乙醇对心脏乙酰胆硷激活的钾通道的作用
作者：臧伟进 于晓江 臧益民 商立军
单位：臧伟进(西安医科大学心血管生理药理研究室,陕西 西安 710061)；于晓江(西安医科大学心血管生理药理研究室,陕西 西安 710061)；臧益民(第四军医大学生理学教研室)；商立军(第四军医大学生理学教研室)
关键词：醇,乙；心脏；离子通道；乙酰胆硷
心脏杂志000101摘 要:乙醇是心脏抑制剂,有明显的降低心肌收缩的作用。神经递质乙酰胆硷(ACh)调节心脏功能的最重要的离子通道是经鸟苷酸调节蛋白(G蛋白)的βγ亚单位而激活的毒蕈碱型钾通道(IK,ACh)。作者采用全细胞膜片钳的方法观察了豚鼠心房肌细胞乙酰胆硷激活的钾通道及乙醇对其影响。乙醇对IK,ACh的抑制呈剂量依赖性效应,灌注之后可使ACh激活的IK,ACh速率减慢,峰值下降。乙醇可抑制IK,ACh,从而影响副交感神经对心脏的调节作用。
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中图分类号:Q25 文献标识码:A 文章编号：1005-3271(2000)01-0001-03
The effects of ethanol on acetylcholine activated potassium current of the heart
ZANG Wei-jin,YU Xiao-jiang
(Division of Cardiovascular Physiology and Pharmacology,Xi′an Medical University,Xi′an 710061，China)
ZANG Yi-min,SHANG Li-jun
(Department of Physiology,Fourth Military Medical University,China
, http://www.100md.com
Abstract:Ethanol is a cardiac depress and it can inhibit the contraction of cardiac muscles. Acetylcholine (ACh) released from parasympathetic nerves binds to muscarinic (M2) ACh receptor (mAChR) in the heart and this leads to the activation of muscarinic K+ channel via the βγ subunit of a G protein. The muscarinic K+ channel (IK,ACh) in guinea-pig atrial cells and the effect of an alcohol (ethanol) on IK,ACh were investigated using the whole-cell patch clamp technique. Ethanol depressed IK,ACh in a dosedependent manner and ethanol slowed activation of IK,ACh and reduced peak IK,ACh. The decrease of IK,ACh by ethanol may impair parasympathetic control of the heart.
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Key words:alcohol, ethyl;heart;ion channels;acetylcholine
乙醇(alcohol,ethanol)的消耗使用是世界性的,它是心脏抑制剂,有明显的降低心肌收缩的作用[1]。高浓度的乙醇可以完全废除大鼠心肌的收缩力[2]。此外,乙醇可激活骨骼肌肌质网中咖啡因引起的钙释放通道[3]和激活克隆的脑细胞的钙激活的钾通道[4]。其作用可能是由于促进通道的磷酸化而增加通道的活力，从而影响激素的分泌。整体内,心脏受到交感神经和副交感神经分支的支配,从而调节窦房结的自律性、冲动的传导和心房及心室的收缩。由副交感神经释放的神经递质乙酰胆硷对心脏的效应是由于开放了心肌细胞膜周围的钾通道及降低钙通道内流等所致。交感神经的作用则与之相反。近年,乙醇对中枢神经系统的神经递质所开放的离子通道及受体的影响已引起了人们的注目[5～7],但它们对心脏的离子通道及由神经递质激活的离子通道的研究,尚很少见报道。本实验观察了豚鼠心房肌细胞IK,ACh电流及乙醇对其抑制效应。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 分离单个心房肌细胞 豚鼠单个心房肌细胞的分离方法及液体如作者的前文[8]。简言之,豚鼠(雌雄不拘,200 g～250 g)击昏后取出心脏,依次用下列液体进行主动脉逆行心脏灌流:台氏液(2 min～5 min)、无钙台氏液(3 min～5 min)、含0.1 mg/ml～0.15 mg/ml的胶原酶(Yakult)和0.5 mg/ml～0.6 mg/ml BSA的无钙台氏液(5 min～8 min)、室温KB液(5 min)。在KB液中将心房肌剪成碎块并过滤。心房肌保持在KB液中至少1 h后才进行电生理实验。
1.2 记录心房肌细胞IK,ACh电流的液体成份(mmol/L) 细胞外液成份为:NaCl 136.9,KCl 5.4,CaCl2 1.8,MgCl2 0.5, NaH2PO4 0.33,HEPES 5.0,Glucose 5.5, pH 7.4。电极内液成份为:K aspartate 130,KCl 20,KH2PO4 1,MgCl2 1,EGTA 5.0,Na2ATP(Sigma) 3, GTP(Sodium Salt,Sigma) 0.1, HEPES 5.0,pH7.3。在有些实验中GTP由0.1 mmol/L GTP γS(Sigma)代替。ACh(Sigma);Ethanol(Fisons plc)。
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1.3 电生理实验 全细胞记录实验方法同文献[8]报道。电极电阻为2 MΩ～5 MΩ。电流信号经Axon Patch 200B放大后,由记忆示波器(Tektronix500)显示,笔式记录仪(Gould2400 Series)记录,并同时记录在录像带上供回放使用。电流信号经A/D转换器(Digidata1200A),由IBM计算机采样、Pclamp6、Origin等软件进行分析和处理。
1.4 统计学处理 数据以均数±标准差(
±s)表示,实验结果的统计学处理以配对t检验作显著性分析。
2 结果
2.1 豚鼠心房肌细胞乙酰胆硷激活的钾通道 我们的实验已证明:当心房肌细胞外灌注ACh时,可以经毒蕈碱受体激活IK,ACh,即外向的钾离子流,该电流在钾平衡电位处反转,I-V(电流-电压)关系呈内向整流特性[8]。本实验采用10 μmol/L ACh,因为这个浓度可以完全激活IK,ACh[9]。实验如图1A所示,当细胞被钳制在-53 mV时,经细胞外灌注ACh,可以记录出外向的钾电流IK,ACh,很快到达顶峰,然后逐渐缓慢衰减,即出现IK,ACh的脱敏。为了找出细胞对ACh的反应从脱敏状态恢复过来的时间,以便进一步研究乙醇对IK,ACh的影响,并观察了IK,ACh电流的恢复情况。
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图1 IK,ACh从脱敏中恢复的观察
图1显示了二帧对照和ACh灌流实验时的情况。每次ACh的灌流时间为30 s,若恢复的时间为30 s时(图1A),则不能允许脱敏完全恢复,因而继之灌流的IK,ACh峰值比第一个要小。然而,二次灌流的间隔时间为3 min时(图1B),则可使IK,ACh的峰值完全恢复。因而我们观察乙醇的作用时,采用的是间隔3 min依次灌注ACh的实验方法。
2.2 乙醇对IK,ACh的影响 图2A是200 mmol/L的乙醇对IK,ACh离子流影响的例子。在给第一次ACh灌流(对照)30 s之后,将200 mmol/L的乙醇加入灌流液中。在继之给ACh的多次灌流中,可见IK,ACh的峰值逐渐减小,到达90%峰值的时间显著增加。不同浓度(10 mmol/L～200 mmol/L)的乙醇(灌注8 min～12 min)对IK,ACh电流峰值的影响总结于图2B。
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图2 不同浓度乙醇对IK,ACh电流的影响
当乙醇的浓度大于或等于30 mmol/L时,IK,ACh的峰值以剂量依赖的方式显著下降:30,100和200 mmol/L乙醇分别抑制IK,ACh的峰值为(21±9)%(n=6,P<0.05),(39±11)% (n=6,P<0.01)和(49±8)% ( n=6,P<0.01) (图2B)。
2.3 乙醇对IK,ACh激活、峰值和脱敏的影响 图3显示了200 mmol/L的乙醇对IK,ACh的激活、峰值及脱敏影响的进一步分析的结果。
图3 200 mmol/L乙醇对IK,ACh的激活、峰值及脱敏的影响
, 百拇医药
图3的实验方式如前面所述，在给一对照灌注30 s的ACh后，将200 mmol/L乙醇加入灌注液中。图3A显示了随乙醇灌注时间的延长,IK,ACh峰值下降的情况。图3B为使用200 mmol/L乙醇之后,达到90% IK,ACh峰值的时间变化,在灌注200 mmol/L的乙醇6.5 min后,到达90% IK,ACh峰值的时间明显延长了(30±9)% (n=6,P<0.05)。图3C是200 mmol/L乙醇对ACh引起脱敏的影响(以正常对照的百分比计)。在灌注乙醇6.5 min之后,可使IK,ACh的脱敏程度降低约(31±7)% (n=6,P<0.05)。
3 讨论
本研究的主要发现乙醇可抑制豚鼠心房肌细胞的毒蕈碱型钾通道离子流。乙醇可抑制尼古丁型(N型)ACh受体(nAChR)通道离子流,其机制可能与其与nAChR结合,阻断其通道开放时相和稳定通道长时的关闭状态等有关[10]。曾有报道,慢性乙醇的使用可以减少心脏β-受体的数量[11]。本实验发现,乙醇除了降低IK,ACh的峰值之外,还可降低IK,ACh激活的速度及IK,ACh的脱敏。乙醇对IK,ACh的抑制效应可能涉及mAChR,G蛋白或毒蕈碱型钾通道三个方面。
, 百拇医药
乙醇在人体血液中接近致毒的浓度为22 mmol/L(轻度),43 mmol/L(中度)和87 mmol/L(重度)[12]。本研究发现,乙醇抑制豚鼠心房肌细胞的IK,ACh电流呈剂量依赖效应。灌注30 mmol/L的乙醇(相当于人体轻度到中度乙醇中毒的剂量)可降低(21±9)%的IK,ACh的电流(图2)。由于临床相关剂量的乙醇可以抑制IK,ACh离子流,因而其作用可能具有重要意义,乙醇对IK,ACh抑制作用可能会削弱副交感神经对心脏的调控效应。
本课题为国家自然科学基金(No.39870334)、国家教委留学回国人员启动基金及世川医学奖学金同学会科研启动基金(No.025)资助项目.
参考文献:
[1] Ian C,Harrison S,White E,et al. The effect of a range of alcohols on the contraction of guinea pig ventricular myocytes[J]. Eur J Pharmacol,1993，248:213.
, 百拇医药
[2] Schulman SP,Lakatta EG,Weiss RG,et al. Contractile,metabolic and electrophysiologic effects of ethanol in the isolated rat heart[J]. J Mol Cardiol,1991，23:417.
[3] Oba T,Koshita M,Yamaguchi M. Ethanol enhances caffeine-induced Ca2+-release channel activation in skeletal muscle sarcoplasmic reticulum[J]. Am J Physiol,1997，272(2ptl):C622.
[4] Jakab M,Weiger TM,Hermann A. Ethanol activates maxi Ca2+-activated K+ Channels of clonal pituitary (GH3) cell[J]. Membr Biol,1997，157(3):237.
, 百拇医药
[5] Lovinger DM. Alcohols and neurotransmitter gated ion channels:past,present and future[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,1997，356(3):267.
[6] Calton JL,Wilson WA,Moore SD. Reduction of voltage-dependent currents by ethanol contributes to inhibition of NMDA receptor-mediated excitatory synaptic transmission[J]. Brain Res,1999，816(1):142.
[7] Mihic SJ,Yu Q,Wick MJ,et al. Sites of alcohol and Volatile anaesthetic action on GAB (A) and glycine receptors[J]. Nature,1997，389(6649):385
, http://www.100md.com
[8] Zang WJ,Yu XJ,Honjo H,et al. On the role of G protein activation and phosphorylation in desensitization to acetylcholine in guinea-pig atrial cells[J]. J Physiol,1993，464:649.
[9] Carmeliet E,Mubagwa K. Desensitization of the acetylcholine-induced increase of potassium conductance in rabbit cardiac purkinje fibers[J]. J Physiol,1986，371:239.
[10] Murrell RD,Braun MS,Hayson DA. Action of n-alcohols on nicotinic acetylcholine receptor channels in cultured rat myotubes[J]. J Physiol,1991，437:431.
, http://www.100md.com
[11] Kwast W,Tabakoff B,Hoffman P. Effect of ethanol on Cardiac β-adrenoceptors[J]. Eur J Pharmarol,1987，142:441.
[12] Hirota Y,Bing OHL,Abelmann VH. Effect of ethanol on contraction and relaxation of isolated rat ventricular muscle[J]. J Mol Cell Cardiol,1976，8:727.
(收稿 1999-08-16 修回 1999-09-06), 百拇医药
单位：臧伟进(西安医科大学心血管生理药理研究室,陕西 西安 710061)；于晓江(西安医科大学心血管生理药理研究室,陕西 西安 710061)；臧益民(第四军医大学生理学教研室)；商立军(第四军医大学生理学教研室)
关键词：醇,乙；心脏；离子通道；乙酰胆硷
心脏杂志000101摘 要:乙醇是心脏抑制剂,有明显的降低心肌收缩的作用。神经递质乙酰胆硷(ACh)调节心脏功能的最重要的离子通道是经鸟苷酸调节蛋白(G蛋白)的βγ亚单位而激活的毒蕈碱型钾通道(IK,ACh)。作者采用全细胞膜片钳的方法观察了豚鼠心房肌细胞乙酰胆硷激活的钾通道及乙醇对其影响。乙醇对IK,ACh的抑制呈剂量依赖性效应,灌注之后可使ACh激活的IK,ACh速率减慢,峰值下降。乙醇可抑制IK,ACh,从而影响副交感神经对心脏的调节作用。
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中图分类号:Q25 文献标识码:A 文章编号：1005-3271(2000)01-0001-03
The effects of ethanol on acetylcholine activated potassium current of the heart
ZANG Wei-jin,YU Xiao-jiang
(Division of Cardiovascular Physiology and Pharmacology,Xi′an Medical University,Xi′an 710061，China)
ZANG Yi-min,SHANG Li-jun
(Department of Physiology,Fourth Military Medical University,China
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Abstract:Ethanol is a cardiac depress and it can inhibit the contraction of cardiac muscles. Acetylcholine (ACh) released from parasympathetic nerves binds to muscarinic (M2) ACh receptor (mAChR) in the heart and this leads to the activation of muscarinic K+ channel via the βγ subunit of a G protein. The muscarinic K+ channel (IK,ACh) in guinea-pig atrial cells and the effect of an alcohol (ethanol) on IK,ACh were investigated using the whole-cell patch clamp technique. Ethanol depressed IK,ACh in a dosedependent manner and ethanol slowed activation of IK,ACh and reduced peak IK,ACh. The decrease of IK,ACh by ethanol may impair parasympathetic control of the heart.
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Key words:alcohol, ethyl;heart;ion channels;acetylcholine
乙醇(alcohol,ethanol)的消耗使用是世界性的,它是心脏抑制剂,有明显的降低心肌收缩的作用[1]。高浓度的乙醇可以完全废除大鼠心肌的收缩力[2]。此外,乙醇可激活骨骼肌肌质网中咖啡因引起的钙释放通道[3]和激活克隆的脑细胞的钙激活的钾通道[4]。其作用可能是由于促进通道的磷酸化而增加通道的活力，从而影响激素的分泌。整体内,心脏受到交感神经和副交感神经分支的支配,从而调节窦房结的自律性、冲动的传导和心房及心室的收缩。由副交感神经释放的神经递质乙酰胆硷对心脏的效应是由于开放了心肌细胞膜周围的钾通道及降低钙通道内流等所致。交感神经的作用则与之相反。近年,乙醇对中枢神经系统的神经递质所开放的离子通道及受体的影响已引起了人们的注目[5～7],但它们对心脏的离子通道及由神经递质激活的离子通道的研究,尚很少见报道。本实验观察了豚鼠心房肌细胞IK,ACh电流及乙醇对其抑制效应。
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1 材料和方法
1.1 分离单个心房肌细胞 豚鼠单个心房肌细胞的分离方法及液体如作者的前文[8]。简言之,豚鼠(雌雄不拘,200 g～250 g)击昏后取出心脏,依次用下列液体进行主动脉逆行心脏灌流:台氏液(2 min～5 min)、无钙台氏液(3 min～5 min)、含0.1 mg/ml～0.15 mg/ml的胶原酶(Yakult)和0.5 mg/ml～0.6 mg/ml BSA的无钙台氏液(5 min～8 min)、室温KB液(5 min)。在KB液中将心房肌剪成碎块并过滤。心房肌保持在KB液中至少1 h后才进行电生理实验。
1.2 记录心房肌细胞IK,ACh电流的液体成份(mmol/L) 细胞外液成份为:NaCl 136.9,KCl 5.4,CaCl2 1.8,MgCl2 0.5, NaH2PO4 0.33,HEPES 5.0,Glucose 5.5, pH 7.4。电极内液成份为:K aspartate 130,KCl 20,KH2PO4 1,MgCl2 1,EGTA 5.0,Na2ATP(Sigma) 3, GTP(Sodium Salt,Sigma) 0.1, HEPES 5.0,pH7.3。在有些实验中GTP由0.1 mmol/L GTP γS(Sigma)代替。ACh(Sigma);Ethanol(Fisons plc)。
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1.3 电生理实验 全细胞记录实验方法同文献[8]报道。电极电阻为2 MΩ～5 MΩ。电流信号经Axon Patch 200B放大后,由记忆示波器(Tektronix500)显示,笔式记录仪(Gould2400 Series)记录,并同时记录在录像带上供回放使用。电流信号经A/D转换器(Digidata1200A),由IBM计算机采样、Pclamp6、Origin等软件进行分析和处理。
1.4 统计学处理 数据以均数±标准差(
±s)表示,实验结果的统计学处理以配对t检验作显著性分析。2 结果
2.1 豚鼠心房肌细胞乙酰胆硷激活的钾通道 我们的实验已证明:当心房肌细胞外灌注ACh时,可以经毒蕈碱受体激活IK,ACh,即外向的钾离子流,该电流在钾平衡电位处反转,I-V(电流-电压)关系呈内向整流特性[8]。本实验采用10 μmol/L ACh,因为这个浓度可以完全激活IK,ACh[9]。实验如图1A所示,当细胞被钳制在-53 mV时,经细胞外灌注ACh,可以记录出外向的钾电流IK,ACh,很快到达顶峰,然后逐渐缓慢衰减,即出现IK,ACh的脱敏。为了找出细胞对ACh的反应从脱敏状态恢复过来的时间,以便进一步研究乙醇对IK,ACh的影响,并观察了IK,ACh电流的恢复情况。
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图1 IK,ACh从脱敏中恢复的观察
图1显示了二帧对照和ACh灌流实验时的情况。每次ACh的灌流时间为30 s,若恢复的时间为30 s时(图1A),则不能允许脱敏完全恢复,因而继之灌流的IK,ACh峰值比第一个要小。然而,二次灌流的间隔时间为3 min时(图1B),则可使IK,ACh的峰值完全恢复。因而我们观察乙醇的作用时,采用的是间隔3 min依次灌注ACh的实验方法。
2.2 乙醇对IK,ACh的影响 图2A是200 mmol/L的乙醇对IK,ACh离子流影响的例子。在给第一次ACh灌流(对照)30 s之后,将200 mmol/L的乙醇加入灌流液中。在继之给ACh的多次灌流中,可见IK,ACh的峰值逐渐减小,到达90%峰值的时间显著增加。不同浓度(10 mmol/L～200 mmol/L)的乙醇(灌注8 min～12 min)对IK,ACh电流峰值的影响总结于图2B。
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图2 不同浓度乙醇对IK,ACh电流的影响
当乙醇的浓度大于或等于30 mmol/L时,IK,ACh的峰值以剂量依赖的方式显著下降:30,100和200 mmol/L乙醇分别抑制IK,ACh的峰值为(21±9)%(n=6,P<0.05),(39±11)% (n=6,P<0.01)和(49±8)% ( n=6,P<0.01) (图2B)。
2.3 乙醇对IK,ACh激活、峰值和脱敏的影响 图3显示了200 mmol/L的乙醇对IK,ACh的激活、峰值及脱敏影响的进一步分析的结果。
图3 200 mmol/L乙醇对IK,ACh的激活、峰值及脱敏的影响
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图3的实验方式如前面所述，在给一对照灌注30 s的ACh后，将200 mmol/L乙醇加入灌注液中。图3A显示了随乙醇灌注时间的延长,IK,ACh峰值下降的情况。图3B为使用200 mmol/L乙醇之后,达到90% IK,ACh峰值的时间变化,在灌注200 mmol/L的乙醇6.5 min后,到达90% IK,ACh峰值的时间明显延长了(30±9)% (n=6,P<0.05)。图3C是200 mmol/L乙醇对ACh引起脱敏的影响(以正常对照的百分比计)。在灌注乙醇6.5 min之后,可使IK,ACh的脱敏程度降低约(31±7)% (n=6,P<0.05)。
3 讨论
本研究的主要发现乙醇可抑制豚鼠心房肌细胞的毒蕈碱型钾通道离子流。乙醇可抑制尼古丁型(N型)ACh受体(nAChR)通道离子流,其机制可能与其与nAChR结合,阻断其通道开放时相和稳定通道长时的关闭状态等有关[10]。曾有报道,慢性乙醇的使用可以减少心脏β-受体的数量[11]。本实验发现,乙醇除了降低IK,ACh的峰值之外,还可降低IK,ACh激活的速度及IK,ACh的脱敏。乙醇对IK,ACh的抑制效应可能涉及mAChR,G蛋白或毒蕈碱型钾通道三个方面。
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乙醇在人体血液中接近致毒的浓度为22 mmol/L(轻度),43 mmol/L(中度)和87 mmol/L(重度)[12]。本研究发现,乙醇抑制豚鼠心房肌细胞的IK,ACh电流呈剂量依赖效应。灌注30 mmol/L的乙醇(相当于人体轻度到中度乙醇中毒的剂量)可降低(21±9)%的IK,ACh的电流(图2)。由于临床相关剂量的乙醇可以抑制IK,ACh离子流,因而其作用可能具有重要意义,乙醇对IK,ACh抑制作用可能会削弱副交感神经对心脏的调控效应。
本课题为国家自然科学基金(No.39870334)、国家教委留学回国人员启动基金及世川医学奖学金同学会科研启动基金(No.025)资助项目.
参考文献:
[1] Ian C,Harrison S,White E,et al. The effect of a range of alcohols on the contraction of guinea pig ventricular myocytes[J]. Eur J Pharmacol,1993，248:213.
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[2] Schulman SP,Lakatta EG,Weiss RG,et al. Contractile,metabolic and electrophysiologic effects of ethanol in the isolated rat heart[J]. J Mol Cardiol,1991，23:417.
[3] Oba T,Koshita M,Yamaguchi M. Ethanol enhances caffeine-induced Ca2+-release channel activation in skeletal muscle sarcoplasmic reticulum[J]. Am J Physiol,1997，272(2ptl):C622.
[4] Jakab M,Weiger TM,Hermann A. Ethanol activates maxi Ca2+-activated K+ Channels of clonal pituitary (GH3) cell[J]. Membr Biol,1997，157(3):237.
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[5] Lovinger DM. Alcohols and neurotransmitter gated ion channels:past,present and future[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,1997，356(3):267.
[6] Calton JL,Wilson WA,Moore SD. Reduction of voltage-dependent currents by ethanol contributes to inhibition of NMDA receptor-mediated excitatory synaptic transmission[J]. Brain Res,1999，816(1):142.
[7] Mihic SJ,Yu Q,Wick MJ,et al. Sites of alcohol and Volatile anaesthetic action on GAB (A) and glycine receptors[J]. Nature,1997，389(6649):385
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[8] Zang WJ,Yu XJ,Honjo H,et al. On the role of G protein activation and phosphorylation in desensitization to acetylcholine in guinea-pig atrial cells[J]. J Physiol,1993，464:649.
[9] Carmeliet E,Mubagwa K. Desensitization of the acetylcholine-induced increase of potassium conductance in rabbit cardiac purkinje fibers[J]. J Physiol,1986，371:239.
[10] Murrell RD,Braun MS,Hayson DA. Action of n-alcohols on nicotinic acetylcholine receptor channels in cultured rat myotubes[J]. J Physiol,1991，437:431.
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[11] Kwast W,Tabakoff B,Hoffman P. Effect of ethanol on Cardiac β-adrenoceptors[J]. Eur J Pharmarol,1987，142:441.
[12] Hirota Y,Bing OHL,Abelmann VH. Effect of ethanol on contraction and relaxation of isolated rat ventricular muscle[J]. J Mol Cell Cardiol,1976，8:727.
(收稿 1999-08-16 修回 1999-09-06), 百拇医药