黑素瘤抑制蛋白启动子在小鼠体内的表达活性
作者：谢渭芬 李舰 高勇 贺祥 朱 陈伟忠 林勇
单位：谢渭芬(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200003)；李舰(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200003)；朱(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200003)；陈伟忠(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200003)；林勇(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200003)；高勇(长征医院肿瘤科)；贺祥(第二军医大学科研部)
关键词：黑素瘤抑制蛋白；软骨衍生维甲酸敏感性蛋白；小鼠；转基因；基因调控
第二军医大学学报000109 摘 要：目的：观察黑素瘤抑制蛋白(MIA/CD-RAP)启动子在小鼠体内的表达活性。方法：利用PCR技术扩增2.2 kb的MIA/CD-RAP启动子，分子克隆技术构建MIA启动子-半乳糖苷酶(2.2lacZ)载体，显微注射法将纯化的2.2lacZ DNA注入来自B6SJL杂交小鼠受精卵的原核以制备转基因小鼠。提取幼鼠尾DNA，用lacZ特异性引物筛选阳性转基因小鼠。结果：8只首建小鼠染色体基因组整合有2.2lacZ融合基因。X-gal全胚胎染色发现其中3只转基因小鼠在软骨和乳腺组织中均可见转基因的表达。结论：2.2 kb的MIA/CD-RAP启动子含有调节MIA/CD-RAP组织特异性表达的顺式调控元件。
, 百拇医药
中图分类号：Q 786 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0027-02
Investigation on the expression of melanoma inhibitory protein promoter in vivo
XIE Wei-Fen
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
LI Jian
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
ZHU Liang
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
CHEN Wei-Zhong
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
LIN Yong
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, http://www.100md.com
GAO Yong
(Department of Oncology, Changzheng Hospital)
HE Xiang
(Department of Science and Research, Second Military Medical University)
ABSTRACT：Objective: To investigate the expression pattern of 2.2 kb melanoma inhibitory protein (MIA) promoter in vivo. Methods: 2.2 kb of MIA promoter was amplified by PCR and cloned into lacZ expression vector placF by recombinant techniques to generate MIA promoter-lacZ construct (2.2lacZ). Purified DNA was microinjected into the pronuclei of fertilized eggs from B6SJL hybrid to produce transgenic mice. Founder mice were identified by PCR assays of the genomic DNA extracted from tails. Results: Eight transgenic founder mice carrying 2.2lacZ fusion gene were obtained. Whole mount-staining with X-gal demonstrated 2.2lacZ generated expression in cartilage and mammary glands in 3 transgenic mice. Conclusion: The 2.2 kb of the MIA promoter contains cis-acting elements which can generate tissue specific expression in vivo.
, 百拇医药
KEY WORDS：melanoma inhibitory protein; cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein；mice,transgenic; gene regulation▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 27-28]
Blesch等[1]从1株恶性黑素瘤细胞培养液上清中提取出黑素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory protein; melanoma inhibitory activity, MIA)。其鼠同源体——软骨衍生性维甲酸敏感性蛋白(cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein, CD-RAP)于1996年经差异显示法从小鼠软骨细胞中分离获得[2]。MIA/CD-RAP是一种分泌性蛋白。在成年鼠，MIA/CD-RAP的表达局限于软骨细胞，但在结肠癌、乳腺癌及黑素瘤等多种肿瘤中，可检测到CD-RAP的大量表达[2，3]。MIA/CD-RAP的表达与肿瘤转移密切相关。100%转移性黑素瘤患者血清CD-RAP水平显著增高；相反，血清CD-RAP水平正常的黑素瘤患者无一出现转移，提示MIA/CD-RAP可能参与肿瘤的侵袭和转移[3]。本研究通过克隆MIA/CD-RAP启动子，构建半乳糖苷酶(lacZ) DNA 表达性载体，经显微注射法制备转基因小鼠，以确定MIA/CD-RAP启动子在体内的表达活性。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 MIA启动子-半乳糖苷酶载体的制备 用PCR法扩增2.2 kb的MIA启动子，将其克隆到lacZ表达性质粒placF(美国西雅图华盛顿大学Richard D. Palmiter博士惠赠，含有报告基因lacZ和polyA)中。经DNA测序证实克隆后的MIA启动子无碱基突变后，制备和纯化重组DNA质粒。用DNA内切酶Xba Ⅰ 和Hind Ⅲ 切除无关DNA序列，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，提取和纯化含有MIA启动子-lacZ的DNA片段(2.2lacZ，图1)。将待注射DNA溶解在TE缓冲液(10 mmol/L Tris, 0.25 mmol/L EDTA, pH 7.4)中，以琼脂糖凝胶电泳测定DNA的浓度并鉴定其纯度。
图1 2.2lacZ融合基因结构示意图
, http://www.100md.com Fig 1 Schematic map of 2.2lacZ fusion gene
1.2 转基因小鼠的制备和筛选 参照Hogan等[4]法将2.2lacZ DNA注入来自B6SJL杂交小鼠受精卵的原核。将存活的受精卵细胞植入假孕母鼠。提取所得幼鼠尾DNA，参照Hanley和Merlie法[5]用lacZ特异性引物进行PCR扩增，筛选出阳性转基因小鼠。lacZ特异性引物为：编码链，5′-GCATCGAGCT GGGTAATAAGCGTTGGCAAT-3′；反义链，5′-GACACCAGACCAACTGGTAATGGT AGCGAC-3′。
1.3 胚胎染色 为建立转基因小鼠系并分析转基因的表达活性，将阳性转基因小鼠与野生型B6SJL小鼠杂交，分离13.5 d的胚胎，经4%多聚甲醛固定20～40 min后，于30℃用X-gal (Sigma)全胚胎染色过夜，观察转基因的组织表达活性[6]。
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2 结果
2.1 制备的2.2lacZ融合基因 融合基因2.2lacZ为5.8 kb。琼脂糖凝胶电泳表明，2.2lacZ融合基因片段未掺杂其他DNA成分，质量浓度约为2.5 ng/μl，符合显微注射要求。
2.2 制备的转基因小鼠 2.2lacZ融合基因注入B6SJL受精卵的原核并植入假孕母鼠，获得35只第1代小鼠。提取小鼠尾DNA并经PCR筛选，发现8只小鼠染色体基因组整合有2.2lacZ融合基因。
2.3 转基因的组织表达 将8只首建转基因小鼠与野生型小鼠杂交，分离13.5 d胚胎，X-gal全胚胎染色后，发现其中3只转基因小鼠在软骨和乳腺组织中均可见转基因的表达(图2，见插页1下)。在同一转基因小鼠系或此3个转基因小鼠系的不同胚胎之间，其基因表达的方式和强度无明显差别。
3 讨论
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转基因小鼠已在基因调控研究中得到广泛应用。DNA显微注射的关键在于DNA的纯度。我们利用分子克隆技术，构建MIA启动子-lacZ载体，酶切分离并经Qiagen DNA柱纯化后，DNA琼脂糖电泳证实2.2lacZ融合基因符合DNA显微注射要求。
原位杂交研究表明，正常情况下，MIA/CD-RAP只在软骨组织中表达。在小鼠胚胎，MIA/CD-RAP于10.5 d开始出现表达，并持续至软骨形成，提示MIA/CD-RAP可能对软骨细胞的发育和表型的维持起重要作用[7]。体外瞬时转染试验表明，2.2 kb 的MIA/CD-RAP启动子含有调节软骨特异性表达的顺式调控元件[8]。本研究利用显微注射法，在国内外首次成功建立3个MIA/CD-RAP启动子转基因小鼠系。X-gal全胚胎染色表明2.2lacZ只在软骨和乳腺组织中表达，进一步证实 2.2 kb的MIA/CD-RAP启动子含有顺式调控元件，可结合相应的反式作用因子，激活报告基因的组织特异性表达。通过构建不同片段的MIA/CD-RAP启动子转基因鼠，可以进一步明确起主要作用的顺式调控元件，为筛选激活软骨细胞和乳腺组织发育的转录因子奠定良好基础。■
, http://www.100md.com
基金项目：国家自“863”计划资助项目(102-12-04-03)
作者简介：谢渭芬(1964～)，男(汉族)，硕士，主治医师
参考文献：
[1]Blesch A, Bosserhoff AK, Apfel R, et al. Cloning of a novel malignant melanoma-derived growth-regulatory protein, MIA[J]. Cancer Res, 1994,54(21):5695-5701.
[2]Dietz UH, Sandell LJ. Cloning of a retinoic acid-sensitive mRNA expressed in cartilage and during chondrogenesis[J]. J Biol Chem, 1996,271(6):3311-3316.
, 百拇医药
[3]Bosserhoff AK, Kaufmann M, Kaluza B, et al. Melanoma-inhibiting activity, a novel serum marker for progression of malignant melanoma[J]. Cancer Res, 1997,57(15):3149-3153.
[4]Hogan B, Beddington R, Costantini F, et al. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.226-250.
[5]Hanley T, Merlie JP. Transgene detection in unpurified mouse tail DNA by polymerase chain reaction[J]. Biotechniques,1991,10(1):56.
, http://www.100md.com
[6]Bonnerot C, Nicolas JF. Application of lacZ gene fusions to postimplantation development[J]. Methods Enzymol, 1993,225:451-469.
[7]Bosserhoff AK, Kondo S, Moser M, et al. Mouse CD-RAP/MIA gene: structure, chromosomal localization, and expression in cartilage and chondrosarcoma[J]. Dev Dyn, 1997,208(4):516-525.
[8]Xie WF, Zhang X, Sakano S, et al. Trans-activation of the mouse cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein gene by Sox9[J]. J Bone Miner Res, 1999,14(5):757-763.
收稿日期：1999-08-04
修回日期：1999-11-12, 百拇医药
单位：谢渭芬(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200003)；李舰(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200003)；朱(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200003)；陈伟忠(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200003)；林勇(第二军医大学长征医院消化内科，上海 200003)；高勇(长征医院肿瘤科)；贺祥(第二军医大学科研部)
关键词：黑素瘤抑制蛋白；软骨衍生维甲酸敏感性蛋白；小鼠；转基因；基因调控
第二军医大学学报000109 摘 要：目的：观察黑素瘤抑制蛋白(MIA/CD-RAP)启动子在小鼠体内的表达活性。方法：利用PCR技术扩增2.2 kb的MIA/CD-RAP启动子，分子克隆技术构建MIA启动子-半乳糖苷酶(2.2lacZ)载体，显微注射法将纯化的2.2lacZ DNA注入来自B6SJL杂交小鼠受精卵的原核以制备转基因小鼠。提取幼鼠尾DNA，用lacZ特异性引物筛选阳性转基因小鼠。结果：8只首建小鼠染色体基因组整合有2.2lacZ融合基因。X-gal全胚胎染色发现其中3只转基因小鼠在软骨和乳腺组织中均可见转基因的表达。结论：2.2 kb的MIA/CD-RAP启动子含有调节MIA/CD-RAP组织特异性表达的顺式调控元件。
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中图分类号：Q 786 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0027-02
Investigation on the expression of melanoma inhibitory protein promoter in vivo
XIE Wei-Fen
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
LI Jian
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
ZHU Liang
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
CHEN Wei-Zhong
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
LIN Yong
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
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GAO Yong
(Department of Oncology, Changzheng Hospital)
HE Xiang
(Department of Science and Research, Second Military Medical University)
ABSTRACT：Objective: To investigate the expression pattern of 2.2 kb melanoma inhibitory protein (MIA) promoter in vivo. Methods: 2.2 kb of MIA promoter was amplified by PCR and cloned into lacZ expression vector placF by recombinant techniques to generate MIA promoter-lacZ construct (2.2lacZ). Purified DNA was microinjected into the pronuclei of fertilized eggs from B6SJL hybrid to produce transgenic mice. Founder mice were identified by PCR assays of the genomic DNA extracted from tails. Results: Eight transgenic founder mice carrying 2.2lacZ fusion gene were obtained. Whole mount-staining with X-gal demonstrated 2.2lacZ generated expression in cartilage and mammary glands in 3 transgenic mice. Conclusion: The 2.2 kb of the MIA promoter contains cis-acting elements which can generate tissue specific expression in vivo.
, 百拇医药
KEY WORDS：melanoma inhibitory protein; cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein；mice,transgenic; gene regulation▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 27-28]
Blesch等[1]从1株恶性黑素瘤细胞培养液上清中提取出黑素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory protein; melanoma inhibitory activity, MIA)。其鼠同源体——软骨衍生性维甲酸敏感性蛋白(cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein, CD-RAP)于1996年经差异显示法从小鼠软骨细胞中分离获得[2]。MIA/CD-RAP是一种分泌性蛋白。在成年鼠，MIA/CD-RAP的表达局限于软骨细胞，但在结肠癌、乳腺癌及黑素瘤等多种肿瘤中，可检测到CD-RAP的大量表达[2，3]。MIA/CD-RAP的表达与肿瘤转移密切相关。100%转移性黑素瘤患者血清CD-RAP水平显著增高；相反，血清CD-RAP水平正常的黑素瘤患者无一出现转移，提示MIA/CD-RAP可能参与肿瘤的侵袭和转移[3]。本研究通过克隆MIA/CD-RAP启动子，构建半乳糖苷酶(lacZ) DNA 表达性载体，经显微注射法制备转基因小鼠，以确定MIA/CD-RAP启动子在体内的表达活性。
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1 材料和方法
1.1 MIA启动子-半乳糖苷酶载体的制备 用PCR法扩增2.2 kb的MIA启动子，将其克隆到lacZ表达性质粒placF(美国西雅图华盛顿大学Richard D. Palmiter博士惠赠，含有报告基因lacZ和polyA)中。经DNA测序证实克隆后的MIA启动子无碱基突变后，制备和纯化重组DNA质粒。用DNA内切酶Xba Ⅰ 和Hind Ⅲ 切除无关DNA序列，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，提取和纯化含有MIA启动子-lacZ的DNA片段(2.2lacZ，图1)。将待注射DNA溶解在TE缓冲液(10 mmol/L Tris, 0.25 mmol/L EDTA, pH 7.4)中，以琼脂糖凝胶电泳测定DNA的浓度并鉴定其纯度。
图1 2.2lacZ融合基因结构示意图
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1.2 转基因小鼠的制备和筛选 参照Hogan等[4]法将2.2lacZ DNA注入来自B6SJL杂交小鼠受精卵的原核。将存活的受精卵细胞植入假孕母鼠。提取所得幼鼠尾DNA，参照Hanley和Merlie法[5]用lacZ特异性引物进行PCR扩增，筛选出阳性转基因小鼠。lacZ特异性引物为：编码链，5′-GCATCGAGCT GGGTAATAAGCGTTGGCAAT-3′；反义链，5′-GACACCAGACCAACTGGTAATGGT AGCGAC-3′。
1.3 胚胎染色 为建立转基因小鼠系并分析转基因的表达活性，将阳性转基因小鼠与野生型B6SJL小鼠杂交，分离13.5 d的胚胎，经4%多聚甲醛固定20～40 min后，于30℃用X-gal (Sigma)全胚胎染色过夜，观察转基因的组织表达活性[6]。
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2 结果
2.1 制备的2.2lacZ融合基因 融合基因2.2lacZ为5.8 kb。琼脂糖凝胶电泳表明，2.2lacZ融合基因片段未掺杂其他DNA成分，质量浓度约为2.5 ng/μl，符合显微注射要求。
2.2 制备的转基因小鼠 2.2lacZ融合基因注入B6SJL受精卵的原核并植入假孕母鼠，获得35只第1代小鼠。提取小鼠尾DNA并经PCR筛选，发现8只小鼠染色体基因组整合有2.2lacZ融合基因。
2.3 转基因的组织表达 将8只首建转基因小鼠与野生型小鼠杂交，分离13.5 d胚胎，X-gal全胚胎染色后，发现其中3只转基因小鼠在软骨和乳腺组织中均可见转基因的表达(图2，见插页1下)。在同一转基因小鼠系或此3个转基因小鼠系的不同胚胎之间，其基因表达的方式和强度无明显差别。
3 讨论
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转基因小鼠已在基因调控研究中得到广泛应用。DNA显微注射的关键在于DNA的纯度。我们利用分子克隆技术，构建MIA启动子-lacZ载体，酶切分离并经Qiagen DNA柱纯化后，DNA琼脂糖电泳证实2.2lacZ融合基因符合DNA显微注射要求。
原位杂交研究表明，正常情况下，MIA/CD-RAP只在软骨组织中表达。在小鼠胚胎，MIA/CD-RAP于10.5 d开始出现表达，并持续至软骨形成，提示MIA/CD-RAP可能对软骨细胞的发育和表型的维持起重要作用[7]。体外瞬时转染试验表明，2.2 kb 的MIA/CD-RAP启动子含有调节软骨特异性表达的顺式调控元件[8]。本研究利用显微注射法，在国内外首次成功建立3个MIA/CD-RAP启动子转基因小鼠系。X-gal全胚胎染色表明2.2lacZ只在软骨和乳腺组织中表达，进一步证实 2.2 kb的MIA/CD-RAP启动子含有顺式调控元件，可结合相应的反式作用因子，激活报告基因的组织特异性表达。通过构建不同片段的MIA/CD-RAP启动子转基因鼠，可以进一步明确起主要作用的顺式调控元件，为筛选激活软骨细胞和乳腺组织发育的转录因子奠定良好基础。■
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基金项目：国家自“863”计划资助项目(102-12-04-03)
作者简介：谢渭芬(1964～)，男(汉族)，硕士，主治医师
参考文献：
[1]Blesch A, Bosserhoff AK, Apfel R, et al. Cloning of a novel malignant melanoma-derived growth-regulatory protein, MIA[J]. Cancer Res, 1994,54(21):5695-5701.
[2]Dietz UH, Sandell LJ. Cloning of a retinoic acid-sensitive mRNA expressed in cartilage and during chondrogenesis[J]. J Biol Chem, 1996,271(6):3311-3316.
, 百拇医药
[3]Bosserhoff AK, Kaufmann M, Kaluza B, et al. Melanoma-inhibiting activity, a novel serum marker for progression of malignant melanoma[J]. Cancer Res, 1997,57(15):3149-3153.
[4]Hogan B, Beddington R, Costantini F, et al. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.226-250.
[5]Hanley T, Merlie JP. Transgene detection in unpurified mouse tail DNA by polymerase chain reaction[J]. Biotechniques,1991,10(1):56.
, http://www.100md.com
[6]Bonnerot C, Nicolas JF. Application of lacZ gene fusions to postimplantation development[J]. Methods Enzymol, 1993,225:451-469.
[7]Bosserhoff AK, Kondo S, Moser M, et al. Mouse CD-RAP/MIA gene: structure, chromosomal localization, and expression in cartilage and chondrosarcoma[J]. Dev Dyn, 1997,208(4):516-525.
[8]Xie WF, Zhang X, Sakano S, et al. Trans-activation of the mouse cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein gene by Sox9[J]. J Bone Miner Res, 1999,14(5):757-763.
收稿日期：1999-08-04
修回日期：1999-11-12, 百拇医药