缺氧时培养的肺动脉平滑肌细胞的增殖与内皮素自分泌关系的探讨
作者：王培勇 刘健 曾强 许蜀闽 王俊元 孙秉庸
单位：王培勇(第三军医大学：高原军事医学系高原医学研究室、病理生理学教研室，重庆 400038)；刘健(附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；曾强(解放军总医院老年病研究所，北京 100853)；许蜀闽(第三军医大学：高原军事医学系高原医学研究室、病理生理学教研室，重庆 400038)；王俊元(第三军医大学：高原军事医学系高原医学研究室、病理生理学教研室，重庆 400038)
关键词：缺氧；肺动脉平滑肌细胞；内皮素-1
第三军医大学学报000125
提要 目的：缺氧能否通过影响血管平滑肌细胞血管活性肽的自分泌功能而参与缺氧性肺动脉高压的发生尚不明确，本实验在培养的新生小牛肺动脉平滑肌细胞(PASM)上探讨内皮素-1(ET-1)自分泌在其中的作用。方法：采用3H-TdR掺入研究PASM增殖，放免测定和斑点杂交技术研究ET-1的分泌和表达。结果：无氧培养(0%O2)24h使新生小牛肺动脉平滑肌细胞(PASM)的3H-TdR掺入与常氧组相比增加42.3%(P<0.001)，ETA受体拮抗剂BQ123(10-6mmol/L)使常氧培养的PASM的3H-TdR掺入降低47%(P<0.01)，但对缺氧培养条件下PASM的3H-TdR掺入无显著影响。采用放免测定发现，缺氧培养3～48h导致PASM的ET-1分泌降低非常显著(P<0.01)。斑点杂交显示，缺氧同样抑制PASM的ET-1的mRNA表达(P<0.01)。结论：ET-1参与常氧情况下PASM增殖的调节，而与缺氧引起的PASM过度增殖无关，缺氧可通过抑制PASM的ET-1mRNA的表达而抑制ET-1的合成和分泌。
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中图法分类号 R349.21；R845.22 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)01-0085-04
A study on proliferation and endothelin excretion of cultured pulmonary artery smooth muscle cells under anoxia
WANG Pei-yong,LIU Jian,ZENG Qiang,XU Shu-min,WANG Jun-yuan,SUN Bing-yong
(Department of pathophysiology,Faculty of High Altitude Medicine,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
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Abstract Objective:To explore the role of alterations of autocrine function of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMs) in the development of hypoxic pumonary hypertension (HPH).Methods:The effect of hypoxia on proliferation of cultured new born bovine PASMs and its relationship with endothelin-1 (ET-1) autocrine were investigated with 3H-TdR incorporation,immunochemistry,dotting hybridization and radioimmunoassay.Results:In response to hypoxia (0% O2) for 24 h,3H-TdR inorporation of PASMs increased significantly by 42% (P<0.001 compared with control group).ETA receptor inhibitor BQ123 (10-6 mmol/L) inhibited 3H-TdR incorporation by 47% (P<0.001) under normoxia,but exerted no effect under hypoxia condition.Immunochemistry showed positive staining of ET-1 in PSAM.ET-1 mRNA expression and ET-1 secretion decreased significantly when PSAMs were incubated under hypoxic condition from the 3rd to 48th h (P<0.01 vs control).Conclusion:ET-1 autocrine by PASMs regulates proloferation of themselves under nomoxia but not hypoxia.Hypoxia attenuates ET-1 synthesis and release by reducing ET-1 mRNA expression.
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Key words hypoxia; pulmonary artery smooth muscle cell; endothelin-1
急性和慢性缺氧均可导致肺动脉高压，肺血管床特别是肺小动脉平滑肌收缩和结构改建(Remodeling)是缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)形成和维持的基础，其中血管壁平滑肌增殖为其主要特征。尽管对其机制进行了大量研究，但仍有许多环节尚不明确。目前已知，除了血管内皮细胞分泌血管活性成份以旁分泌的方式调节血管平滑肌的舒缩和增殖外，血管平滑肌细胞本身也能以自分泌的方式产生许多血管活性成份[1]。研究表明，肺动脉内皮细胞通过旁分泌内皮素-1(Endothelin-1，ET-1)在HPH的发生中起重要作用，但缺氧能否通过影响平滑肌细胞自分泌ET-1而参与缺氧性肺血管收缩和结构改建尚未见报道。因此，本实验动态观察了缺氧对培养的小牛肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASM)ET-1自分泌的影响，并研究其变化的机制，以探讨平滑肌ET-1自分泌功能的改变在HPH发生中所起的作用。
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1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
胰蛋白酶(DIFICO，1∶250)，RPMI 1640(JR SCIENTI-FICINC.USA)，ETA受体拮抗剂BQ123和ET-1 cDNA及ET-1单克隆抗体(Penisula Lab,USA),ET-1测定试剂盒(北方免疫试剂研究所)，抑肽酶和地高辛配基标记与检测试剂盒(德国BoehringerMannheim)，无氧混合气(N2中含5%CO2，重庆气体制造厂)，3H-标记胸腺嘧啶核苷(中国原子能科学研究所)，S-P免疫组化染色试剂盒(福建迈新生物技术开发公司)，其它试剂均为国产或进口AR级。所用的培养器皿为COSTAR产品。
1.2 细胞培养
取新生小牛活杀后用5%CO2孵箱培养PASM[2]，培养成功后采用3～10代细胞进行试验。采用台盼蓝染色法鉴定细胞活力。取对数生长期的PASM，以104/cm2的密度传代接种于培养瓶后加入含20%小牛血清的RPMI1640培养2～3d，待细胞汇合成单层后换为含1%透析和灭活的贫血小板小牛血清的培养基，分组进行下述实验。
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1.3 3H-TdR掺入的增殖分析
PASM按每孔2万细胞接种于96孔培养板，长成单层后换含1%经透析和灭活的贫血小板血清RPMI1640培养基，将细胞分为下述各组：常氧组、缺氧组、常氧+BQ123组和缺氧+BQ123组。常氧组置21%O2的CO2孵箱培养；缺氧组置于缺氧培养箱内，通入无氧混合气，平衡后测定的氧浓度约为0.034%(0～0.7%，下同)。培养24h，最后6h加入3H-TdR(0.5μCi/孔)，收集细胞后用β-液体闪烁计仪(RackβLKB-1217，芬兰)测Bq。
1.4 ET-1的免疫组化染色
将PASM接种于24孔培养板内的玻片上，生长成层后换含1%经透析和灭活的贫血小板血清RPMI1640培养基，分常氧和无氧组，n=5。培养24h后，将细胞用4%多聚甲醛固定，应用S-P法进行ET-1免疫组化染色，以棕黄色为阳性。用真彩色医学图像分析系统(空军总医院CMIAS007)测其积分光密度(IOD)值，作为细胞内ET-1的相对含量。
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1.5 ET-1放免测定和ET-1mRNA斑点杂交
PASM按104/cm2细胞密度接种于3025培养瓶，培养方法同上。将细胞分为常氧组和缺氧组，缺氧方法同上。上述每组又分为1.5、3、6、12、24和48h等6个不同的时相点，以动态观察ET-1的分泌和表达变化。根据上述分组，取培养上清液按药盒说明书测定ET-1含量，将细胞用0.1%胰蛋白酶消化收集，用冷的PBS液(pH7.2)冲洗，离心后速冷于-196℃的液氮中保存备用。
1.5.1 PASM总RNA的提取 将液氮中冻存的PASM取出复融，按酚-氯仿-异硫氰酸胍法[3]略加改进提取RNA。所提的RNA溶于0.1%DEPC处理水中，应用UV-240多功能紫外分光光度仪(日本津岛)三复管测定各例总RNA的260nm、280nmD值和二者比值，结果D260/280比值均在1.8以上，RNA置-70℃冷冻备用。
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1.5.2 ET-1cDNA探针标记及斑点印迹杂交 将1.3kb人ET-1cDNA煮沸变性后，按照地高辛配基标记与检测试剂盒说明书，用地高辛配基随机引物法标记探针，并冷置备用。从每组PASM的RNA中分别取20μg，用样品稀释液(20×SSC∶37%甲醛=1∶1)稀释至10μl，65℃水浴15min使RNA充分变性后点于硝酸纤维素膜上，80℃真空烤膜2h。烤好的NC膜放入20ml预杂交液[50%甲酰胺、5×Denhardt、6×SSPE、0.1%十二烷酰肌氨酸纳(Sarcoayl)、0.02%SDS]中42℃震荡预杂交6h，将膜取出置入杂交液中(预杂交液成分加地高辛配基标记cDNA探针25ng/ml及经超声打碎热变性的鲑鱼精DNA100μg/ml)42℃杂交24～36h。杂交后的NC膜按地高辛配基标记与检测试剂盒说明进行洗膜、10×Denhardt封阻，之后与抗地高辛抗体(1∶5000)于37℃反应30min，再漂洗去多余抗体后进行显色。终止显色，湿膜用薄层色谱扫描仪(CS-910日本岛津)和图像分析仪(C-RIB日本岛津)进行光密度扫描和分析，测定积分光密度代表mRNA相对含量。所得数据以相对于常氧的百分比(100%)表示，求3次试验的均值。
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1.6 统计学分析
所得数据采用多因素(Super ANOVA)方差分析，结果以
表示，做方差保护下的最小差值显著性检验。
2 结果
2.1 ET-1免疫组化染色
缺氧6～48h后，相差显微镜下观察PASM的形态无显著变化，台盼蓝染色表明细胞活力均大于95%。21%O2组PASM的ET-1染色可见密集的阳性反应颗粒，呈黄褐色，与0%O2组PASM胞浆内ET-1染色阳性反应相似。两组呈阳性反应的细胞数占该组细胞总数的90%以上。图像分析结果表明常氧24h细胞ET-1免疫组化染色积分光密度值(IOD)与无氧组差异不显著(积分光密度值分别为3747.23±1352.9和3854.21±958.38，P>0.05)。见图1。
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图1 培养的肺动脉平滑肌细胞ET-1免疫组织化学染色 (S-P×250) A：21%O2+5%CO2； B:0%O2+5%CO2
Fig1 Endothelin-1 immunohistochemistry staining in pulmonary arterial smooth muscle cells cultured in normoxic (A) and hypoxic (B) conditions (S-P×250)
2.2 缺氧对PASM细胞ET-1自分泌的影响
培养的PASM细胞的ET-1分泌速度于3～6h达高峰，12h后随培养时间的延长而逐渐降低。缺氧情况下，ET-1分泌显著减少，其减少的程度与孵育时间有关，缺氧3～6hET-1分泌约降低58%～66%(P<0.001)；缺氧12～48hET-1分泌约降低15%～33%(P<0.01)。见图2。
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图2 缺氧对PASM自分泌ET-1的影响(n=3)
Fig2 Effect of hypoxia on ET-1 autocrine by PASM(n=3)
*:P<0.01,**：P<0.001 vs 21%O2
2.3 缺氧对PASM的ET-1mRNA表达的影响
斑点杂交显示，缺氧使PASM的ET-1的mRNA表达显著受抑制(P<0.01)。见图3。
图3 缺氧对PASM的ET-1mRNA表达的影响(n=3)
Fig3 Effect of hypoxia on ET-1 mRNA expression in PASM
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(n=3) *：P<0.01 vs 21%O2
2.4 ETA受体拮抗剂BQ123对PASM增殖的影响
常氧培养的PASM于培养基中加入10-3mmol/L的BQ123培养24h，其3H-TdR掺入显著减少，约减少47%(P<0.001)，缺氧(0%O2)培养条件下培养24h后，PASM的3H-TdR掺入显著增多，与常氧组相比约增加42%(P<0.001)，缺氧培养的PASM加入10-3mmol/L的BQ123，其3H-TdR掺入与缺氧组相比无显著变化。见图4。
图4 ETA受体拮抗剂BQ123对常氧和缺氧PASM
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增殖的影响(n=5)
Fig4 Effect of 10-3mmol/L BQ123,ETA receptor
inhibitor on PASM proliferation under normoxia
and hypoxia(n=5)*:P<0.001 vs 21%O2-BQ123 group;**：P<0.001 vs 21%O2 groups
3 讨论
通常认为血管内皮细胞调节血管平滑肌细胞舒缩和增殖，前者是调节细胞，后者是效应细胞。但近年来许多研究表明，许多由内皮细胞分泌的活性调节成份也可以由平滑肌分泌[1]。肺血管平滑肌细胞在缺氧条件下的增生及收缩反应增强是导致肺血管壁增厚、非肌性血管肌化是肺动脉高压的重要条件之一，但其发生机制仍不十分清楚。肺血管平滑肌的舒缩和增殖调节失常是HPH发生和发展的基础，我们推测缺氧可能通过影响PASM血管活性物质的自分泌或旁分泌而参与上述过程。ET-1是迄今发现的最强的内源性血管收缩肽，且对血管平滑肌细胞(VSMC)具有强的丝裂原作用，它可以由多种组织和细胞表达和分泌。文献[4，5]报道缺氧可引起血管内皮细胞及肺组织ET-1表达增加，而ET-1的主要靶细胞是VSMC，ET-1通过与其膜上的ETA受体结合发挥生物效应。部分研究表明，血管平滑肌能分泌和表达ET-1。Resink等[6，7]发现，培养的人血管平滑肌细胞在血管紧张素Ⅱ、血管加压素(AVP)、转化生长因子、血小板源性生长因子-AA等刺激下可分泌生理效应浓度的ET-1。在培养的大鼠主动脉平滑肌细胞发现分泌的ET-1较内皮细胞低30倍，它可由氧化血红蛋白所诱导[8]。Cyclosporine A也刺激培养的平滑肌细胞分泌ET-1[9]。ET-1是肺血管结构张力的重要自分泌/旁分泌调节因子。但PASM的ET-1自分泌及其表达在缺氧时有何改变尚未见报道。
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我们的实验发现，缺氧PASM的3H-TdR掺入升高，ET-1的A受体拮抗剂BQ123显著抑制常氧时3H-TdR掺入，而对缺氧PASM的3H-TdR掺入增加则无显著抑制作用。表明常氧情况下，PASM的ET-1自分泌参与其自身增殖的调节，但缺氧时ET-1自分泌对其增殖无显著影响。进一步实验证明PASM细胞内ET-1免疫组化染色可见密集的阳性反应颗粒，提示它能合成ET-1。采用放免测定发现PASM可向培养基中分泌ET-1。缺氧对PASM细胞内的免疫组化染色无显著影响，却使其ET-1的分泌显著受抑制，mRNA斑点杂交发现缺氧促使PASM的ET-1mRNA表达显著减少。提示缺氧对PASM细胞内ET-1的含量无显著影响，但抑制PASM的ET-1向培养液释放及ET-1的mRNA的表达，这可能是缺氧性肺血管收缩和PASM增殖的一个制约因素。由于缺氧时PASM细胞活力无明显改变，ET-1分泌减少显然不是由于细胞数量或活力改变所引起。其它一些实验证实缺氧可刺激血管内皮细胞的ET-1表达和分泌[4]。说明血管内皮细胞与血管平滑肌细胞对缺氧的反应不同。推测缺氧可能通过其它机制而不是通过自分泌ET-1促使PASM增殖，即可能通过其它促增殖的因子分泌增多、抑制增殖的因子分泌减少或缺氧直接作用于细胞内的某些环节引起增殖，这需要进一步的实验证明。
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本实验观察到缺氧虽然可以导致培养的PASM增殖，但ETA受体的拮抗剂对其无抑制作用，而且缺氧也使PASM的ET-1的mRNA表达及ET-1自分泌减少。上述结果提示缺氧可抑制PASM的ET-1自分泌，ET-1自分泌不参与体外缺氧性PASM增殖。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270316)
作者简介：王培勇(1966.2)，男，山东省清城县人，博士，副教授，主要从事心血管病理生理学方面的研究，发表论文53篇。电话：(023)68752340
作者单位：孙秉庸(第三军医大学：高原军事医学系高原医学研究室、病理生理学教研室，重庆 400038)
参考文献
[1]Dzau V J,Gibbons G H.Vascular remodeling:Mechanisms and implications[J].J Cardiovasc Pharmacol,1993,21(Suppl):S1-S5.
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[2]王培勇，孙秉庸.缺氧对肺动脉平滑肌细胞胞内游离钙及环磷酸腺苷浓度的影响[J].第三军医大学学报，1995，17
[3]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Anal Biochem,1987,162(1):156-161.
[4]Kourembanas S,Marsden P A,McQuillan L P,et al.Hypoxia induced endothelin gene expression and secretion in cultured human endothelium[J].J Clin Invest,1991,88(3):1 054-1 060.
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[6]Scott B T,Resink T J,Hahn A W,et al.Induction of en-dothelin secret by AT Ⅱ :effects on growth and synthetic activity of VSMCs[J].J Cardiovasc Pharmacol,1991,17(S7):S96-S103.
[7]Resink T J,Hahn A W,Scott B T,et al.Inducible endothelin mRNA expression and peptide secreton in cultured human vascu-lar smooth muscle[J].Biochem Biophys Res Commun,1990,168 (3):1303-1309.
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[8]Kasuya H,Weir B K,White D M,et al.Mechanism of oxyhe-moglobin-induced release of ET-1 from cultured vascular endothe-lial cells and smooth muscle cells[J].J Neurosurg,1993,79(6):892-897.
[9]Takeda Y,Itoh Y,Yoncola T,et al.Cyclosporine A induces ET-1 release from cultured rat vascular smooth muscle cells[J].Eur J Pharmacol,1993,233(2～3)：299-305.(1)：11-13.
收稿日期：1998-09-30
修回日期：1999-07-12, 百拇医药
单位：王培勇(第三军医大学：高原军事医学系高原医学研究室、病理生理学教研室，重庆 400038)；刘健(附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；曾强(解放军总医院老年病研究所，北京 100853)；许蜀闽(第三军医大学：高原军事医学系高原医学研究室、病理生理学教研室，重庆 400038)；王俊元(第三军医大学：高原军事医学系高原医学研究室、病理生理学教研室，重庆 400038)
关键词：缺氧；肺动脉平滑肌细胞；内皮素-1
第三军医大学学报000125
提要 目的：缺氧能否通过影响血管平滑肌细胞血管活性肽的自分泌功能而参与缺氧性肺动脉高压的发生尚不明确，本实验在培养的新生小牛肺动脉平滑肌细胞(PASM)上探讨内皮素-1(ET-1)自分泌在其中的作用。方法：采用3H-TdR掺入研究PASM增殖，放免测定和斑点杂交技术研究ET-1的分泌和表达。结果：无氧培养(0%O2)24h使新生小牛肺动脉平滑肌细胞(PASM)的3H-TdR掺入与常氧组相比增加42.3%(P<0.001)，ETA受体拮抗剂BQ123(10-6mmol/L)使常氧培养的PASM的3H-TdR掺入降低47%(P<0.01)，但对缺氧培养条件下PASM的3H-TdR掺入无显著影响。采用放免测定发现，缺氧培养3～48h导致PASM的ET-1分泌降低非常显著(P<0.01)。斑点杂交显示，缺氧同样抑制PASM的ET-1的mRNA表达(P<0.01)。结论：ET-1参与常氧情况下PASM增殖的调节，而与缺氧引起的PASM过度增殖无关，缺氧可通过抑制PASM的ET-1mRNA的表达而抑制ET-1的合成和分泌。
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中图法分类号 R349.21；R845.22 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)01-0085-04
A study on proliferation and endothelin excretion of cultured pulmonary artery smooth muscle cells under anoxia
WANG Pei-yong,LIU Jian,ZENG Qiang,XU Shu-min,WANG Jun-yuan,SUN Bing-yong
(Department of pathophysiology,Faculty of High Altitude Medicine,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
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Abstract Objective:To explore the role of alterations of autocrine function of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMs) in the development of hypoxic pumonary hypertension (HPH).Methods:The effect of hypoxia on proliferation of cultured new born bovine PASMs and its relationship with endothelin-1 (ET-1) autocrine were investigated with 3H-TdR incorporation,immunochemistry,dotting hybridization and radioimmunoassay.Results:In response to hypoxia (0% O2) for 24 h,3H-TdR inorporation of PASMs increased significantly by 42% (P<0.001 compared with control group).ETA receptor inhibitor BQ123 (10-6 mmol/L) inhibited 3H-TdR incorporation by 47% (P<0.001) under normoxia,but exerted no effect under hypoxia condition.Immunochemistry showed positive staining of ET-1 in PSAM.ET-1 mRNA expression and ET-1 secretion decreased significantly when PSAMs were incubated under hypoxic condition from the 3rd to 48th h (P<0.01 vs control).Conclusion:ET-1 autocrine by PASMs regulates proloferation of themselves under nomoxia but not hypoxia.Hypoxia attenuates ET-1 synthesis and release by reducing ET-1 mRNA expression.
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Key words hypoxia; pulmonary artery smooth muscle cell; endothelin-1
急性和慢性缺氧均可导致肺动脉高压，肺血管床特别是肺小动脉平滑肌收缩和结构改建(Remodeling)是缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)形成和维持的基础，其中血管壁平滑肌增殖为其主要特征。尽管对其机制进行了大量研究，但仍有许多环节尚不明确。目前已知，除了血管内皮细胞分泌血管活性成份以旁分泌的方式调节血管平滑肌的舒缩和增殖外，血管平滑肌细胞本身也能以自分泌的方式产生许多血管活性成份[1]。研究表明，肺动脉内皮细胞通过旁分泌内皮素-1(Endothelin-1，ET-1)在HPH的发生中起重要作用，但缺氧能否通过影响平滑肌细胞自分泌ET-1而参与缺氧性肺血管收缩和结构改建尚未见报道。因此，本实验动态观察了缺氧对培养的小牛肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASM)ET-1自分泌的影响，并研究其变化的机制，以探讨平滑肌ET-1自分泌功能的改变在HPH发生中所起的作用。
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1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
胰蛋白酶(DIFICO，1∶250)，RPMI 1640(JR SCIENTI-FICINC.USA)，ETA受体拮抗剂BQ123和ET-1 cDNA及ET-1单克隆抗体(Penisula Lab,USA),ET-1测定试剂盒(北方免疫试剂研究所)，抑肽酶和地高辛配基标记与检测试剂盒(德国BoehringerMannheim)，无氧混合气(N2中含5%CO2，重庆气体制造厂)，3H-标记胸腺嘧啶核苷(中国原子能科学研究所)，S-P免疫组化染色试剂盒(福建迈新生物技术开发公司)，其它试剂均为国产或进口AR级。所用的培养器皿为COSTAR产品。
1.2 细胞培养
取新生小牛活杀后用5%CO2孵箱培养PASM[2]，培养成功后采用3～10代细胞进行试验。采用台盼蓝染色法鉴定细胞活力。取对数生长期的PASM，以104/cm2的密度传代接种于培养瓶后加入含20%小牛血清的RPMI1640培养2～3d，待细胞汇合成单层后换为含1%透析和灭活的贫血小板小牛血清的培养基，分组进行下述实验。
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1.3 3H-TdR掺入的增殖分析
PASM按每孔2万细胞接种于96孔培养板，长成单层后换含1%经透析和灭活的贫血小板血清RPMI1640培养基，将细胞分为下述各组：常氧组、缺氧组、常氧+BQ123组和缺氧+BQ123组。常氧组置21%O2的CO2孵箱培养；缺氧组置于缺氧培养箱内，通入无氧混合气，平衡后测定的氧浓度约为0.034%(0～0.7%，下同)。培养24h，最后6h加入3H-TdR(0.5μCi/孔)，收集细胞后用β-液体闪烁计仪(RackβLKB-1217，芬兰)测Bq。
1.4 ET-1的免疫组化染色
将PASM接种于24孔培养板内的玻片上，生长成层后换含1%经透析和灭活的贫血小板血清RPMI1640培养基，分常氧和无氧组，n=5。培养24h后，将细胞用4%多聚甲醛固定，应用S-P法进行ET-1免疫组化染色，以棕黄色为阳性。用真彩色医学图像分析系统(空军总医院CMIAS007)测其积分光密度(IOD)值，作为细胞内ET-1的相对含量。
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1.5 ET-1放免测定和ET-1mRNA斑点杂交
PASM按104/cm2细胞密度接种于3025培养瓶，培养方法同上。将细胞分为常氧组和缺氧组，缺氧方法同上。上述每组又分为1.5、3、6、12、24和48h等6个不同的时相点，以动态观察ET-1的分泌和表达变化。根据上述分组，取培养上清液按药盒说明书测定ET-1含量，将细胞用0.1%胰蛋白酶消化收集，用冷的PBS液(pH7.2)冲洗，离心后速冷于-196℃的液氮中保存备用。
1.5.1 PASM总RNA的提取 将液氮中冻存的PASM取出复融，按酚-氯仿-异硫氰酸胍法[3]略加改进提取RNA。所提的RNA溶于0.1%DEPC处理水中，应用UV-240多功能紫外分光光度仪(日本津岛)三复管测定各例总RNA的260nm、280nmD值和二者比值，结果D260/280比值均在1.8以上，RNA置-70℃冷冻备用。
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1.5.2 ET-1cDNA探针标记及斑点印迹杂交 将1.3kb人ET-1cDNA煮沸变性后，按照地高辛配基标记与检测试剂盒说明书，用地高辛配基随机引物法标记探针，并冷置备用。从每组PASM的RNA中分别取20μg，用样品稀释液(20×SSC∶37%甲醛=1∶1)稀释至10μl，65℃水浴15min使RNA充分变性后点于硝酸纤维素膜上，80℃真空烤膜2h。烤好的NC膜放入20ml预杂交液[50%甲酰胺、5×Denhardt、6×SSPE、0.1%十二烷酰肌氨酸纳(Sarcoayl)、0.02%SDS]中42℃震荡预杂交6h，将膜取出置入杂交液中(预杂交液成分加地高辛配基标记cDNA探针25ng/ml及经超声打碎热变性的鲑鱼精DNA100μg/ml)42℃杂交24～36h。杂交后的NC膜按地高辛配基标记与检测试剂盒说明进行洗膜、10×Denhardt封阻，之后与抗地高辛抗体(1∶5000)于37℃反应30min，再漂洗去多余抗体后进行显色。终止显色，湿膜用薄层色谱扫描仪(CS-910日本岛津)和图像分析仪(C-RIB日本岛津)进行光密度扫描和分析，测定积分光密度代表mRNA相对含量。所得数据以相对于常氧的百分比(100%)表示，求3次试验的均值。
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1.6 统计学分析
所得数据采用多因素(Super ANOVA)方差分析，结果以
表示，做方差保护下的最小差值显著性检验。2 结果
2.1 ET-1免疫组化染色
缺氧6～48h后，相差显微镜下观察PASM的形态无显著变化，台盼蓝染色表明细胞活力均大于95%。21%O2组PASM的ET-1染色可见密集的阳性反应颗粒，呈黄褐色，与0%O2组PASM胞浆内ET-1染色阳性反应相似。两组呈阳性反应的细胞数占该组细胞总数的90%以上。图像分析结果表明常氧24h细胞ET-1免疫组化染色积分光密度值(IOD)与无氧组差异不显著(积分光密度值分别为3747.23±1352.9和3854.21±958.38，P>0.05)。见图1。
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图1 培养的肺动脉平滑肌细胞ET-1免疫组织化学染色 (S-P×250) A：21%O2+5%CO2； B:0%O2+5%CO2
Fig1 Endothelin-1 immunohistochemistry staining in pulmonary arterial smooth muscle cells cultured in normoxic (A) and hypoxic (B) conditions (S-P×250)
2.2 缺氧对PASM细胞ET-1自分泌的影响
培养的PASM细胞的ET-1分泌速度于3～6h达高峰，12h后随培养时间的延长而逐渐降低。缺氧情况下，ET-1分泌显著减少，其减少的程度与孵育时间有关，缺氧3～6hET-1分泌约降低58%～66%(P<0.001)；缺氧12～48hET-1分泌约降低15%～33%(P<0.01)。见图2。
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图2 缺氧对PASM自分泌ET-1的影响(n=3)
Fig2 Effect of hypoxia on ET-1 autocrine by PASM(n=3)
*:P<0.01,**：P<0.001 vs 21%O2
2.3 缺氧对PASM的ET-1mRNA表达的影响
斑点杂交显示，缺氧使PASM的ET-1的mRNA表达显著受抑制(P<0.01)。见图3。
图3 缺氧对PASM的ET-1mRNA表达的影响(n=3)
Fig3 Effect of hypoxia on ET-1 mRNA expression in PASM
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(n=3) *：P<0.01 vs 21%O2
2.4 ETA受体拮抗剂BQ123对PASM增殖的影响
常氧培养的PASM于培养基中加入10-3mmol/L的BQ123培养24h，其3H-TdR掺入显著减少，约减少47%(P<0.001)，缺氧(0%O2)培养条件下培养24h后，PASM的3H-TdR掺入显著增多，与常氧组相比约增加42%(P<0.001)，缺氧培养的PASM加入10-3mmol/L的BQ123，其3H-TdR掺入与缺氧组相比无显著变化。见图4。
图4 ETA受体拮抗剂BQ123对常氧和缺氧PASM
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增殖的影响(n=5)
Fig4 Effect of 10-3mmol/L BQ123,ETA receptor
inhibitor on PASM proliferation under normoxia
and hypoxia(n=5)*:P<0.001 vs 21%O2-BQ123 group;**：P<0.001 vs 21%O2 groups
3 讨论
通常认为血管内皮细胞调节血管平滑肌细胞舒缩和增殖，前者是调节细胞，后者是效应细胞。但近年来许多研究表明，许多由内皮细胞分泌的活性调节成份也可以由平滑肌分泌[1]。肺血管平滑肌细胞在缺氧条件下的增生及收缩反应增强是导致肺血管壁增厚、非肌性血管肌化是肺动脉高压的重要条件之一，但其发生机制仍不十分清楚。肺血管平滑肌的舒缩和增殖调节失常是HPH发生和发展的基础，我们推测缺氧可能通过影响PASM血管活性物质的自分泌或旁分泌而参与上述过程。ET-1是迄今发现的最强的内源性血管收缩肽，且对血管平滑肌细胞(VSMC)具有强的丝裂原作用，它可以由多种组织和细胞表达和分泌。文献[4，5]报道缺氧可引起血管内皮细胞及肺组织ET-1表达增加，而ET-1的主要靶细胞是VSMC，ET-1通过与其膜上的ETA受体结合发挥生物效应。部分研究表明，血管平滑肌能分泌和表达ET-1。Resink等[6，7]发现，培养的人血管平滑肌细胞在血管紧张素Ⅱ、血管加压素(AVP)、转化生长因子、血小板源性生长因子-AA等刺激下可分泌生理效应浓度的ET-1。在培养的大鼠主动脉平滑肌细胞发现分泌的ET-1较内皮细胞低30倍，它可由氧化血红蛋白所诱导[8]。Cyclosporine A也刺激培养的平滑肌细胞分泌ET-1[9]。ET-1是肺血管结构张力的重要自分泌/旁分泌调节因子。但PASM的ET-1自分泌及其表达在缺氧时有何改变尚未见报道。
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我们的实验发现，缺氧PASM的3H-TdR掺入升高，ET-1的A受体拮抗剂BQ123显著抑制常氧时3H-TdR掺入，而对缺氧PASM的3H-TdR掺入增加则无显著抑制作用。表明常氧情况下，PASM的ET-1自分泌参与其自身增殖的调节，但缺氧时ET-1自分泌对其增殖无显著影响。进一步实验证明PASM细胞内ET-1免疫组化染色可见密集的阳性反应颗粒，提示它能合成ET-1。采用放免测定发现PASM可向培养基中分泌ET-1。缺氧对PASM细胞内的免疫组化染色无显著影响，却使其ET-1的分泌显著受抑制，mRNA斑点杂交发现缺氧促使PASM的ET-1mRNA表达显著减少。提示缺氧对PASM细胞内ET-1的含量无显著影响，但抑制PASM的ET-1向培养液释放及ET-1的mRNA的表达，这可能是缺氧性肺血管收缩和PASM增殖的一个制约因素。由于缺氧时PASM细胞活力无明显改变，ET-1分泌减少显然不是由于细胞数量或活力改变所引起。其它一些实验证实缺氧可刺激血管内皮细胞的ET-1表达和分泌[4]。说明血管内皮细胞与血管平滑肌细胞对缺氧的反应不同。推测缺氧可能通过其它机制而不是通过自分泌ET-1促使PASM增殖，即可能通过其它促增殖的因子分泌增多、抑制增殖的因子分泌减少或缺氧直接作用于细胞内的某些环节引起增殖，这需要进一步的实验证明。
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本实验观察到缺氧虽然可以导致培养的PASM增殖，但ETA受体的拮抗剂对其无抑制作用，而且缺氧也使PASM的ET-1的mRNA表达及ET-1自分泌减少。上述结果提示缺氧可抑制PASM的ET-1自分泌，ET-1自分泌不参与体外缺氧性PASM增殖。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270316)
作者简介：王培勇(1966.2)，男，山东省清城县人，博士，副教授，主要从事心血管病理生理学方面的研究，发表论文53篇。电话：(023)68752340
作者单位：孙秉庸(第三军医大学：高原军事医学系高原医学研究室、病理生理学教研室，重庆 400038)
参考文献
[1]Dzau V J,Gibbons G H.Vascular remodeling:Mechanisms and implications[J].J Cardiovasc Pharmacol,1993,21(Suppl):S1-S5.
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[2]王培勇，孙秉庸.缺氧对肺动脉平滑肌细胞胞内游离钙及环磷酸腺苷浓度的影响[J].第三军医大学学报，1995，17
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[4]Kourembanas S,Marsden P A,McQuillan L P,et al.Hypoxia induced endothelin gene expression and secretion in cultured human endothelium[J].J Clin Invest,1991,88(3):1 054-1 060.
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[7]Resink T J,Hahn A W,Scott B T,et al.Inducible endothelin mRNA expression and peptide secreton in cultured human vascu-lar smooth muscle[J].Biochem Biophys Res Commun,1990,168 (3):1303-1309.
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[9]Takeda Y,Itoh Y,Yoncola T,et al.Cyclosporine A induces ET-1 release from cultured rat vascular smooth muscle cells[J].Eur J Pharmacol,1993,233(2～3)：299-305.(1)：11-13.
收稿日期：1998-09-30
修回日期：1999-07-12, 百拇医药