝组织埋藏法，因刚断奶1周的大鼠肝脏较薄，厚度约3～5mm，且分叶较多，体外直接穿刺不易定位，易刺穿肝组织而变为腹腔接种，开腹接种可做到准确可靠，即使有出血，只需用棉签压迫片刻，必要时可用明胶海绵压迫后即可止住。
3.4 大鼠CBRH-3肝癌模型生物学特征 病理鉴定为肝细胞性肝癌，AFP表达阳性，其染色体数为42条，与正常大鼠细胞染色体数相同，对其细胞染色体核型分析表明，其核型在传代过程中已有变化，但仍未发现经常存在的标记染色体，有待于我们今后对其不断追踪研究。
[参考文献]
[1] 马曾辰.可供临床研究常用鼠肝癌模型[J].国外医学肿瘤学分册，1982;9(1)∶13.
[2] 强家模，叶 红，谢 弘，等.大鼠肝癌模型CBRH—3的建立及其生物学特性[J].动物学报，1996;42(2)∶166.
, 百拇医药
[3] 陈道达，张建平，陈先祥，等.羟基磷灰石—阿霉素复合物对大鼠肝移植性肿瘤局部切除术后治疗作用的研究[J].中华普通外科杂志1999；14(3)∶179.
[4] 郭亚军，吴孟超，等.大鼠BERH—2肝癌模型的复制及其在肿瘤免疫学研究中的应用[J].中华实验外科杂志1989；6(1)∶6.
[5] Kahan BD,etal. Specific chemoimmunotherpy in tumor_bearing mice with extracted tumor-specific transplantation anti-gens and cyclophosphosphamide.[J]. JNCI，1984;73∶943.
[6] 周金熙，等.肝内接种BERH—2肝癌的大鼠胆汁蛋白质排泄的变化[J].中华肿瘤杂志1986；8(6)∶409.
(1999-11-10收稿), 百拇医药
单位：南通医学院附属医院普外科，南通226001
关键词：肝细胞肝癌；肝癌模型；大鼠
南通医学院学报000123 [摘 要] 目的：探讨大鼠肝移植性肿瘤CBRH-3模型的复制及应用。方法：选择断奶5天的雄性Wistar大鼠应用开腹肝癌组织埋藏植入法复制CBRH-3肝癌大鼠模型。结果：50只大鼠中移植成功46只(92%)。无1例手术死亡。结论：CBRH-3肝癌模型有良好的可比性，适用于多指标动态观察，是肝癌病理基础研究、药物筛选及实验治疗等研究中有价值的模型。
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)01-0049-02
, 百拇医药
THE REPLICATION AND USAGE OF RAT HEPATOMA MODEL
ZANG Hong FANG Qingan MEI Guanglin ZHU Jianwei SUN Yongqiang
(The Affiliated Hospital of Nantong Medical College,Nantong226001)
[Abstract] Objectives: To evaluate the replication and usage of CBRH-3 rat hepatoma model by transplantation . Methods:Repliated the CBRH-3 rat hepatoma model by hepatoma tissues implantation on male Wistar rat which had weaned 5 days . Results: The method is very simple and available . The rate of success of the method is at a height of 92%(46/50) and not one death because of operation. Conclusions: There is good comparatibility about CBRH-3 rat hepatoma model . It suits to multi-index dynamic.Observation and is a valuable model for hepatoma pathologic fundamental research, drug screening and experimental therapy.
, 百拇医药
[Key words] hepatocellular carcinoma;hephtoma model;rats
肝癌动物模型是肝癌病理基础研究、药物筛选及实验治疗等研究工作中的重要材料。目前，在实验性肿瘤研究中应用最为广泛的肝癌动物模型是鼠类肝癌模型，其中更为人们所重视的是诱发性和移植性肝癌以及裸鼠肝癌模型[1]。关于移植型大鼠肝癌模型国内有2种，一种为CBRH-2，另一种为CBRH-3，后者较前者的建立更快稳定[2]。我们已成功复制了大鼠CBRH-3肝癌模型，并进行治疗，取得了较满意的结果。本文报道该模型的复制过程及其有关的生物学特征。
1 材料和方法
1.1 实验动物 (1)健康雄性WISTAR大鼠，刚断奶5天，体重约50克，共50只。由上海实验动物饲养中心购得，均在标准条件下分笼喂养。(2)肝癌种鼠(已移植成功7天)由中国科学院上海细胞生物研究所谢弘、强家模教授惠赠。
, 百拇医药
1.2 模型复制方法 将移植成活后第7天的肝癌种鼠用乙醚麻醉后，无菌条件下剖腹探查，发现腹腔肠系膜上有块状肿瘤组织。挑选一生长良好的乳白色癌瘤结节，在含有青霉素(100mg/ml),链霉素(200Iu/ml)的Hank`s液中浸泡漂洗2次。除去正常组织，切取生长良好无坏死出血的肿瘤组织，用眼科剪刀剪切成约1mm×1mm×2mm之块状。然后选刚断奶5天的雄性Wistar大鼠先行乙醚麻醉，先将其置于一密闭透明的玻璃容器内。容器内放置浸有乙醚溶液的棉球，待其不能站立，呼吸由浅快变缓慢时即刻取出。取出后将其仰卧固定四肢于操作台上，用棉签清洁呼吸道，将舌头牵出固定于一边防舌根后坠，为使麻醉持续安全，选择一比大鼠口鼻直径稍大的离心管套住其口鼻，离心管内亦放置浸有乙醚的棉球，使其持续少量吸入，根据呼吸心跳情况调节离心管与口鼻之间的距离。腹正中切口，显露出肝左叶，用尖头镊子戳一小孔，压迫片刻无出血后将剪切好的小块肿瘤组织再在Hank`s液中漂洗后埋植于其中，查无活动性出血后关腹。术前禁食12h，术后禁食12h，饲以10%的葡萄糖水，1天后自由进食[3]。
, 百拇医药
1.3 观察指标 (1)所有荷瘤大鼠在不同阶段再进腹观察肿瘤大小，腹水量和性质，转移和局部浸润情况。(2)AFP定性分析：以长有肝癌的大鼠的血清(摘眼球取血约2ml，离心3000r/min，10min后得血清)为待测样品，在用巴比妥缓冲液(0.05mmol/L，pH8.6)配成的1%琼脂糖凝胶板内作AFP免疫电泳定性分析，先将待测血清滴在左侧样品孔内，在巴比妥缓冲液内电泳，待样品移动到一定位置时关闭电源，然后在中间槽内加入兔抗大鼠AFP抗体，放置在一定湿度的容器内，室温下自然扩散过夜，次日可见抗原—抗体结合的沉淀线，用PBS(0.05mmol/L，pH7.0)漂洗多次，以洗去未结合的蛋白，减少背景染色，最后用Connussoe BlueR-250染色[4]。
1.4 细胞形态观察 光镜观察：大鼠肝癌组织以10%福尔马林液固定，石蜡包埋切成10μm的切片，常规苏木素、伊红染色。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 CBRH—3肝癌在大鼠体内自然生长情况 本组46只大鼠肿瘤肝脏移植后生长良好，成活率92%。分批解剖后见肿瘤移植后第4天于肝脏移植部位即有乳白色瘤结节形成。第5天即增殖为移植时1.5倍左右大小。第7天上腹部可扪及包块，肝脏明显肿大，剑突与肝脏浸润严重，腹腔内有少量淡黄色腹水。第9天肿瘤即突破肝包膜向腹膜转移，与胃、脾十二指肠大网膜粘连，肝脏其它部位有转移灶，腹水量增多，且转为血性。第11天腹膜、大网膜和腹腔脏器可见广泛串珠状转移，腹水量进一步增多并开始有大鼠死亡，肿瘤平均直径约1.32±0.25cm。
2.2 AFP定性检测 用免疫电泳方法检测载瘤动物血清的AFP均为阳性。
2.3 细胞形态观察 移植后的癌细胞呈上皮样条索状排列，细胞体积增大核呈异形或圆形、椭圆形，细胞核、浆比例增大，浸润明显部位癌细胞有坏死崩解，在肝内其它部位亦可见癌细胞分布。
3 讨 论
, 百拇医药
3.1 鼠类肝癌模型的选择 尽管国内外已建立了许多不同类型的动物肝癌模型，应用最广的鼠类肝癌模型，其中更为人们所重视的是诱发性和移植性肝癌以及裸鼠肝癌模型[1]。裸鼠人肝癌模型在肿瘤细胞形态、功能和生物学特性上都更接近于人体肝癌，移植性肝癌是通过肝癌组织肝内接种后造成接种局部生长出肝癌。鼠类肝癌模型的选择与所需研究的方向有关，各有其优缺点。移植性肝癌其复制方法简便易行,较诱发性肝癌周期短,可在短期内复制大批模型，而且严格掌握了肿瘤植入量,使个体间更具有可比性,较裸鼠肝癌模型代价低,可适用多方面研究,为很多学者采用。郭亚军等[3]应用移植型肝癌模型进行了正常大鼠不同发育阶段和荷瘤大鼠发展过程中T细胞亚群变化取得满意效果。陈道达等[2]也是通过移植性肝肿瘤模型进行术后药物治疗的研究。
3.2 鼠种的选择 由于模型和实验手段限制，长期以来大多数研究均在小鼠体内进行。我们认为小鼠模型生存期短，死亡率高，特别是小鼠肿瘤体积小，取材困难，无法满足连续动态研究中血和组织标本的需要，只能进行单项指标短期观察。关于大鼠肝癌模型其生存能力较小鼠肝癌模型有更强的耐受性，生存期长，带瘤自然生存期可达14天，死亡率低。尤其是可以多次取血和肿瘤组织，取血可采用经大鼠尾静脉采血和摘眼球采用，每次采血量较小鼠多，可达2ml甚至更多。其中，以摘眼球采血较好，尾静脉采血每次采血较困难，易凝固，采血量较摘眼球少。我们在同一动物模型取血最多达8次以上，绝大多数荷瘤状态下可进行2次以上剖腹取材手术，术后存活良好，可满足反复取材多指标动态研究。
, 百拇医药
3.3 移植性肝癌模型复制方法 国内报道有两种[5]，上海周金熙等采用肝内接种法。我们采用开腹直视下肝脏打洞肝组织埋藏法，因刚断奶1周的大鼠肝脏较薄，厚度约3～5mm，且分叶较多，体外直接穿刺不易定位，易刺穿肝组织而变为腹腔接种，开腹接种可做到准确可靠，即使有出血，只需用棉签压迫片刻，必要时可用明胶海绵压迫后即可止住。
3.4 大鼠CBRH-3肝癌模型生物学特征 病理鉴定为肝细胞性肝癌，AFP表达阳性，其染色体数为42条，与正常大鼠细胞染色体数相同，对其细胞染色体核型分析表明，其核型在传代过程中已有变化，但仍未发现经常存在的标记染色体，有待于我们今后对其不断追踪研究。
[参考文献]
[1] 马曾辰.可供临床研究常用鼠肝癌模型[J].国外医学肿瘤学分册，1982;9(1)∶13.
[2] 强家模，叶 红，谢 弘，等.大鼠肝癌模型CBRH—3的建立及其生物学特性[J].动物学报，1996;42(2)∶166.
, 百拇医药
[3] 陈道达，张建平，陈先祥，等.羟基磷灰石—阿霉素复合物对大鼠肝移植性肿瘤局部切除术后治疗作用的研究[J].中华普通外科杂志1999；14(3)∶179.
[4] 郭亚军，吴孟超，等.大鼠BERH—2肝癌模型的复制及其在肿瘤免疫学研究中的应用[J].中华实验外科杂志1989；6(1)∶6.
[5] Kahan BD,etal. Specific chemoimmunotherpy in tumor_bearing mice with extracted tumor-specific transplantation anti-gens and cyclophosphosphamide.[J]. JNCI，1984;73∶943.
[6] 周金熙，等.肝内接种BERH—2肝癌的大鼠胆汁蛋白质排泄的变化[J].中华肿瘤杂志1986；8(6)∶409.
(1999-11-10收稿), 百拇医药