哮喘CD4、CD8T细胞凋亡的变化
作者：林科雄 王长征 钱桂生
单位：林科雄(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；王长征(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：哮喘；T细胞；凋亡
第三军医大学学报000140
中图法分类号 R329.25;R562.25 文献标识码 B
文章编号：1000-5404(2000)01-0099-01
Apoptosis of CD4,CD8 T cells in asthma
, 百拇医药 活化的T细胞通过分泌IL-3、IL-5、GM-CSF促进嗜酸性细胞(EOS)的分化、活化、存活延长及气道内募集[1]，在哮喘气道炎症的发病中起重要的调控作用。本研究采用免疫细胞化学(ICC)S-AP法与3'末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)双标染色，对哮喘豚鼠外周血CD4、CD8T细胞凋亡进行检测，观察哮喘T细胞亚群凋亡的变化。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。小鼠抗人CD4、CD8单克隆抗体及T淋巴细胞亚群检测试剂盒购自北京中山公司。卵蛋白(OA)购自上海生化试剂公司。原位细胞凋亡试剂盒为宝灵曼公司产品。
1.2 哮喘豚鼠模型的制备及PBMCs的分离
采用OA致敏和激发建立豚鼠哮喘模型。体重400～500g豚鼠，雌雄不分，分为正常对照组、哮喘组，每组6只。第1天腹腔内注射2%OA氢氧化铝凝胶1ml，第8天重复注射1次加强致敏，第21天吸入2%OA生理盐水激发哮喘发作，吸入前腹腔内注射苯海拉明5mg/kg体重。对照组以生理盐水代替2%OA，其余步骤不变。豚鼠激发48h后抽取外周血，用淋巴细胞分离液的密度梯度离心分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)，涂片，4%多聚甲醛固定30min。
, 百拇医药
1.3 CD4、CD8T细胞凋亡检测
通过CD4、CD8ICC与TUNEL双标染色进行检测。主要步骤如下：PBS(pH7.2)漂洗。加入小鼠抗大鼠CD4或CD8单克隆抗体(稀释度：1：100)20μl/片，37℃，1h。PBS漂洗。加入二抗37℃，1h，PBS漂洗。加入三抗37℃，1h，PBS漂洗。0.1%TritonX-100,4℃通透2min，PBS漂洗。0.03%H2O2/0.01%NaN3封闭30min，PBS漂洗。加入TUNEL反应混合液20μl/片，37℃反应1h，PBS漂洗。加入过氧化物酶标记的抗荧光素抗体20μl/片，37℃反应30min，PBS漂洗。0.05%DAB/0.01%H2O2显色，PBS漂洗。BCIP/NBT显色。
1.4 记数
高倍光镜下计数双染细胞。随机选择视野，至少观察200个细胞以上，分别计数CD4、CD8T细胞凋亡率。
, 百拇医药
1.5 统计学分析
CD4、CD8T细胞凋亡率以
表示，采用非配对t检验。
2 结果
在光学显微镜下观察，单纯凋亡阳性细胞胞核被染成棕黄色,单纯ICC阳性细胞胞膜被染成紫蓝色,ICC和TUNEL双染阳性细胞可见胞核被染成棕黄色,胞膜被染成紫蓝色。哮喘组豚鼠CD4T细胞凋亡率显著低于正常组(P<0.05),而CD8T细胞凋亡率与正常组差别不显著(P>0.05)。
3 讨论
无论是特应性还是非特应性哮喘，气道内及外周血中活化的(CD25+)T细胞增加，表达IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSFmRNA增加，而且其细胞数与EOS数及哮喘严重程度及气道高反应性显著相关[1]。因此，CD4T细胞在哮喘的发病中起重要作用。通过对哮喘豚鼠外周血CD4T细胞凋亡检测，我们发现哮喘豚鼠CD4T细胞凋亡率显著低于正常组。在免疫系统中，活化的T细胞通过凋亡被清除，对维持外周T细胞稳态、调节免疫反应的强度和持续时间起重要作用，是机体对外源性抗原或自身抗原产生免疫耐受的重要机制之一[2]。因此，哮喘CD4T细胞凋亡减少，可能反映了哮喘CD4T细胞的活化增强，是哮喘免疫耐受异常的机制之一。CD8T细胞在一定条件下也能分泌IL-4、IL-5等Th2细胞因子[3]。从特应性患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中制备的CD8T细胞系分泌IL-5、IL-4显著高于非特应性哮喘患者[4]。因此，CD8T细胞也可能参与哮喘的发病。但我们研究结果显示，OA诱导的哮喘豚鼠外周血CD8T细胞凋亡率同正常对照组相比差异不显著。所以，CD8T细胞与哮喘的发病的关系有待更多的研究阐明。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870946)
作者简介：林科雄(1969.5)，男，贵州省织金县人，博士研究生，主治医师，主要从事哮喘气道炎症的免疫机制方面的研究，发表论文1篇。电话：(023)68755320
参考文献
[1]Haczku A.T cells and eosinophils in asthma[J].Acta Microbiol Immunol Hung， 1998， 45(1):19-29.
[2]Critchfield J M,Racke M K,Zuniga-Pfucker J C,et al.T cells deletion in high antigen dose therapy of autoimmune en-cephalomyelitis[J].Science，1994,263(5150):1139-1144.
, 百拇医药
[3]Jerb K，Le Gros G.The role of Th2 type CD4+ T cells and Th2 type CD8+T cells in asthma[J].Immunol Cell Biol，1996,74(2):206-208.
[4]Stomciu L A,Shute J,Promwong C,et al.Increased levels of IL-4 in CD8+ T cells in atopic asthma[J].J Allergy Clin Im-munol，1997,100(3):373-378.
收稿日期：1999-07-21
修回日期：1999-12-29, 百拇医药
单位：林科雄(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；王长征(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：哮喘；T细胞；凋亡
第三军医大学学报000140
中图法分类号 R329.25;R562.25 文献标识码 B
文章编号：1000-5404(2000)01-0099-01
Apoptosis of CD4,CD8 T cells in asthma
, 百拇医药 活化的T细胞通过分泌IL-3、IL-5、GM-CSF促进嗜酸性细胞(EOS)的分化、活化、存活延长及气道内募集[1]，在哮喘气道炎症的发病中起重要的调控作用。本研究采用免疫细胞化学(ICC)S-AP法与3'末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)双标染色，对哮喘豚鼠外周血CD4、CD8T细胞凋亡进行检测，观察哮喘T细胞亚群凋亡的变化。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。小鼠抗人CD4、CD8单克隆抗体及T淋巴细胞亚群检测试剂盒购自北京中山公司。卵蛋白(OA)购自上海生化试剂公司。原位细胞凋亡试剂盒为宝灵曼公司产品。
1.2 哮喘豚鼠模型的制备及PBMCs的分离
采用OA致敏和激发建立豚鼠哮喘模型。体重400～500g豚鼠，雌雄不分，分为正常对照组、哮喘组，每组6只。第1天腹腔内注射2%OA氢氧化铝凝胶1ml，第8天重复注射1次加强致敏，第21天吸入2%OA生理盐水激发哮喘发作，吸入前腹腔内注射苯海拉明5mg/kg体重。对照组以生理盐水代替2%OA，其余步骤不变。豚鼠激发48h后抽取外周血，用淋巴细胞分离液的密度梯度离心分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)，涂片，4%多聚甲醛固定30min。
, 百拇医药
1.3 CD4、CD8T细胞凋亡检测
通过CD4、CD8ICC与TUNEL双标染色进行检测。主要步骤如下：PBS(pH7.2)漂洗。加入小鼠抗大鼠CD4或CD8单克隆抗体(稀释度：1：100)20μl/片，37℃，1h。PBS漂洗。加入二抗37℃，1h，PBS漂洗。加入三抗37℃，1h，PBS漂洗。0.1%TritonX-100,4℃通透2min，PBS漂洗。0.03%H2O2/0.01%NaN3封闭30min，PBS漂洗。加入TUNEL反应混合液20μl/片，37℃反应1h，PBS漂洗。加入过氧化物酶标记的抗荧光素抗体20μl/片，37℃反应30min，PBS漂洗。0.05%DAB/0.01%H2O2显色，PBS漂洗。BCIP/NBT显色。
1.4 记数
高倍光镜下计数双染细胞。随机选择视野，至少观察200个细胞以上，分别计数CD4、CD8T细胞凋亡率。
, 百拇医药
1.5 统计学分析
CD4、CD8T细胞凋亡率以
表示，采用非配对t检验。2 结果
在光学显微镜下观察，单纯凋亡阳性细胞胞核被染成棕黄色,单纯ICC阳性细胞胞膜被染成紫蓝色,ICC和TUNEL双染阳性细胞可见胞核被染成棕黄色,胞膜被染成紫蓝色。哮喘组豚鼠CD4T细胞凋亡率显著低于正常组(P<0.05),而CD8T细胞凋亡率与正常组差别不显著(P>0.05)。
3 讨论
无论是特应性还是非特应性哮喘，气道内及外周血中活化的(CD25+)T细胞增加，表达IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSFmRNA增加，而且其细胞数与EOS数及哮喘严重程度及气道高反应性显著相关[1]。因此，CD4T细胞在哮喘的发病中起重要作用。通过对哮喘豚鼠外周血CD4T细胞凋亡检测，我们发现哮喘豚鼠CD4T细胞凋亡率显著低于正常组。在免疫系统中，活化的T细胞通过凋亡被清除，对维持外周T细胞稳态、调节免疫反应的强度和持续时间起重要作用，是机体对外源性抗原或自身抗原产生免疫耐受的重要机制之一[2]。因此，哮喘CD4T细胞凋亡减少，可能反映了哮喘CD4T细胞的活化增强，是哮喘免疫耐受异常的机制之一。CD8T细胞在一定条件下也能分泌IL-4、IL-5等Th2细胞因子[3]。从特应性患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中制备的CD8T细胞系分泌IL-5、IL-4显著高于非特应性哮喘患者[4]。因此，CD8T细胞也可能参与哮喘的发病。但我们研究结果显示，OA诱导的哮喘豚鼠外周血CD8T细胞凋亡率同正常对照组相比差异不显著。所以，CD8T细胞与哮喘的发病的关系有待更多的研究阐明。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870946)
作者简介：林科雄(1969.5)，男，贵州省织金县人，博士研究生，主治医师，主要从事哮喘气道炎症的免疫机制方面的研究，发表论文1篇。电话：(023)68755320
参考文献
[1]Haczku A.T cells and eosinophils in asthma[J].Acta Microbiol Immunol Hung， 1998， 45(1):19-29.
[2]Critchfield J M,Racke M K,Zuniga-Pfucker J C,et al.T cells deletion in high antigen dose therapy of autoimmune en-cephalomyelitis[J].Science，1994,263(5150):1139-1144.
, 百拇医药
[3]Jerb K，Le Gros G.The role of Th2 type CD4+ T cells and Th2 type CD8+T cells in asthma[J].Immunol Cell Biol，1996,74(2):206-208.
[4]Stomciu L A,Shute J,Promwong C,et al.Increased levels of IL-4 in CD8+ T cells in atopic asthma[J].J Allergy Clin Im-munol，1997,100(3):373-378.
收稿日期：1999-07-21
修回日期：1999-12-29, 百拇医药