4株癌细胞产生一氧化氮水平的观察
作者：张海涛 梁景耀 翁云 祝其锋
单位：张海涛(广东医学院生化教研室，湛江 524023)；梁景耀(广东医学院生化教研室，湛江 524023)；翁云(广东医学院生化教研室，湛江 524023)；祝其锋(广东医学院生化教研室，湛江 524023)
关键词：一氧化氮；肿瘤细胞系；成纤维细胞
广东医学院学报000107 摘 要：目的：观察体外培养不同癌细胞系的一氧化氮生(NO)成量。方法：用Griess试剂测定癌细胞系经24 h培养后一氧化氮的生成量。结果：不同癌细胞的NO产量不同，其中HL-60细胞的产量最高，K562细胞次之，Hela细胞产量最低。结论：NO的产量与癌细胞的种类、分化程度可能有一定关系。
分类号：Q58
文章编号：1005-4057(2000)01-0017-02
, http://www.100md.com
Levels of nitric oxide production from four tumor cell lines
Zhang Haitao,Liang Jingyao,Weng Yun,et al
(Department of Biochemistry,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023)
Abstract：Objective：To observe the levels of nitric oxide production from four tumor cell lines in vitro.Methods：The amount of nitric oxide produced by tumor cell lines after 24 hours culture was determined by Griess method.Results：Nitric oxide production was different in four tumor cell lines.Yields of nitric oxide was the highest in HL-60 cells,followed by that of the K562 cells,and that of Hela cells was the lowset one.Conclusion：Production of nitric oxide may be related to the kinds of tumor cell lines and the degree of their differentiation.
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Key words：nitric oxide;tumor cell lines;fibroblast▲
一氧化氮(NO)是一种自由基气体。研究发现，人和哺乳动物细胞均能产生NO。尽管 NO化学结构简单，但能自由穿过细胞膜，作用于胞内分子，以相对特异的方式控制多种细胞生物功能[1，2]。随着有关 NO的研究深入，NO与肿瘤生物学的关系也受到关注，但对 NO在肿瘤生物学中的作用，仍知道较少。本文以正常成纤维细胞为对照观察了 4种癌细胞株的 NO代谢情况，为进一步研究 NO在肿瘤生物学中的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 细胞株
Hela 细胞、HL-60细胞(购自中国科学院上海细胞研究所)，K562细胞(购自中山医科大学肿瘤研究所)、CNE-2z细胞(广东医学院病理学教研室惠赠)，人皮肤成纤维细胞(广东医学院附属医院整形研究所惠赠)。上述细胞株均用含10%小牛血清无酚红RPMI1640 培养基于37℃、CO2体积分数5%培养。Gress试剂(含10g/L对氨基苯磺酰胺2g/L萘乙二胺，0.35mol/L磷酸)，NaNO2(国产分析纯)，牛血清白蛋白(上海生化所)，M450型ELISA Reader酶标仪(美国Bio-Rad公司)，721分光光度仪(上海分析仪器厂)。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养 各细胞株用无酚红RPMI1640培养基培养，其中成纤维细胞作为对照，用时收集细胞用新鲜培养基洗两遍，将细胞浓度调整为1.5×109/L左右，在37℃与CO2体积分数5%下培养24h，1000r/min离心将细胞和培养液分离。
1.2.2 NO含量的测定[3]用Griess试剂测定培养液中NaNO2以间接反映NO的生成量，以1.56、3.13、6.25、12.5、25.0μmol/L NaNO2标准溶液为参照，作校正曲线。550nm滤光片测光吸收值。
1.2.3 蛋白质浓度测定[4]用考玛斯亮兰法测定蛋白质浓度，以1000、500、250、125、62.5 mg/L 牛血清白蛋白标准溶液为参照，作校正曲线。595nm处测光吸收值。
, 百拇医药
1.3 统计学方法
用方差分析，组间检验用q检验。
2 结果见表1。
表1 4株癌细胞 NO生成量的比较 细胞
n
NO(nmol/(mg.h))
1.Hela
4
(8.00±0.27)×10-4
2.CNE-2z
4
, 百拇医药
(1.64±0.66)×10-1
3.K562
4
(3.19±0.72)×10-1
4.HL-60
4
1.18±0.21
5.成纤维细胞
4
(8.06±0.43)×10-4
4vs 1，2，3，5 P均<0.01；3vs1、5 P均<0.01；3vs2 P>0.05；2vs5 P<0.05；1vs 5P>0.05
, 百拇医药
3 讨论
NO在肿瘤生物学中的作用知道较少，但在一些原发性肿瘤组织中，一氧化氮合酶(NOS)的活性与肿瘤恶性程度呈正相关[5]。实验结果显示，Hela 细胞NO生成量并不高，与正常成纤维细胞差别无显著性(P>0.05)。CNE-2z细胞是一株低分化癌细胞[6]，NO生成量较正常成纤维细胞要高(P<0.05)。K562 细胞是高度未分化的癌细胞，其NO生成量较成纤维细胞高(P<0.01)，但与CNE-2z细胞差别无显著性(P>0.05)。HL-60细胞NO生成量最高，与其他细胞组比较均有极其显著性差异(P<0.01)。HL-60细胞是一株低分化的细胞株，可被诱导为粒细胞或单核细胞，成熟的粒细胞和单核细胞可以被诱导产生大量的NO。研究表明NO代谢和HL-60细胞的分化可能有一定的关系[7]。
研究推测，体内肿瘤产生的NO具有双重作用，一方面持续合适浓度的NO产生有利于肿瘤生长，NO也许在肿瘤信号传导起作用，调节细胞增殖相关基因表达；另一方面，肿瘤中产生高浓度的NO可对肿瘤细胞造成损伤[8]。不同的癌细胞株在体外培养时，NO生成量的差异性可能和癌细胞株的分化程度及癌细胞的起源有一定的关系，其机理有待进一步研究。■
, 百拇医药
基金项目：广东医学院青年资金资助项目，编号：9804
作者简介：张海涛，男，1970年6月出生，硕士，助教
参考文献：
[1]Kharitonov VG，Sundquist AR，Sharma VS.Kinetics of nitric oxide autoxidation in aqueous solution.J Biol Chem，1994，269：5881～5883
[2]Stamler JS.Redox signaling：nitrosylation and related target interactions of nitric oxide.Cell，1994，78：931～936
[3]Archer S.Measurement of nitric oxide in biological models.FASEB J，1993，7：349～360
, 百拇医药
[4]贵阳医学院等合编.生物化学实验.贵阳：贵州人民出版社，1988.52～53
[5]Thomsen LL，Lawton FG，Knowles RG.Nitric oxide synthase activity in human gynecalogical cancer.Cancer Res，1994，54：1352～1354
[6]古淑燕，赵文平，曾毅，等.从低分化鼻咽癌病人建立鼻咽癌上皮细胞株.癌症，1983，2(2)：70～72
[7]Collins SJ.The HL-60 promyelocytic cell line：proliferation，differentiation，and cellular oncogene expression.Blood，1987，70：1233～1244
[8]钟慈声，孙安阳主编.一氧化氮的生物医学.上海：上海医科大学出版社，1997.340～341
收稿日期：1999-09-03
修稿日期：1999-12-05, 百拇医药
单位：张海涛(广东医学院生化教研室，湛江 524023)；梁景耀(广东医学院生化教研室，湛江 524023)；翁云(广东医学院生化教研室，湛江 524023)；祝其锋(广东医学院生化教研室，湛江 524023)
关键词：一氧化氮；肿瘤细胞系；成纤维细胞
广东医学院学报000107 摘 要：目的：观察体外培养不同癌细胞系的一氧化氮生(NO)成量。方法：用Griess试剂测定癌细胞系经24 h培养后一氧化氮的生成量。结果：不同癌细胞的NO产量不同，其中HL-60细胞的产量最高，K562细胞次之，Hela细胞产量最低。结论：NO的产量与癌细胞的种类、分化程度可能有一定关系。
分类号：Q58
文章编号：1005-4057(2000)01-0017-02
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Levels of nitric oxide production from four tumor cell lines
Zhang Haitao,Liang Jingyao,Weng Yun,et al
(Department of Biochemistry,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023)
Abstract：Objective：To observe the levels of nitric oxide production from four tumor cell lines in vitro.Methods：The amount of nitric oxide produced by tumor cell lines after 24 hours culture was determined by Griess method.Results：Nitric oxide production was different in four tumor cell lines.Yields of nitric oxide was the highest in HL-60 cells,followed by that of the K562 cells,and that of Hela cells was the lowset one.Conclusion：Production of nitric oxide may be related to the kinds of tumor cell lines and the degree of their differentiation.
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Key words：nitric oxide;tumor cell lines;fibroblast▲
一氧化氮(NO)是一种自由基气体。研究发现，人和哺乳动物细胞均能产生NO。尽管 NO化学结构简单，但能自由穿过细胞膜，作用于胞内分子，以相对特异的方式控制多种细胞生物功能[1，2]。随着有关 NO的研究深入，NO与肿瘤生物学的关系也受到关注，但对 NO在肿瘤生物学中的作用，仍知道较少。本文以正常成纤维细胞为对照观察了 4种癌细胞株的 NO代谢情况，为进一步研究 NO在肿瘤生物学中的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 细胞株
Hela 细胞、HL-60细胞(购自中国科学院上海细胞研究所)，K562细胞(购自中山医科大学肿瘤研究所)、CNE-2z细胞(广东医学院病理学教研室惠赠)，人皮肤成纤维细胞(广东医学院附属医院整形研究所惠赠)。上述细胞株均用含10%小牛血清无酚红RPMI1640 培养基于37℃、CO2体积分数5%培养。Gress试剂(含10g/L对氨基苯磺酰胺2g/L萘乙二胺，0.35mol/L磷酸)，NaNO2(国产分析纯)，牛血清白蛋白(上海生化所)，M450型ELISA Reader酶标仪(美国Bio-Rad公司)，721分光光度仪(上海分析仪器厂)。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 各细胞株用无酚红RPMI1640培养基培养，其中成纤维细胞作为对照，用时收集细胞用新鲜培养基洗两遍，将细胞浓度调整为1.5×109/L左右，在37℃与CO2体积分数5%下培养24h，1000r/min离心将细胞和培养液分离。
1.2.2 NO含量的测定[3]用Griess试剂测定培养液中NaNO2以间接反映NO的生成量，以1.56、3.13、6.25、12.5、25.0μmol/L NaNO2标准溶液为参照，作校正曲线。550nm滤光片测光吸收值。
1.2.3 蛋白质浓度测定[4]用考玛斯亮兰法测定蛋白质浓度，以1000、500、250、125、62.5 mg/L 牛血清白蛋白标准溶液为参照，作校正曲线。595nm处测光吸收值。
, 百拇医药
1.3 统计学方法
用方差分析，组间检验用q检验。
2 结果见表1。
表1 4株癌细胞 NO生成量的比较 细胞
n
NO(nmol/(mg.h))
1.Hela
4
(8.00±0.27)×10-4
2.CNE-2z
4
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(1.64±0.66)×10-1
3.K562
4
(3.19±0.72)×10-1
4.HL-60
4
1.18±0.21
5.成纤维细胞
4
(8.06±0.43)×10-4
4vs 1，2，3，5 P均<0.01；3vs1、5 P均<0.01；3vs2 P>0.05；2vs5 P<0.05；1vs 5P>0.05
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3 讨论
NO在肿瘤生物学中的作用知道较少，但在一些原发性肿瘤组织中，一氧化氮合酶(NOS)的活性与肿瘤恶性程度呈正相关[5]。实验结果显示，Hela 细胞NO生成量并不高，与正常成纤维细胞差别无显著性(P>0.05)。CNE-2z细胞是一株低分化癌细胞[6]，NO生成量较正常成纤维细胞要高(P<0.05)。K562 细胞是高度未分化的癌细胞，其NO生成量较成纤维细胞高(P<0.01)，但与CNE-2z细胞差别无显著性(P>0.05)。HL-60细胞NO生成量最高，与其他细胞组比较均有极其显著性差异(P<0.01)。HL-60细胞是一株低分化的细胞株，可被诱导为粒细胞或单核细胞，成熟的粒细胞和单核细胞可以被诱导产生大量的NO。研究表明NO代谢和HL-60细胞的分化可能有一定的关系[7]。
研究推测，体内肿瘤产生的NO具有双重作用，一方面持续合适浓度的NO产生有利于肿瘤生长，NO也许在肿瘤信号传导起作用，调节细胞增殖相关基因表达；另一方面，肿瘤中产生高浓度的NO可对肿瘤细胞造成损伤[8]。不同的癌细胞株在体外培养时，NO生成量的差异性可能和癌细胞株的分化程度及癌细胞的起源有一定的关系，其机理有待进一步研究。■
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基金项目：广东医学院青年资金资助项目，编号：9804
作者简介：张海涛，男，1970年6月出生，硕士，助教
参考文献：
[1]Kharitonov VG，Sundquist AR，Sharma VS.Kinetics of nitric oxide autoxidation in aqueous solution.J Biol Chem，1994，269：5881～5883
[2]Stamler JS.Redox signaling：nitrosylation and related target interactions of nitric oxide.Cell，1994，78：931～936
[3]Archer S.Measurement of nitric oxide in biological models.FASEB J，1993，7：349～360
, 百拇医药
[4]贵阳医学院等合编.生物化学实验.贵阳：贵州人民出版社，1988.52～53
[5]Thomsen LL，Lawton FG，Knowles RG.Nitric oxide synthase activity in human gynecalogical cancer.Cancer Res，1994，54：1352～1354
[6]古淑燕，赵文平，曾毅，等.从低分化鼻咽癌病人建立鼻咽癌上皮细胞株.癌症，1983，2(2)：70～72
[7]Collins SJ.The HL-60 promyelocytic cell line：proliferation，differentiation，and cellular oncogene expression.Blood，1987，70：1233～1244
[8]钟慈声，孙安阳主编.一氧化氮的生物医学.上海：上海医科大学出版社，1997.340～341
收稿日期：1999-09-03
修稿日期：1999-12-05, 百拇医药