新型氨基甾体对小鼠粒单白血病动物模型的作用
作者：那晓东 何群 蒋德昭
单位：那晓东(血液生理研究室 长沙 410078)；何群(血液生理研究室 长沙 410078)；蒋德昭(血液生理研究室 长沙 410078)
关键词：甾类；白血病；骨髓单核细胞性；急性；疾病模型；动物；小鼠
湖南医科大学学报000104 摘 要：应用不同剂量的新型氨基甾体处理小鼠急性粒-单核细胞性白血病动物模型，测定外周血白细胞计数及分类、骨髓未分化细胞百分率及脾重的变化。结果表明：新型氨基甾体能明显降低小鼠粒单白血病动物模型的上述指标(P<0.01)，且随着药物剂量的加大，后者明显降低(P<0.01)。提示新型氨基甾体对小鼠粒单白血病动物模型具有治疗作用，加大剂量可提高治疗效果。
分类号：R733 文献标识码：A
文章编号：1000-5625(2000)01-0012-03
, http://www.100md.com
Effect of a novel aminosteroid on animal model of
murine myelom onocytic leukemia
NA Xiao-dong, HE Qun, JIANG De-zhao
(Department of Physiology, Hunan Medical University Changsha 410078)
Abstract：To evaluate the effect of a novel aminosteroid on m urine myelomonocytic leukemia, BALB/c mice were treated by the novel aminosteroid for 7 days after receiving 1×106 WEHI-3B(myelomonocytic leukemia) cells in traperitoneally. The counts and classification of white blood cells obtained fro m tail blood were determined on the day before transplanting WEHI-3B cells and 7 ,14,21,28 days after transplantation. Undifferentiated cell percentage of bone m arrow and spleen weight were checked 30 days after transplantation. The results demonstrated that the above indexes of mice treated with the novel aminosteroid were decreased compared with those treated with normal saline(NS). Decrease of t he indexes showed a dose-dependent relationship ranging from 5～20mg.kg -1.d-1. It is suggested that leukemia mice could be effectively treated by the novel aminosteroid and the efficacy maybe paralleled with the dosage of the novel aminosteroid.
, 百拇医药
Key words：steroids;leukemia,myelomonocytic;disease model,animal;drug effects;mice▲
WEHI-3B是小鼠急性粒单核细胞性(粒单)白血病 细胞系。将体外培养扩增的WEHI-3B细胞经腹腔注射接种于BALB/C小鼠体内能诱导移植性粒 单白血病发生[1]。小鼠粒单白血病动物模型表现为：接种白血病细胞后第10～15 d发病；外周血白细胞计数及粒细胞(粒)、单核细胞百分率升高并出现未成熟的粒、单核 细胞；骨髓未分化细胞百分率升高；脾脏肿大[1]。由于白血病的各种并发症小鼠 可突发死亡。本研究通过观察经新型氨基甾体处理的小鼠粒单白血病动物模型各指标的变化 ，探索新型氨基甾体对粒单白血病的实验性治疗作用。该新型氨基甾体系体内甾体激素的衍 生物，采用化学方法人工合成。该化合物对造血系统的生物学活性尚未见文献报道。
1 材料与方法
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1.1 材料 8周龄体重18～22g的BALB/C小鼠60只，雌雄各半，由本校实 验动物部提供；小鼠粒单白血病细胞系WEHI-3B，由北京军事医科院引进；新生小牛血清批 号为970320，购自杭州四季青生物工程制品研究所；DMEM及Ara-C购自美国Sigma公司；新 型氨基甾体由本室何群博士提供；二氧化碳培养箱产自日本；普通光学显微镜系日本Olympu s公司产；电子天平产自美国Sigma公司；低温离心机系美国Beckman公司产。
1.2 方法
1.2.1 白血病模型的建立 将体外培养增殖的小鼠粒单白血病细胞系WEHI-3B经 腹腔注射入BALB/C小鼠体内，细胞数为每只动物106个[2，3]。
1.2.2 实验分组 将60只BALB/C小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半 。对照组给生理盐水每只0.2ml。实验组分别给予：Ara-c 20mg.kg-1.d -1，新型氨基甾体(KH)5mg.kg-1.d-1，10mg.kg-1.d-1 ，15mg.kg-1.d-1和20mg.kg-1.d-1，灌胃给药，连续 7d。
, 百拇医药
1.3 检测指标
1.3.1 外周血白细胞计数及分类 分别于接种白血病细胞前及接种后第7，14，21 ，28d经尾静脉取外周血进行白细胞计数及分类。
1.3.2 骨髓未分化细胞百分率 于接种白血病细胞后第30d处死所有动 物，取股骨骨髓细胞涂片，计数骨髓中未分化细胞百分率。
1.3.3 脾重 于接种白血病细胞后第30d取脾脏称取其湿重。
1.4 统计学处理 实验结果以
±s表示；各组间比较用F检 验；两两比较用q检验；率的比较采用χ2检验。P<0.05示差异有显著性。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 动物模型的建立 BALB/C小鼠接种WEHI-3B细胞后第7d外周血白细 胞计数及粒、单细胞百分率明显升高，接种后第7～14d发病，外周血中出现未成熟粒、单 核细胞(表1)，腹部肿大，脾重明显大于正常小鼠，骨髓中未分化细胞百分率较正常小鼠明 显升高。上述表现符合粒单白血病动物模型的指标，故视为该疾病模型已建立。
表1 对照组小鼠接种WEHI-3B细胞后外周 血未成熟粒、单核细胞百分率(n=10,±s)
第7d
第14d
第21d
第28d
未成熟粒细胞(%)
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2.25±0.59
6.41±0.58
9.81±0.45
11.35±0.81
未成熟单核细胞(%)
5.75±0.48
9.41±0.95
6.69±0.62
14.88±0.51
2.2 新型氨基甾体对接种后小鼠外周血白细胞计数及分类的影响 对照组 小鼠接种后第7d外周血白细胞计数及粒、单核细胞百分率明显升高，并随着接种时间的延 长而进行性上升，外周血中出现未成熟粒、单核细胞。各实验组小鼠接种后第7d外周血白 细胞计数及粒、单核细胞百分率较接种前有所升高，但明显低于对照组(P<0.01)，且不 随接种时间的延长而继续上升，外周血中未见成熟粒、单核细胞出现；随药物剂量的加大， 外周血白细胞计数及粒、单核细胞百分率降低(表2，图1，2)。
, 百拇医药
图1 KH对外周血粒细胞百分率的影响
与对照组比①P<0.01
Fig. 1 Effect of KH on the periphera l granunocyte percentage after transplantation
图2 KH对外周血单核细胞百分率的影响与对照组比①P<0.01
Fig. 2 Effect of KH on the peripheral mon ocyte percentage after transplantation
表2 各组小鼠接种后外周血中白细 胞计数(×109.L-1)的变化(n=10，±s) 分组
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第7d
第14d
第21 d
第28d
对照组
25.75±1.91
33.69±1.85
50.84±4 .53
101.0±4.44
Ara-C(20mg.kg-1.d-1)
, 百拇医药
16.10±1.20①
16. 28±0.90①
16.35±0.50①
15.75±1.67①
KH(20mg.kg-1.d-1)
13.46±0.73①②
11.30±1 .20①②
10.70±1.90①②
, 百拇医药
11.10±1.14①②
KH(15mg.kg-1.d-1)
17.63±0.91①
12.13±0 .80①
15.00±1.90①
15.00±1.10①
KH(10mg.kg-1.d-1)
, 百拇医药
18.00±0.90①
18.13±0 .95①
19.00±1.90①
18.75±1.32①
KH(5mg.kg-1.d-1)
17.80±1.62①
18.00±1. 20①
17.80±1.40①
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18.70±1.30①
①与对照组比P<0.01；②与20mg.kg-1.d-1Ara-C组相比P <0.05
2.3 新型氨基甾体对接种后小鼠骨髓中未分化细胞百分率的 影响 各实验组小鼠接种后第30d骨髓中未分化细胞百分率明显低于对照组(P< 0.01)(表3)。
表3 各组小鼠接种后第30d骨髓未分化 细胞百分率(%)(n=10,±s) 分组
未分化细胞(%)
对照组
, 百拇医药
65.0±8.70
Ara-C(20mg.kg-1.d-1
32.6±4.04①
KH(20mg.kg-1.d-1
6.8±1.80①②
KH(15mg.kg-1.d-1
, 百拇医药
32.8±3.30①
KH(10mg.kg-1.d-1
32.8±5.60①
KH(5mg.kg-1.d-1
40.6±3.60①
①与对照组比P<0.01；②与20mg.kg-1.d-1Ara-C组相比P <0.05
, 百拇医药
2.4 新型氨基甾体对接种后小鼠脾重的影响 各实验组小鼠接种后第30 d脾重明显低于对照组(P<0.01)(表4)。 表4 各组小鼠接种WEHI-3B细胞后第3 0d脾重(n=10,±s) 分组
脾重(g)
对照组
1.13±0.19
Ara-C(20mg.kg-1.d-1)
0.37±0.09①
KH(20mg.kg-1.d-1)
, 百拇医药
0.20±0.03①②
KH(15mg.kg-1.d-1)
0.24±0.02①
KH(10mg.kg-1.d-1)
0.57±0.02①
KH(5mg.kg-1.d-1)
, 百拇医药
0.58±0.05①
①与对照组相比P<0.01；②与20mg.kg-1.d-1Ara-C组相比P <0.05
3 讨 论
传统的白血病治疗药物以细胞毒药物为主。细胞毒药物在杀伤恶性细胞的同时，对正常的细 胞和器官也产生严重损伤。近年研究发现，白血病细胞在体外可被不同的化学物质诱导分化 为正常或较正常的细胞；分化诱导剂的发现是白血病治疗药物发展的新阶段。
本实验采用的BALB/C小鼠粒单白血病模型系由澳大利亚学者Noel L.Warner等于1969年建 成。该模型通过腹腔注射小鼠粒单白血病细胞系WEHI-3B产生移植性粒单白血病。其特 点有：外周血白细胞计数显著升高，粒、单核细胞百分率升高并出现未成熟和异常的粒、单 核细胞，骨髓中出现大量未分化细胞，脾脏肿大，绿色腹水，腹腔及皮下可出现实质性肿块 ，小鼠发病后可能由于白血病的各种并发症而突然死亡。由于白血病小鼠并发症的发生及生 存时间具有不均一性，故本实验未将生存时间作为观察指标。本实验在小鼠接种白血病细胞 后即开始给药，乃因白血病小鼠具有上述特点；若在小鼠发病后再行给药，将不便于观察药 物疗效。实验中发现：对照组小鼠在接种WEHI-3B后，食量减少、消瘦、腹部肿大，接种后 第30d尸检发现脾脏肿大，腹腔有少量腹水及数个大小不等的实质性肿块，骨髓中出现大 量未分化细胞；新型氨基甾体及Ara-c组小鼠接种后，外周血白细胞计数及粒、单核细胞百 分率虽较接种前有所升高，但均明显低于对照组，且除新型氨基甾体5mg.kg-1.d -1剂量有一只小鼠于接种后第21～28d发病外，均未发病。接种后第30d尸检发现 ：脾脏较正常小鼠稍大，但脾重明显轻于对照组，腹腔无腹水及肿块，骨髓中未分化细胞百 分率较正常小鼠偏高，但明显低于对照组。随着新型氨基甾体剂量加大，各项指标均下降。
, 百拇医药
本实验采用的新型氨基甾体是一种人工合成的体内天然物质的衍生物。实验表明：新型氨基 甾体在一定剂量范围内能有效地治疗小鼠粒单白血病，且未发现有明显的毒副作用。提示 新型氨基甾体是一种潜在的治疗白血病药物，其作用机制有待进一步研究。
承湘雅医院血液科谢兆霞教授对白血病动物模型的建立给予指导，在此谨致谢意
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970316)
作者简介：那晓东(1970-)，女(满族)，在读博士
参考文献：
[1]Noel LW, Malcolm AS, Donald M. A transplantable myelomon ocytic leukemia in BALB/c mice: cytology, karyotype, and muramidase content[J] . J Nat Cancer Inst, 1969,43(4):963-982.
, 百拇医药
[2]Zeis M, Uharek L, Glass B, et al. Induction of graft-versus-leukemi a(GVL) activity in murine leukemia models after I1-2 pretreatment of syngeneic and allogeneic bone marrow grafts[J]. Bone Marrow Transplant, 1994,14(5):711-7 15.
[3]Hayashi M, Tomida M, Hozumi M, et al. Detection of in vivo differenti ation of murine WEHI-3B D+ leukemia cells transfected with the lac-z marker ge ne using two-color flow cytometry[J]. Leuk Res, 1996,20(4):333-341.
收稿日期：1999-04-21, 百拇医药
单位：那晓东(血液生理研究室 长沙 410078)；何群(血液生理研究室 长沙 410078)；蒋德昭(血液生理研究室 长沙 410078)
关键词：甾类；白血病；骨髓单核细胞性；急性；疾病模型；动物；小鼠
湖南医科大学学报000104 摘 要：应用不同剂量的新型氨基甾体处理小鼠急性粒-单核细胞性白血病动物模型，测定外周血白细胞计数及分类、骨髓未分化细胞百分率及脾重的变化。结果表明：新型氨基甾体能明显降低小鼠粒单白血病动物模型的上述指标(P<0.01)，且随着药物剂量的加大，后者明显降低(P<0.01)。提示新型氨基甾体对小鼠粒单白血病动物模型具有治疗作用，加大剂量可提高治疗效果。
分类号：R733 文献标识码：A
文章编号：1000-5625(2000)01-0012-03
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Effect of a novel aminosteroid on animal model of
murine myelom onocytic leukemia
NA Xiao-dong, HE Qun, JIANG De-zhao
(Department of Physiology, Hunan Medical University Changsha 410078)
Abstract：To evaluate the effect of a novel aminosteroid on m urine myelomonocytic leukemia, BALB/c mice were treated by the novel aminosteroid for 7 days after receiving 1×106 WEHI-3B(myelomonocytic leukemia) cells in traperitoneally. The counts and classification of white blood cells obtained fro m tail blood were determined on the day before transplanting WEHI-3B cells and 7 ,14,21,28 days after transplantation. Undifferentiated cell percentage of bone m arrow and spleen weight were checked 30 days after transplantation. The results demonstrated that the above indexes of mice treated with the novel aminosteroid were decreased compared with those treated with normal saline(NS). Decrease of t he indexes showed a dose-dependent relationship ranging from 5～20mg.kg -1.d-1. It is suggested that leukemia mice could be effectively treated by the novel aminosteroid and the efficacy maybe paralleled with the dosage of the novel aminosteroid.
, 百拇医药
Key words：steroids;leukemia,myelomonocytic;disease model,animal;drug effects;mice▲
WEHI-3B是小鼠急性粒单核细胞性(粒单)白血病 细胞系。将体外培养扩增的WEHI-3B细胞经腹腔注射接种于BALB/C小鼠体内能诱导移植性粒 单白血病发生[1]。小鼠粒单白血病动物模型表现为：接种白血病细胞后第10～15 d发病；外周血白细胞计数及粒细胞(粒)、单核细胞百分率升高并出现未成熟的粒、单核 细胞；骨髓未分化细胞百分率升高；脾脏肿大[1]。由于白血病的各种并发症小鼠 可突发死亡。本研究通过观察经新型氨基甾体处理的小鼠粒单白血病动物模型各指标的变化 ，探索新型氨基甾体对粒单白血病的实验性治疗作用。该新型氨基甾体系体内甾体激素的衍 生物，采用化学方法人工合成。该化合物对造血系统的生物学活性尚未见文献报道。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 8周龄体重18～22g的BALB/C小鼠60只，雌雄各半，由本校实 验动物部提供；小鼠粒单白血病细胞系WEHI-3B，由北京军事医科院引进；新生小牛血清批 号为970320，购自杭州四季青生物工程制品研究所；DMEM及Ara-C购自美国Sigma公司；新 型氨基甾体由本室何群博士提供；二氧化碳培养箱产自日本；普通光学显微镜系日本Olympu s公司产；电子天平产自美国Sigma公司；低温离心机系美国Beckman公司产。
1.2 方法
1.2.1 白血病模型的建立 将体外培养增殖的小鼠粒单白血病细胞系WEHI-3B经 腹腔注射入BALB/C小鼠体内，细胞数为每只动物106个[2，3]。
1.2.2 实验分组 将60只BALB/C小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半 。对照组给生理盐水每只0.2ml。实验组分别给予：Ara-c 20mg.kg-1.d -1，新型氨基甾体(KH)5mg.kg-1.d-1，10mg.kg-1.d-1 ，15mg.kg-1.d-1和20mg.kg-1.d-1，灌胃给药，连续 7d。
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1.3 检测指标
1.3.1 外周血白细胞计数及分类 分别于接种白血病细胞前及接种后第7，14，21 ，28d经尾静脉取外周血进行白细胞计数及分类。
1.3.2 骨髓未分化细胞百分率 于接种白血病细胞后第30d处死所有动 物，取股骨骨髓细胞涂片，计数骨髓中未分化细胞百分率。
1.3.3 脾重 于接种白血病细胞后第30d取脾脏称取其湿重。
1.4 统计学处理 实验结果以
±s表示；各组间比较用F检 验；两两比较用q检验；率的比较采用χ2检验。P<0.05示差异有显著性。2 结 果
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2.1 动物模型的建立 BALB/C小鼠接种WEHI-3B细胞后第7d外周血白细 胞计数及粒、单细胞百分率明显升高，接种后第7～14d发病，外周血中出现未成熟粒、单 核细胞(表1)，腹部肿大，脾重明显大于正常小鼠，骨髓中未分化细胞百分率较正常小鼠明 显升高。上述表现符合粒单白血病动物模型的指标，故视为该疾病模型已建立。
表1 对照组小鼠接种WEHI-3B细胞后外周 血未成熟粒、单核细胞百分率(n=10,
±s)第7d
第14d
第21d
第28d
未成熟粒细胞(%)
, http://www.100md.com
2.25±0.59
6.41±0.58
9.81±0.45
11.35±0.81
未成熟单核细胞(%)
5.75±0.48
9.41±0.95
6.69±0.62
14.88±0.51
2.2 新型氨基甾体对接种后小鼠外周血白细胞计数及分类的影响 对照组 小鼠接种后第7d外周血白细胞计数及粒、单核细胞百分率明显升高，并随着接种时间的延 长而进行性上升，外周血中出现未成熟粒、单核细胞。各实验组小鼠接种后第7d外周血白 细胞计数及粒、单核细胞百分率较接种前有所升高，但明显低于对照组(P<0.01)，且不 随接种时间的延长而继续上升，外周血中未见成熟粒、单核细胞出现；随药物剂量的加大， 外周血白细胞计数及粒、单核细胞百分率降低(表2，图1，2)。
, 百拇医药
图1 KH对外周血粒细胞百分率的影响
与对照组比①P<0.01
Fig. 1 Effect of KH on the periphera l granunocyte percentage after transplantation
图2 KH对外周血单核细胞百分率的影响与对照组比①P<0.01
Fig. 2 Effect of KH on the peripheral mon ocyte percentage after transplantation
表2 各组小鼠接种后外周血中白细 胞计数(×109.L-1)的变化(n=10，
±s) 分组, http://www.100md.com
第7d
第14d
第21 d
第28d
对照组
25.75±1.91
33.69±1.85
50.84±4 .53
101.0±4.44
Ara-C(20mg.kg-1.d-1)
, 百拇医药
16.10±1.20①
16. 28±0.90①
16.35±0.50①
15.75±1.67①
KH(20mg.kg-1.d-1)
13.46±0.73①②
11.30±1 .20①②
10.70±1.90①②
, 百拇医药
11.10±1.14①②
KH(15mg.kg-1.d-1)
17.63±0.91①
12.13±0 .80①
15.00±1.90①
15.00±1.10①
KH(10mg.kg-1.d-1)
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18.00±0.90①
18.13±0 .95①
19.00±1.90①
18.75±1.32①
KH(5mg.kg-1.d-1)
17.80±1.62①
18.00±1. 20①
17.80±1.40①
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18.70±1.30①
①与对照组比P<0.01；②与20mg.kg-1.d-1Ara-C组相比P <0.05
2.3 新型氨基甾体对接种后小鼠骨髓中未分化细胞百分率的 影响 各实验组小鼠接种后第30d骨髓中未分化细胞百分率明显低于对照组(P< 0.01)(表3)。
表3 各组小鼠接种后第30d骨髓未分化 细胞百分率(%)(n=10,
±s) 分组未分化细胞(%)
对照组
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65.0±8.70
Ara-C(20mg.kg-1.d-1
32.6±4.04①
KH(20mg.kg-1.d-1
6.8±1.80①②
KH(15mg.kg-1.d-1
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32.8±3.30①
KH(10mg.kg-1.d-1
32.8±5.60①
KH(5mg.kg-1.d-1
40.6±3.60①
①与对照组比P<0.01；②与20mg.kg-1.d-1Ara-C组相比P <0.05
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2.4 新型氨基甾体对接种后小鼠脾重的影响 各实验组小鼠接种后第30 d脾重明显低于对照组(P<0.01)(表4)。 表4 各组小鼠接种WEHI-3B细胞后第3 0d脾重(n=10,
±s) 分组脾重(g)
对照组
1.13±0.19
Ara-C(20mg.kg-1.d-1)
0.37±0.09①
KH(20mg.kg-1.d-1)
, 百拇医药
0.20±0.03①②
KH(15mg.kg-1.d-1)
0.24±0.02①
KH(10mg.kg-1.d-1)
0.57±0.02①
KH(5mg.kg-1.d-1)
, 百拇医药
0.58±0.05①
①与对照组相比P<0.01；②与20mg.kg-1.d-1Ara-C组相比P <0.05
3 讨 论
传统的白血病治疗药物以细胞毒药物为主。细胞毒药物在杀伤恶性细胞的同时，对正常的细 胞和器官也产生严重损伤。近年研究发现，白血病细胞在体外可被不同的化学物质诱导分化 为正常或较正常的细胞；分化诱导剂的发现是白血病治疗药物发展的新阶段。
本实验采用的BALB/C小鼠粒单白血病模型系由澳大利亚学者Noel L.Warner等于1969年建 成。该模型通过腹腔注射小鼠粒单白血病细胞系WEHI-3B产生移植性粒单白血病。其特 点有：外周血白细胞计数显著升高，粒、单核细胞百分率升高并出现未成熟和异常的粒、单 核细胞，骨髓中出现大量未分化细胞，脾脏肿大，绿色腹水，腹腔及皮下可出现实质性肿块 ，小鼠发病后可能由于白血病的各种并发症而突然死亡。由于白血病小鼠并发症的发生及生 存时间具有不均一性，故本实验未将生存时间作为观察指标。本实验在小鼠接种白血病细胞 后即开始给药，乃因白血病小鼠具有上述特点；若在小鼠发病后再行给药，将不便于观察药 物疗效。实验中发现：对照组小鼠在接种WEHI-3B后，食量减少、消瘦、腹部肿大，接种后 第30d尸检发现脾脏肿大，腹腔有少量腹水及数个大小不等的实质性肿块，骨髓中出现大 量未分化细胞；新型氨基甾体及Ara-c组小鼠接种后，外周血白细胞计数及粒、单核细胞百 分率虽较接种前有所升高，但均明显低于对照组，且除新型氨基甾体5mg.kg-1.d -1剂量有一只小鼠于接种后第21～28d发病外，均未发病。接种后第30d尸检发现 ：脾脏较正常小鼠稍大，但脾重明显轻于对照组，腹腔无腹水及肿块，骨髓中未分化细胞百 分率较正常小鼠偏高，但明显低于对照组。随着新型氨基甾体剂量加大，各项指标均下降。
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本实验采用的新型氨基甾体是一种人工合成的体内天然物质的衍生物。实验表明：新型氨基 甾体在一定剂量范围内能有效地治疗小鼠粒单白血病，且未发现有明显的毒副作用。提示 新型氨基甾体是一种潜在的治疗白血病药物，其作用机制有待进一步研究。
承湘雅医院血液科谢兆霞教授对白血病动物模型的建立给予指导，在此谨致谢意
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970316)
作者简介：那晓东(1970-)，女(满族)，在读博士
参考文献：
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, 百拇医药
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收稿日期：1999-04-21, 百拇医药