菘蓝组织培养物中靛蓝、靛玉红含量的变化
作者：傅翔 张汉明 丁如贤
单位：傅翔(南京军区福州总医院药剂科，福州 350025)；张汉明(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)；丁如贤(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)
关键词：菘蓝；靛蓝；靛玉红
菘蓝组织培养物中靛蓝中图分类号：R 282.71 文献标识码： B
文章编号：0258-879X(2000)01-0033-02▲
1 材料和方法
十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)是我国南北各地广为栽培的一种药用植物，是常用中药板蓝根和大青叶的主要来源。板蓝根和大青叶两者都有清热解毒、凉血消斑的功效，已知靛蓝和靛玉红是其中的重要活性成分。对菘蓝组织培养快速繁殖的研究已有报道[1，2]。本研究用高效液相色谱法(HPLC)测定了菘蓝在组织培养过程中靛蓝、靛玉红含量的变化，并讨论芽器官分化、试管增殖次数、光暗培养条件对靛蓝、靛玉红含量的影响。
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1.1 样品的获得 (1)由无菌条件下萌发的菘蓝四倍体实生苗叶为外植体，诱导愈伤及继代培养基(MS+2.4-D 0.5 mg/L+BA 1.0 mg/L),每20 d继代1次； 愈伤组织继代3次后转入芽诱导分化培养基(MS+BA 2 mg/L+NAA 1 mg/L)，直至诱导出芽。在整个脱分化和再分化过程中每10 d随机取1批培养物待测。 将四倍体菘蓝叶分化的芽切割后反复转接至芽诱导分化培养基(BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L)，按照芽分化芽的方式，腋芽不断形成又不断萌发形成丛生苗。每10 d将芽簇分割转接1次,每转接1次随机切下1批分化的试管苗叶待测。 (3)以四倍体菘蓝实生苗子叶为外植体，以MS+BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L 和MS+BA 3 mg/L+ NAA 0.2 mg/L为芽诱导分化培养基，分光(2 000 lx，12 h/d)暗两种环境下生长，4周后得到光暗条件下菘蓝子叶的分化苗，取两种分化苗叶待测。每一实验过程均重复3次,结果取3次平均值。
1.2 样品的处理 取各种样品，60℃干燥24 h，研细过60目筛,置于500 ml圆底烧瓶中,加入250 ml氯仿，80℃提取8 h。回收氯仿至小体积，转入10 ml容量瓶，氯仿加至刻度，置冰箱中保存。 靛蓝、靛玉红对照品分别加氯仿溶解成0.1 mg/ml的溶液。
, 百拇医药
1.3 仪器及色谱分析条件 岛津LC-9A高效液相仪，岛津C-R4A色谱数据处理机， 岛津SPD-6AV紫外可见检测器。甲醇和氯仿为分析纯，水为两次重蒸馏的去离子水。色谱柱为Shim-Pack CLC-ODS不锈钢柱150 mm×6.0 mm,填料粒径5 μm, 室温,检测波长为292 nm,流动相为甲醇∶水＝80∶20，测定方法为外标法。
2 结果和讨论
2.1 芽器官分化对靛蓝、靛玉红含量的影响 菘蓝叶脱分化成愈伤组织和再分化成芽过程中靛蓝和靛玉红含量测定结果见表1。从表1中可见，在此过程中靛蓝、靛玉红都有一个含量逐渐降低，直至检测不出，然后又逐渐升高的过程，刚好与叶的脱分化形成愈伤组织、并再分化成芽的过程相一致，表明菘蓝中靛蓝、靛玉红前体的产生可能与芽的分化有联系。
表1 菘蓝叶组织培养过程中靛蓝、靛玉红含量变化
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培养的时间
含量(wB/μg。mg-1)
靛蓝
靛玉红
0
2.45
1.67
10
2.23
1.71
20a
0.14
, 百拇医药
0.74
30
0.32
0.28
40a
0.15…
50……
60a……
70……
80……
90b……
100……
, 百拇医药
110
0.24
0.19
120
0.37
0.24
130
0.32
0.91
140
1.54
1.06
a: 每20 d次代培养1次；b: 第90天时转至差向培养介质中
, 百拇医药
2.2 试管增殖次数对靛蓝、靛玉红含量的影响 结果显示，分化苗不断由芽生芽的方式继代时，靛蓝、靛玉红的含量整体继续保持稳定。分化苗转接1，3，5，9次后，叶中靛蓝的含量分别为2.55，2.62，2.46，2.54 μg/mg;靛玉红含量分别为1.64，1.59，1.54，1.48 μg/mg。从一个方面体现由芽繁殖芽的方式能保持植物遗传性状的稳定，这是由于分生组织的特殊结构的稳定性所保证的，用作快速繁殖的手段，不会导致品种的退化。这在金线莲[3]，石蒜[4]，地黄,半夏[5]等多种药用植物的无性快速繁殖实验中也可看到。
2.3 光暗培养条件对靛蓝、靛玉红含量的影响 光亮培养条件下所得菘蓝分化苗叶中靛蓝、靛玉红的含量分别为2.72，1.64 μg/mg，黑暗培养条件下所得菘蓝分化苗叶中靛蓝、靛玉红含量分别为0.67，0.48 μg/mg。可见在两种培养条件下，分化苗叶中靛蓝、靛玉红的含量存在着非常显著的差异，黑暗条件下靛蓝、靛玉红含量极低。此外,光暗条件下的两种菘蓝分化苗在形态、颜色上均有较大差别。对此，我们将另文报道。光对培养植物或组织器官生长、发育、代谢有重要作用,光强度、光谱成分和每天曝光时间长短均与此紧密相关。曾有文献报道不同色光对石刁柏试管苗的物质积累及佛甲草离体茎段形态发生及生长发育有显著影响。本研究结果与上述报道有相似之处，提示不同色光可能因调控不同吸收系统，改变培养物内源激素水平及调控不同物质的吸收和排泄来调节培养物的生长及次生产物代谢，但光在调控关键生化机制中的作用和对特殊结构发育的影响仍有待深入研究。■
, 百拇医药
作者简介：傅翔(1972～)，男(汉族)，硕士，药师
参考文献：
[1]苟克俭.菘蓝子房离体培养成苗[J].中草药，1992，23(8)：436.
[2]傅 翔，张汉明，丁如贤，等. 激素对菘蓝器官分化的影响[J].中草药，1997，28(10)：618-620.
[3]王建勤，林兰英，陈 钢. 组培金线莲与野生金线莲酯酶同工酶比较研究[J]. 福建中医药，1995，26(1)：41-42.
[4]高增平，江佩芬，何 斌. 野生石蒜与其组织培养品的化学成分对比研究[J]. 北京中医药大学学报，1995，(3)60-61.
[5]西冈五夫. 药用植物的离体快速繁殖[J]. 组织培养，1985，11(9)：16-19.
收稿日期：1999-08-01
修回日期：1999-12-19, 百拇医药
单位：傅翔(南京军区福州总医院药剂科，福州 350025)；张汉明(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)；丁如贤(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)
关键词：菘蓝；靛蓝；靛玉红
菘蓝组织培养物中靛蓝中图分类号：R 282.71 文献标识码： B
文章编号：0258-879X(2000)01-0033-02▲
1 材料和方法
十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)是我国南北各地广为栽培的一种药用植物，是常用中药板蓝根和大青叶的主要来源。板蓝根和大青叶两者都有清热解毒、凉血消斑的功效，已知靛蓝和靛玉红是其中的重要活性成分。对菘蓝组织培养快速繁殖的研究已有报道[1，2]。本研究用高效液相色谱法(HPLC)测定了菘蓝在组织培养过程中靛蓝、靛玉红含量的变化，并讨论芽器官分化、试管增殖次数、光暗培养条件对靛蓝、靛玉红含量的影响。
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1.1 样品的获得 (1)由无菌条件下萌发的菘蓝四倍体实生苗叶为外植体，诱导愈伤及继代培养基(MS+2.4-D 0.5 mg/L+BA 1.0 mg/L),每20 d继代1次； 愈伤组织继代3次后转入芽诱导分化培养基(MS+BA 2 mg/L+NAA 1 mg/L)，直至诱导出芽。在整个脱分化和再分化过程中每10 d随机取1批培养物待测。 将四倍体菘蓝叶分化的芽切割后反复转接至芽诱导分化培养基(BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L)，按照芽分化芽的方式，腋芽不断形成又不断萌发形成丛生苗。每10 d将芽簇分割转接1次,每转接1次随机切下1批分化的试管苗叶待测。 (3)以四倍体菘蓝实生苗子叶为外植体，以MS+BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L 和MS+BA 3 mg/L+ NAA 0.2 mg/L为芽诱导分化培养基，分光(2 000 lx，12 h/d)暗两种环境下生长，4周后得到光暗条件下菘蓝子叶的分化苗，取两种分化苗叶待测。每一实验过程均重复3次,结果取3次平均值。
1.2 样品的处理 取各种样品，60℃干燥24 h，研细过60目筛,置于500 ml圆底烧瓶中,加入250 ml氯仿，80℃提取8 h。回收氯仿至小体积，转入10 ml容量瓶，氯仿加至刻度，置冰箱中保存。 靛蓝、靛玉红对照品分别加氯仿溶解成0.1 mg/ml的溶液。
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1.3 仪器及色谱分析条件 岛津LC-9A高效液相仪，岛津C-R4A色谱数据处理机， 岛津SPD-6AV紫外可见检测器。甲醇和氯仿为分析纯，水为两次重蒸馏的去离子水。色谱柱为Shim-Pack CLC-ODS不锈钢柱150 mm×6.0 mm,填料粒径5 μm, 室温,检测波长为292 nm,流动相为甲醇∶水＝80∶20，测定方法为外标法。
2 结果和讨论
2.1 芽器官分化对靛蓝、靛玉红含量的影响 菘蓝叶脱分化成愈伤组织和再分化成芽过程中靛蓝和靛玉红含量测定结果见表1。从表1中可见，在此过程中靛蓝、靛玉红都有一个含量逐渐降低，直至检测不出，然后又逐渐升高的过程，刚好与叶的脱分化形成愈伤组织、并再分化成芽的过程相一致，表明菘蓝中靛蓝、靛玉红前体的产生可能与芽的分化有联系。
表1 菘蓝叶组织培养过程中靛蓝、靛玉红含量变化
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培养的时间
含量(wB/μg。mg-1)
靛蓝
靛玉红
0
2.45
1.67
10
2.23
1.71
20a
0.14
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0.74
30
0.32
0.28
40a
0.15…
50……
60a……
70……
80……
90b……
100……
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0.24
0.19
120
0.37
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130
0.32
0.91
140
1.54
1.06
a: 每20 d次代培养1次；b: 第90天时转至差向培养介质中
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2.2 试管增殖次数对靛蓝、靛玉红含量的影响 结果显示，分化苗不断由芽生芽的方式继代时，靛蓝、靛玉红的含量整体继续保持稳定。分化苗转接1，3，5，9次后，叶中靛蓝的含量分别为2.55，2.62，2.46，2.54 μg/mg;靛玉红含量分别为1.64，1.59，1.54，1.48 μg/mg。从一个方面体现由芽繁殖芽的方式能保持植物遗传性状的稳定，这是由于分生组织的特殊结构的稳定性所保证的，用作快速繁殖的手段，不会导致品种的退化。这在金线莲[3]，石蒜[4]，地黄,半夏[5]等多种药用植物的无性快速繁殖实验中也可看到。
2.3 光暗培养条件对靛蓝、靛玉红含量的影响 光亮培养条件下所得菘蓝分化苗叶中靛蓝、靛玉红的含量分别为2.72，1.64 μg/mg，黑暗培养条件下所得菘蓝分化苗叶中靛蓝、靛玉红含量分别为0.67，0.48 μg/mg。可见在两种培养条件下，分化苗叶中靛蓝、靛玉红的含量存在着非常显著的差异，黑暗条件下靛蓝、靛玉红含量极低。此外,光暗条件下的两种菘蓝分化苗在形态、颜色上均有较大差别。对此，我们将另文报道。光对培养植物或组织器官生长、发育、代谢有重要作用,光强度、光谱成分和每天曝光时间长短均与此紧密相关。曾有文献报道不同色光对石刁柏试管苗的物质积累及佛甲草离体茎段形态发生及生长发育有显著影响。本研究结果与上述报道有相似之处，提示不同色光可能因调控不同吸收系统，改变培养物内源激素水平及调控不同物质的吸收和排泄来调节培养物的生长及次生产物代谢，但光在调控关键生化机制中的作用和对特殊结构发育的影响仍有待深入研究。■
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作者简介：傅翔(1972～)，男(汉族)，硕士，药师
参考文献：
[1]苟克俭.菘蓝子房离体培养成苗[J].中草药，1992，23(8)：436.
[2]傅 翔，张汉明，丁如贤，等. 激素对菘蓝器官分化的影响[J].中草药，1997，28(10)：618-620.
[3]王建勤，林兰英，陈 钢. 组培金线莲与野生金线莲酯酶同工酶比较研究[J]. 福建中医药，1995，26(1)：41-42.
[4]高增平，江佩芬，何 斌. 野生石蒜与其组织培养品的化学成分对比研究[J]. 北京中医药大学学报，1995，(3)60-61.
[5]西冈五夫. 药用植物的离体快速繁殖[J]. 组织培养，1985，11(9)：16-19.
收稿日期：1999-08-01
修回日期：1999-12-19, 百拇医药