应用40条引物进行不同品系小鼠RAPD遗传检测的初步研究
作者：吴开平 魏泓
单位：吴开平(第三军医大学实验动物中心，重庆 400038)；魏泓(第三军医大学实验动物中心，重庆 400038)
关键词：RAPD；遗传检测
第三军医大学学报000121
提要 目的：探讨运用RAPD-PCR对小鼠进行遗传检测的可能性，筛选在各品系小鼠间具有多态性的引物。方法：运用40条引物对TA1、BALB/c、KM、NIH、SCID、T739、DBA/2、615、BALB/c-nu/nu等9个品系小鼠的DNA进行RAPD-PCR扩增，以琼脂糖凝胶电泳观察结果。结果：40条引物中只筛选出2条多态性引物，其它38条引物扩增结果无品系间多态性。结论：RAPD-PCR方法可以区分9个品系的小鼠，是一种适宜于小鼠的遗传检测方法。
中图法分类号 R394-3 文献标识码 A
, 百拇医药
文章编号：1000-5404(2000)01-0072-03
Preliminary study of genetic monitoring of various strains of mouse with RAPD-PCR using 40 single primers
WU Kai-ping,WEI Hong
(Center of Laboratory Animals,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Objective:To assess the possibility of genetic monitoring of various strains of mouse with RAPD-PCR using 40 single primers.Methods:The DNA of 9 strains of mouse including TA1,BALB/c,KM,NIH,SCID,T739,DBA/2,615 and BALB/c-nu/nu was amplified with RAPD-PCR using 40 single primers.The PCR products were resolved with electrophoresis on agarose gel and stained with ethidium bromide.Results:2 of the 40 single primers resulted in high polymorphism and all the other primers produced monomorphic amplification products in 9 mouse strains.Conclusion:RAPD-PCR is an effective technique to proceed genetic monitoring on mice since it is able to distinguish the genetic properties of 9 strains of mouse.
, 百拇医药
Key words RAPD;genetic monitoring
实验动物质量直接影响到医学生物学研究中动物实验结果的准确性、重复性和科学性。遗传检测是保证实验动物遗传质量的重要措施。目前常规实验动物遗传质量检测方法主要有免疫标志监测(皮肤移植试验，肿瘤移植，混合淋巴细胞培养等)、生化标本检测、形成特征检测(下颌骨形态分析，毛色基因测试)等[1，2]。上述方法主要是利用遗传基因的表型特征进行检测，存在着精确度不高，检测位点及反映遗传概貌有限等局限性。现代分子生物学技术可以直接对遗传基因DNA分子进行检测，这使实验动物遗传质量检测进入一个新领域。近年来已有大量应用RAPD-PCR研究物种遗传多样性的报道[3～9]，但对小鼠遗传检测的研究较少[10]，本实验应用40条引物对9个品系的小鼠进行RAPD-PC，分析比较了各品系小鼠的RAPD的谱带，筛选了具有多态性的引物。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物
TA1、BALB/c、BALB/c-nu/nu、SCID、T739、DBA/2、615近交系小鼠和KM、NIH封闭群小鼠各5只，由第三军医大学实验动物中心提供。
1.2 试剂
10×buffer、Taq酶、Mg2+、dNTP均为德国BM公司产品。
1.3 引物
购自美国Operon Technologies公司两套试剂盒Primer kits for RAPDs AB-0320-Kit4、AB-0320-Kit5，每套试剂盒含20条引物，共40条，引物编号及序列见表1。
表1 40条RAPD引物编号及序列
, 百拇医药
Tab1 The number and sequence of 40 RAPD primers No
Sequence
No
Sequence
AB4-01
GGCACGTAAG
AB4-11
GACAGGAGGT
AB4-02
ACGTAGCGTC
AB4-12
, 百拇医药
CAGTGCTGTG
AB4-03
GTGTTGCTAC
AB4-13
GTCAGAGTCC
AB4-04
AAGTCCGCTC
AB4-14
ACCATGGCTC
AB4-05
CCCAGTCACT
AB4-15
, 百拇医药
TGGCGTCCTT
AB4-06
CCACGGGAAG
AB4-16
TCGGCGGTTC
AB4-07
CAGCACTGAC
AB4-17
CCCTTATGCC
AB4-08
CCTCCAGTGT
AB4-18
, 百拇医药
CTCGCTACC
AB4-09
TCCCACGCAA
AB4-19
GGTGCACGTT
AB4-10
TCAGAGCGCC
AB4-20
ACACACGCTG
AB4-01
GGGCCACTCA
AB4-11
, 百拇医药
TTCCCCGCGA
AB4-02
GGAGAGACTC
AB4-12
GGGTGTGTAC
AB4-03
TCCACTCCTG
AB4-13
AGGACTGCCA
AB4-04
CACAGAGGGA
AB4-14
, 百拇医药
AATGCCGCGA
AB4-05
GGGTTTGGCA
AB4-15
GGATGCCACT
AB4-06
CAAGGGCAGA
AB4-16
GGTGAACGCT
AB4-07
GGCAGGCTGT
AB4-17
, http://www.100md.com
CCAACGTCGT
AB4-08
AACGGCGCA
AB4-18
GATGCCAGAC
AB4-09
CACCCTGAG
AB4-19
GTCCGTATGC
AB4-10
CCTTCGGAAG
AB4-20
, 百拇医药
GACCAATGCC
1.4 基因组DNA制备
取小鼠尾部组织100mg剪碎，加入DNA抽提缓冲液(10mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,1.0%SDS,200μg/ml蛋白酶K，10mmol/LNaCl,pH8.0)混合均匀，置56℃至完全消化，然后按常规方法提取DNA，DNA晾干后，加入适当体积TE缓冲液(10mol/LTris-HCl，pH8.0,1mmol/LEDTA)溶解，保存于4℃备用。
1.5 RAPD-PCR反应体系及扩增程序
25μl的反应体系中含有10×buffer、2.5mmol/LdNTP50μmol/L、Mg2+3mmol/L、引物为0.2μmol/L模板DNA、25ngTaq酶2U，反应混合物用20μl石蜡油覆盖，反应过程包括40个循环，每个循环包括94°C变性1min，39°C退火1min，72°C延伸2min，最后一次循环后于72°C延伸10min，首次循环于94°C预变性2min。扩增片段用1.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)电泳2.5h，紫外灯下观察结果，比较扩增谱带、拍照、筛选具有多态性引物。
, 百拇医药
2 结果
以40条引物对9个品系小鼠DNA进行RAPD-PCR扩增发现两条引物在9个品系中具有很好的多态性，见图1。图1中在695bp⑤⑦⑧比其它品系少1条扩增带，在515～695bp间⑤比⑦⑧多1条扩增带，在994bp处⑧比⑦少1条扩增带，表明T739、NIH、DBA/2与9个品系中的任意一种都有差异，在略小于695bp处①③④比②⑥⑨少1条扩增带，在994bp处②比⑥⑨多1条扩增带，表明TA1、BALB/c-nu/nu、KM与BALB/c及SCID、6153组之间差异均显著。其它38条引物在各品系小鼠的DNA扩增带差异不显著，表明这些引物没有品系间多态性，见图2。
图1 AB5-11引物扩增9品系小鼠结果
, 百拇医药
1～9：TA1、BALB/c、KM、BALB/c-nu/nu、NIH、SCID、T739、DBA/2、615小鼠；M：分子量标志
Fig1 Results of amplification of DNA of 9 mouse
strains with RAPD analysis using primer AB5-11
Lanes 1～9:Mouses rains TA1 BALB/c,KM,BALB/c-nu/nu,NIH,SCID,T739,DBA/2,615;M:Marker
, http://www.100md.com 图2 AB4-4引物扩增9品系小鼠结果
1～9：TA1、BALB/c、KM、BALB/c-nu/nu、NIH、SCID、T739、DBA/2、615小鼠；M：分子量标志
Fig2 Results of amplification of DNA of 9 mouse
strains with RAPD analysis using primer AB4-4
Lanes 1～9:Mouse strains TA1 BALB/c,KM,BALB/c-nu/nu,NIH,SCID,T739,DBA/2,615;M:Marker
3 讨论
由于所取各品系小鼠亲缘关系非常近，所以40条引物中绝大部分引物扩增出的结果差异不显著，只有2条引物扩增结果出现多态性，40条引物只筛选出2条多态性引物，这也与所取小鼠群体变异非常相一致。
, 百拇医药
实验结果也表明不能随意将一般的RAPD引物应用于各品系小鼠遗传检测，必须进行大量的实验，从众多的随机引物中筛选具有多态性的特异引物，只有运用这种特异引物，进行RAPD-PCR，并建立其检测标准，才能使该技术真正应用于小鼠的遗传检测。
各品系小鼠RAPD谱带的差异，是其遗传背景差异的反映，虽然小鼠品系之间亲缘关系非常近，遗传背景上的差异远远低于动物种属间的差异，但是通过大量随机序列引物的RAPD-PCR，各品系小鼠基因组间的细微差异仍可被反应出来，这表明RAPD-PCR方法适宜于小鼠遗传检测。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600079)；全军“九五”医药卫生科研基金资助项目(96M038)
作者简介：吴开平(1976.6)，男，安徽省肥东县人，助教，主要从事动物分子遗传学方面的研究。电话：(023)68752053
, 百拇医药
参考文献
[1]魏泓.医学实验动物学[M].成都：四川科学技术出版社，1998.52-55.
[2]张德富.实验动物遗传监测进展[J].实验动物和动物实验，1993，5(2)：25-30.
[3]陈永久，张亚平.随机扩增多态DNA影响因素的研究[J].动物学研究，1997，18(2)：221-227.
[4]张春铃，陈元霖，桂慕燕，等.蓖麻蛋DNA导入家蚕引起遗传变异的研究[J].遗传，1998，20(3)：1-4.
[5]王文，兰宏，宿兵，等.云南4个少数民族的随机扩增多态DNA分析[J].科学通报，1994，39(2)：1900-1903.
[6]刘恩歧，张薇，徐仓宝，等.RAPD技术在实验动物学研究中的应用[J].实验动物科学与管理，1997，14(4)：57-60.
, http://www.100md.com
[7]薛国雄，刘棘，刘洁.三江水系草鱼种群RAPD分析[J].中国水产科学，1998，5(1)：1-5.
[8]Chalmers K J,Waugh R.Detection of genetic variation between and within population of gliricidia sepium and G,maculata,using RAPD Markers[J].Heredity,1996,69(3):465-472.
[9]Welsh J,Petersen C,Mcclelland M.Polymorphisms generated by arbitrarily primed PCR in the mouse:application to strain identification and genetic mapping[J].Nucleic Acids Res,1991,19(2):303-306.
[10]张文艳，龚春梅，魏云林，等.一种新的近交系实验动物遗传监测方法及小鼠性别相关RAPD标记的发现[J].实验生物学报，1996，29(4)：59-69.
收稿日期：1999-03-03
修回日期：1999-09-31, 百拇医药
单位：吴开平(第三军医大学实验动物中心，重庆 400038)；魏泓(第三军医大学实验动物中心，重庆 400038)
关键词：RAPD；遗传检测
第三军医大学学报000121
提要 目的：探讨运用RAPD-PCR对小鼠进行遗传检测的可能性，筛选在各品系小鼠间具有多态性的引物。方法：运用40条引物对TA1、BALB/c、KM、NIH、SCID、T739、DBA/2、615、BALB/c-nu/nu等9个品系小鼠的DNA进行RAPD-PCR扩增，以琼脂糖凝胶电泳观察结果。结果：40条引物中只筛选出2条多态性引物，其它38条引物扩增结果无品系间多态性。结论：RAPD-PCR方法可以区分9个品系的小鼠，是一种适宜于小鼠的遗传检测方法。
中图法分类号 R394-3 文献标识码 A
, 百拇医药
文章编号：1000-5404(2000)01-0072-03
Preliminary study of genetic monitoring of various strains of mouse with RAPD-PCR using 40 single primers
WU Kai-ping,WEI Hong
(Center of Laboratory Animals,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Objective:To assess the possibility of genetic monitoring of various strains of mouse with RAPD-PCR using 40 single primers.Methods:The DNA of 9 strains of mouse including TA1,BALB/c,KM,NIH,SCID,T739,DBA/2,615 and BALB/c-nu/nu was amplified with RAPD-PCR using 40 single primers.The PCR products were resolved with electrophoresis on agarose gel and stained with ethidium bromide.Results:2 of the 40 single primers resulted in high polymorphism and all the other primers produced monomorphic amplification products in 9 mouse strains.Conclusion:RAPD-PCR is an effective technique to proceed genetic monitoring on mice since it is able to distinguish the genetic properties of 9 strains of mouse.
, 百拇医药
Key words RAPD;genetic monitoring
实验动物质量直接影响到医学生物学研究中动物实验结果的准确性、重复性和科学性。遗传检测是保证实验动物遗传质量的重要措施。目前常规实验动物遗传质量检测方法主要有免疫标志监测(皮肤移植试验，肿瘤移植，混合淋巴细胞培养等)、生化标本检测、形成特征检测(下颌骨形态分析，毛色基因测试)等[1，2]。上述方法主要是利用遗传基因的表型特征进行检测，存在着精确度不高，检测位点及反映遗传概貌有限等局限性。现代分子生物学技术可以直接对遗传基因DNA分子进行检测，这使实验动物遗传质量检测进入一个新领域。近年来已有大量应用RAPD-PCR研究物种遗传多样性的报道[3～9]，但对小鼠遗传检测的研究较少[10]，本实验应用40条引物对9个品系的小鼠进行RAPD-PC，分析比较了各品系小鼠的RAPD的谱带，筛选了具有多态性的引物。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物
TA1、BALB/c、BALB/c-nu/nu、SCID、T739、DBA/2、615近交系小鼠和KM、NIH封闭群小鼠各5只，由第三军医大学实验动物中心提供。
1.2 试剂
10×buffer、Taq酶、Mg2+、dNTP均为德国BM公司产品。
1.3 引物
购自美国Operon Technologies公司两套试剂盒Primer kits for RAPDs AB-0320-Kit4、AB-0320-Kit5，每套试剂盒含20条引物，共40条，引物编号及序列见表1。
表1 40条RAPD引物编号及序列
, 百拇医药
Tab1 The number and sequence of 40 RAPD primers No
Sequence
No
Sequence
AB4-01
GGCACGTAAG
AB4-11
GACAGGAGGT
AB4-02
ACGTAGCGTC
AB4-12
, 百拇医药
CAGTGCTGTG
AB4-03
GTGTTGCTAC
AB4-13
GTCAGAGTCC
AB4-04
AAGTCCGCTC
AB4-14
ACCATGGCTC
AB4-05
CCCAGTCACT
AB4-15
, 百拇医药
TGGCGTCCTT
AB4-06
CCACGGGAAG
AB4-16
TCGGCGGTTC
AB4-07
CAGCACTGAC
AB4-17
CCCTTATGCC
AB4-08
CCTCCAGTGT
AB4-18
, 百拇医药
CTCGCTACC
AB4-09
TCCCACGCAA
AB4-19
GGTGCACGTT
AB4-10
TCAGAGCGCC
AB4-20
ACACACGCTG
AB4-01
GGGCCACTCA
AB4-11
, 百拇医药
TTCCCCGCGA
AB4-02
GGAGAGACTC
AB4-12
GGGTGTGTAC
AB4-03
TCCACTCCTG
AB4-13
AGGACTGCCA
AB4-04
CACAGAGGGA
AB4-14
, 百拇医药
AATGCCGCGA
AB4-05
GGGTTTGGCA
AB4-15
GGATGCCACT
AB4-06
CAAGGGCAGA
AB4-16
GGTGAACGCT
AB4-07
GGCAGGCTGT
AB4-17
, http://www.100md.com
CCAACGTCGT
AB4-08
AACGGCGCA
AB4-18
GATGCCAGAC
AB4-09
CACCCTGAG
AB4-19
GTCCGTATGC
AB4-10
CCTTCGGAAG
AB4-20
, 百拇医药
GACCAATGCC
1.4 基因组DNA制备
取小鼠尾部组织100mg剪碎，加入DNA抽提缓冲液(10mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,1.0%SDS,200μg/ml蛋白酶K，10mmol/LNaCl,pH8.0)混合均匀，置56℃至完全消化，然后按常规方法提取DNA，DNA晾干后，加入适当体积TE缓冲液(10mol/LTris-HCl，pH8.0,1mmol/LEDTA)溶解，保存于4℃备用。
1.5 RAPD-PCR反应体系及扩增程序
25μl的反应体系中含有10×buffer、2.5mmol/LdNTP50μmol/L、Mg2+3mmol/L、引物为0.2μmol/L模板DNA、25ngTaq酶2U，反应混合物用20μl石蜡油覆盖，反应过程包括40个循环，每个循环包括94°C变性1min，39°C退火1min，72°C延伸2min，最后一次循环后于72°C延伸10min，首次循环于94°C预变性2min。扩增片段用1.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)电泳2.5h，紫外灯下观察结果，比较扩增谱带、拍照、筛选具有多态性引物。
, 百拇医药
2 结果
以40条引物对9个品系小鼠DNA进行RAPD-PCR扩增发现两条引物在9个品系中具有很好的多态性，见图1。图1中在695bp⑤⑦⑧比其它品系少1条扩增带，在515～695bp间⑤比⑦⑧多1条扩增带，在994bp处⑧比⑦少1条扩增带，表明T739、NIH、DBA/2与9个品系中的任意一种都有差异，在略小于695bp处①③④比②⑥⑨少1条扩增带，在994bp处②比⑥⑨多1条扩增带，表明TA1、BALB/c-nu/nu、KM与BALB/c及SCID、6153组之间差异均显著。其它38条引物在各品系小鼠的DNA扩增带差异不显著，表明这些引物没有品系间多态性，见图2。
图1 AB5-11引物扩增9品系小鼠结果
, 百拇医药
1～9：TA1、BALB/c、KM、BALB/c-nu/nu、NIH、SCID、T739、DBA/2、615小鼠；M：分子量标志
Fig1 Results of amplification of DNA of 9 mouse
strains with RAPD analysis using primer AB5-11
Lanes 1～9:Mouses rains TA1 BALB/c,KM,BALB/c-nu/nu,NIH,SCID,T739,DBA/2,615;M:Marker
, http://www.100md.com 图2 AB4-4引物扩增9品系小鼠结果
1～9：TA1、BALB/c、KM、BALB/c-nu/nu、NIH、SCID、T739、DBA/2、615小鼠；M：分子量标志
Fig2 Results of amplification of DNA of 9 mouse
strains with RAPD analysis using primer AB4-4
Lanes 1～9:Mouse strains TA1 BALB/c,KM,BALB/c-nu/nu,NIH,SCID,T739,DBA/2,615;M:Marker
3 讨论
由于所取各品系小鼠亲缘关系非常近，所以40条引物中绝大部分引物扩增出的结果差异不显著，只有2条引物扩增结果出现多态性，40条引物只筛选出2条多态性引物，这也与所取小鼠群体变异非常相一致。
, 百拇医药
实验结果也表明不能随意将一般的RAPD引物应用于各品系小鼠遗传检测，必须进行大量的实验，从众多的随机引物中筛选具有多态性的特异引物，只有运用这种特异引物，进行RAPD-PCR，并建立其检测标准，才能使该技术真正应用于小鼠的遗传检测。
各品系小鼠RAPD谱带的差异，是其遗传背景差异的反映，虽然小鼠品系之间亲缘关系非常近，遗传背景上的差异远远低于动物种属间的差异，但是通过大量随机序列引物的RAPD-PCR，各品系小鼠基因组间的细微差异仍可被反应出来，这表明RAPD-PCR方法适宜于小鼠遗传检测。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600079)；全军“九五”医药卫生科研基金资助项目(96M038)
作者简介：吴开平(1976.6)，男，安徽省肥东县人，助教，主要从事动物分子遗传学方面的研究。电话：(023)68752053
, 百拇医药
参考文献
[1]魏泓.医学实验动物学[M].成都：四川科学技术出版社，1998.52-55.
[2]张德富.实验动物遗传监测进展[J].实验动物和动物实验，1993，5(2)：25-30.
[3]陈永久，张亚平.随机扩增多态DNA影响因素的研究[J].动物学研究，1997，18(2)：221-227.
[4]张春铃，陈元霖，桂慕燕，等.蓖麻蛋DNA导入家蚕引起遗传变异的研究[J].遗传，1998，20(3)：1-4.
[5]王文，兰宏，宿兵，等.云南4个少数民族的随机扩增多态DNA分析[J].科学通报，1994，39(2)：1900-1903.
[6]刘恩歧，张薇，徐仓宝，等.RAPD技术在实验动物学研究中的应用[J].实验动物科学与管理，1997，14(4)：57-60.
, http://www.100md.com
[7]薛国雄，刘棘，刘洁.三江水系草鱼种群RAPD分析[J].中国水产科学，1998，5(1)：1-5.
[8]Chalmers K J,Waugh R.Detection of genetic variation between and within population of gliricidia sepium and G,maculata,using RAPD Markers[J].Heredity,1996,69(3):465-472.
[9]Welsh J,Petersen C,Mcclelland M.Polymorphisms generated by arbitrarily primed PCR in the mouse:application to strain identification and genetic mapping[J].Nucleic Acids Res,1991,19(2):303-306.
[10]张文艳，龚春梅，魏云林，等.一种新的近交系实验动物遗传监测方法及小鼠性别相关RAPD标记的发现[J].实验生物学报，1996，29(4)：59-69.
收稿日期：1999-03-03
修回日期：1999-09-31, 百拇医药