胶质母细胞瘤中p16、Rb基因表达水平与细胞增殖活性相互关系的研究
作者：李文玲 张荣勋 李春仲 赵文清 张学新
单位：河北医科大学第四医院神经外科(石家庄 050011)
关键词：胶质母细胞瘤/病因学；癌基因蛋白质/分析；流式细胞术/方法；细胞增殖
河北医科大学学报000103摘 要：目的 探讨胶质母细胞瘤(glioblastomas,GBMs)中p16、Rb基因表达水平的异常及其与细胞增殖活性之间的关系。方法 应用流式细胞仪检测32例胶质母细胞瘤标本中p16、Rb基因蛋白表达的相对含量。结果 胶质母细胞瘤中p16、Rb基因蛋白表达量较正常脑组织降低，二者的异常可使细胞发生过度增殖。结论 p16基因和Rb基因表达活性降低是胶质母细胞瘤发生发展的重要因素之一。
分类号：R730.23
RELATIONSHIP BETWEEN EXPRESSION OF p16,Rb GENES AND CELL PROLIFERATION IN GLIOBLASTOMAS
, 百拇医药
Li Wenling Zhang Rongxun Li Chunzhong Zhao Wenqing Zhang Xuexing
(Department of Neurosurgery, the Fourth Hospital of Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050011))
ABSTRACT：Objective To explore the abnormalities of expression of p16,Rb genes and the relationship between these abnormalities and the cell proliferation in glioblastomas (GBMs).Methods The expression of p16 gene and Rb gene was measured by flow cytometry in 32 cases of GBMs.Results The amounts of the expression of p16 gene and Rb gene in GBMs were lower than those in normal brains.These abnormalities may cause over proliferation of GBMs cells.Conclusion The abnormalities of expression p16 gene and Rb gene are the important factors for the development of GBMs.
, 百拇医药
KEYWORDS：glioblastoma/etiol;oncogene proteins/anal;flow cytometry/methods;cell proliferation▲
细胞癌变最显著的特征是细胞增殖失控，细胞增殖是由细胞周期的G1→S调控点所控制的。参与细胞周期G1→S点调控的成分有正调节因子:细胞周期蛋白D(cyclin D),细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)等；负调节因子：p16、p21、Rb等。当正调节因子表达异常增殖，负调节因子表达缺失时，可使细胞无限增殖而发生癌变。本文应用流式细胞技术检测胶质母细胞瘤中p16、Rb基因蛋白表达的相对含量，并用增殖指数(proliferation index ,PI)和S期细胞比率(S-phase fraction,SPF)来衡量细胞的增殖活性，以求揭示胶质母细胞瘤发生发展的分子机制。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 研究对象：选用1995年11月～1998年5月经我院神经外科手术切除的胶质母细胞瘤(glioblastomas,GBMs)标本32例，另取颅内减压术中切除的正常脑组织(normal brain,NB)5例为正常对照。全部标本均由10 %福尔马林固定后再经石 蜡包埋，并由两位病理专家根据WHO标准复查其病理诊断。
1.2 主要试剂：一抗，Rb兔抗人多克隆抗体(C-15)、p16鼠抗人单克隆抗体(F-12 )为美国Santa Cruz公司产品。二抗，羊抗兔FITC-IgG、羊抗鼠 FITC - IgG 为美国Jackson Reseach公司产品。
1.3 流式细胞分析样本的制备[1]：①切片，将石蜡包埋组织切成 50 μm厚的组织片(6～8片),然后放入试管中； ②脱蜡，加入二甲苯10 ml，室温下脱蜡48 h(中间换1次二甲苯液)，弃去二甲苯; ③水化,依次加入100 %、95 %、70 %、50 %的梯度酒精及双蒸水5 ml，每步20 min后弃之;④网搓法制备单细胞悬液,将剪碎的组织放在120目不锈钢网上， 用眼科镊轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到组织搓完，收集细胞悬液，再用300目尼龙网过滤后，以1 000 r/min离心3 min，弃上清，制成单细胞悬液; ⑤标记,采用间接免疫标记法，取1×106/ml细胞用PBS液洗涤2次，加入1∶100稀释的一抗100 ml，37 ℃温育30 min，PBS液洗1次，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入1∶20稀释的二抗FITC-IgG100 ml，37 ℃温育30 min，PBS液洗涤1次，除去未结合的多余荧光抗体，加入1 ml PBS液混匀，500目铜网过滤，上机分析。
, http://www.100md.com
1.4 流式细胞仪检测：采用美国B.D公司生产的FACS～420型流式细胞仪，应用单组方图以鸡血红细胞作为标准样品，调整仪器的CV值在5 %以内。
1.5 结果判定
1.5.1 细胞周期分布的计算：应用DNA细胞周期分析软件，计算出DNA组方图各时相分布的百分比，用PI和SPF来表示细胞的增殖活性。其计算公式如下：
1.5.2 p16、Rb的定量分析：p16、Rb基因表达的定量分析按照Morkve[2]等提出的分析方法，以荧光指数(flurorescene index，FI)表示蛋白的相对含量 ，计算方法如下式：
, 百拇医药
Rb、p16基因蛋白表达以FI<1.0为阳性，FI≥1.0为阴性
1.6 统计学处理：所得数据采用t检验，以P<0.05 具统计学意义，并采用直线相关进行两两分析。
2 结 果
2.1 GBMs组p16、Rb的异常:见表1。在GBM中，p16、Rb基因蛋白表达量(FI值) 较正常脑组织降低(P<0.01，P<0.05)。
表1 两组p16,Rb基因蛋白表达量(FI值)的比较
Table 1 Comparison of amounts of expression of p16,Rb genes in GBMs and mornal brain
(
±s) Groups
, http://www.100md.com
n
p16
Rb
GBMs
32
0.939 ± 0.093**
0.975±0.115*
Normal brain
8
1.000±0.077
1.000±0.084
* P<0.05 ** P<0.01 vs normal brain by t test2.2 GBMs组的PI 、SPF值:见表2。GBMs组的PI、SPF值较正常脑组织增高，并有显著性差异(P<0.05，P<0.05)。
, http://www.100md.com
表2 两组PI,SPF值的比较
Table 2 Comparison of PI,SPF in GBMs and normal brain
(±s) Groups
n
PI
SPF
GBMs
32
19.653±6.502*
10.751±3.049*
, http://www.100md.com
Normal brain
8
13.938±5.058
7.59±1.366
* P<0.05 vs normal brain by t test2.3 p16、Rb与PI、SPF的关系:见表3。p16蛋白低表达(阳性)组较p16蛋白正常表达组PI、SPF值增高(P<0.05),Rb蛋白低表达(阳性)组较Rb蛋白正常表达组PI、SPF值增高(P<0.01)。
表3 p16,Rb与PI,SPF的关系
Table 3 Relationship between p16,Rb and PI,SPF
(±s)
, 百拇医药
Expression
n
PI
SPF
p16
+
24
20.10±7.245*
11.984±2.236*
-
8
16.52±3.505
, http://www.100md.com
9.051±3.258
Rb
+
20
21.47±7.060**
11.590±2.887**
-
12
15.94±2.870
8.948±2.612
* P<0.05 ** P<0.01 vs negative group by t test 3 讨 论
, http://www.100md.com
3.1 GBMs中p16蛋白表达异常:多肿瘤抑制基因(p16/CDKN2/MTS1基因)，定位于人染色体9P21，由3个外显子(126 bp、37 bp、11 bp)组成，编码蛋白的相对分子质量为15.845 ku(约16 ku )，能与细胞周期蛋白激酶CDK4结合，使其不能解除Rb蛋白对转录因子E2F的抑制，从而阻止细胞由G1期向S期过渡，而直接参与细胞周期的调控[3]。p16基因变异可使细胞无限增殖，而发生癌变。p16基因改变包括基因纯合性缺失[4]、 点突变[5]及5′-CPG区甲基化[6]。 而神经胶质瘤中主要以纯合性缺失为主，但发生率各家报道不一,变动于16 %～69 %之间[7]。Tsuzuki[8]等发现胶质母细胞瘤中p16基因异常与蛋白表达异常的发生率并不一致，43.5 %的患者p16蛋白低表达,而只有30.4 %的患者发生p16基因的缺失或突变，从而认为p16蛋白表达可更好地衡量p16的功能情况。本实验结果显示：GBMs中p16基因蛋白的低表达率为75 %，表明p16缺失与胶质母细胞瘤的发生有关 。并且p16基因蛋白低表达的病例的PI、SPF值明显高于阳性表达的病例，说明p16蛋白量的降低可导致GBMs细胞由G1期向S期过渡，使细胞发生无限制增殖而形成肿瘤。
, http://www.100md.com
3.2 GBMs中Rb蛋白表达异常:视网膜母细胞瘤基因(retinoblastoma gene，Rb基因)，是人类克隆成功的第1个抗癌基因。该基因定位于人染色体13q14，全长约200 kb，所编码蛋白质的相对分子质量为110 ku，Rb蛋白有磷酸化和非磷酸化两种形式存在，并随着细胞周期不同时相的变迁进行着磷酸化和脱磷酸化的过程，而只有脱磷酸化的Rb蛋白才是具有生长抑制作用的活性形式的Rb蛋白[9]。当Rb蛋白处于非磷酸化状态时，与E2F结合成复合物抑制细胞增殖，当其被Cyclin D1.CDK4等复合物磷酸化后，即丧失了结合功能，使细胞通过G1/S调控点，进入新的细胞周期。另外，Rb基因尚可调节一些与细胞增殖有关的基因的转录，如C-fos，TGF-β1，TGF-β2，neu等。当Rb基因发生异常时，细胞进入过度增殖状态，而发生癌变。已发现Rb基因异常(主要为突变和等位性丢失)和蛋白表达异常除与视网膜母细胞瘤异常相关外，还与食管癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[10]。Ueki[11]等研究发现GBMs中Rb基因的异常率为35 %。He[12] 等研究显示Rb蛋白表达的丢失存在于2/18的恶性胶质瘤细胞系和10/45恶性胶质瘤中。本研究显示：62.5 %(20/32)患者有Rb基因蛋白表达量的降低，同时Rb蛋白低表达病例的PI、SPF值明显高于Rb蛋白正常表达的病例，表明Rb蛋白在细胞周期调控中亦起着非常重要的作用，它可使GBMs细胞发生过度增殖而形成肿瘤。■
, 百拇医药
参考文献：
[1]左连富主编.流式细胞术与生物医学.沈阳: 辽宁科学技术出版社，1996.11
[2]Morkve O, Laerum OD. Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin embedded tissue from bronchial carcinomas.Cytometry, 1991,12(5):438
[3]Serrano M,Hannon GJ,Beach D. A new regulatory motify in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D1/CDK4. Nature, 1993,366(6456): 704
, http://www.100md.com
[4]Deryugina EI ,Bardon MA.Tenascin mediates human glioma cell migration and modulates cell migration on fibronectin. J Cell Sci,1996,109(Pt3):643
[5]Giese A ,Loo MA,Norman SA,et al. Contrasting migratory response of astrocytoma cells to tenascin mediated by different integrins. J Cell Sci, 1996, 1099(Pt8) : 2161
[6]Costello JF,Berger MS,Huang HS, et al. Silencing of p16/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation. Cancer Res, 1996,56(10):2405
, 百拇医药
[7]Chintala SK,Sawaya R,Gokaslan ZL,et al. Modulation of matrix metalloprotease-2 and invasion in human glioma cells by alpha 3 beta 1 integrin. Cancer Lett,1996,103(2):201
[8]Tsuzuki T,Tsunoda S,Sakaki T,et al. Alterations of retinoblastoma,p53, p16(CDKN2), and p15 genes in human astrocytomas.Cancer, 1996, 78(2): 287
[9]DeCaprio JA,Ludlow JW,Lynch D,et al.The product of the retinoblastoma susceptibility gene has properties of a cell cycle regulatory element. Cell，1989,58(6):1089
, 百拇医药
[10]岛田守，中村佑辅，门田守人.食管癌における遗传子异常.癌の临床，1996,42:1601
[11]Ueki K,Ono Y,Henson JW,et al. CDKN2/p16 or Rb alterations occur in the majority of glioblastomas and are inversely correlated.Cancer Res, 1996,56(1):150
[12]He J,Olson JJ,James CD,et al. Lack of p16 or retinoblastoma protein or amplification-associated overexpression of CDK4 is observed in distinct subesets of malignant glial tumors and cell lines. Cancer Res,1995,55(21):4833
收稿日期：1999-07-21, http://www.100md.com
单位：河北医科大学第四医院神经外科(石家庄 050011)
关键词：胶质母细胞瘤/病因学；癌基因蛋白质/分析；流式细胞术/方法；细胞增殖
河北医科大学学报000103摘 要：目的 探讨胶质母细胞瘤(glioblastomas,GBMs)中p16、Rb基因表达水平的异常及其与细胞增殖活性之间的关系。方法 应用流式细胞仪检测32例胶质母细胞瘤标本中p16、Rb基因蛋白表达的相对含量。结果 胶质母细胞瘤中p16、Rb基因蛋白表达量较正常脑组织降低，二者的异常可使细胞发生过度增殖。结论 p16基因和Rb基因表达活性降低是胶质母细胞瘤发生发展的重要因素之一。
分类号：R730.23
RELATIONSHIP BETWEEN EXPRESSION OF p16,Rb GENES AND CELL PROLIFERATION IN GLIOBLASTOMAS
, 百拇医药
Li Wenling Zhang Rongxun Li Chunzhong Zhao Wenqing Zhang Xuexing
(Department of Neurosurgery, the Fourth Hospital of Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050011))
ABSTRACT：Objective To explore the abnormalities of expression of p16,Rb genes and the relationship between these abnormalities and the cell proliferation in glioblastomas (GBMs).Methods The expression of p16 gene and Rb gene was measured by flow cytometry in 32 cases of GBMs.Results The amounts of the expression of p16 gene and Rb gene in GBMs were lower than those in normal brains.These abnormalities may cause over proliferation of GBMs cells.Conclusion The abnormalities of expression p16 gene and Rb gene are the important factors for the development of GBMs.
, 百拇医药
KEYWORDS：glioblastoma/etiol;oncogene proteins/anal;flow cytometry/methods;cell proliferation▲
细胞癌变最显著的特征是细胞增殖失控，细胞增殖是由细胞周期的G1→S调控点所控制的。参与细胞周期G1→S点调控的成分有正调节因子:细胞周期蛋白D(cyclin D),细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)等；负调节因子：p16、p21、Rb等。当正调节因子表达异常增殖，负调节因子表达缺失时，可使细胞无限增殖而发生癌变。本文应用流式细胞技术检测胶质母细胞瘤中p16、Rb基因蛋白表达的相对含量，并用增殖指数(proliferation index ,PI)和S期细胞比率(S-phase fraction,SPF)来衡量细胞的增殖活性，以求揭示胶质母细胞瘤发生发展的分子机制。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 研究对象：选用1995年11月～1998年5月经我院神经外科手术切除的胶质母细胞瘤(glioblastomas,GBMs)标本32例，另取颅内减压术中切除的正常脑组织(normal brain,NB)5例为正常对照。全部标本均由10 %福尔马林固定后再经石 蜡包埋，并由两位病理专家根据WHO标准复查其病理诊断。
1.2 主要试剂：一抗，Rb兔抗人多克隆抗体(C-15)、p16鼠抗人单克隆抗体(F-12 )为美国Santa Cruz公司产品。二抗，羊抗兔FITC-IgG、羊抗鼠 FITC - IgG 为美国Jackson Reseach公司产品。
1.3 流式细胞分析样本的制备[1]：①切片，将石蜡包埋组织切成 50 μm厚的组织片(6～8片),然后放入试管中； ②脱蜡，加入二甲苯10 ml，室温下脱蜡48 h(中间换1次二甲苯液)，弃去二甲苯; ③水化,依次加入100 %、95 %、70 %、50 %的梯度酒精及双蒸水5 ml，每步20 min后弃之;④网搓法制备单细胞悬液,将剪碎的组织放在120目不锈钢网上， 用眼科镊轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到组织搓完，收集细胞悬液，再用300目尼龙网过滤后，以1 000 r/min离心3 min，弃上清，制成单细胞悬液; ⑤标记,采用间接免疫标记法，取1×106/ml细胞用PBS液洗涤2次，加入1∶100稀释的一抗100 ml，37 ℃温育30 min，PBS液洗1次，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入1∶20稀释的二抗FITC-IgG100 ml，37 ℃温育30 min，PBS液洗涤1次，除去未结合的多余荧光抗体，加入1 ml PBS液混匀，500目铜网过滤，上机分析。
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1.4 流式细胞仪检测：采用美国B.D公司生产的FACS～420型流式细胞仪，应用单组方图以鸡血红细胞作为标准样品，调整仪器的CV值在5 %以内。
1.5 结果判定
1.5.1 细胞周期分布的计算：应用DNA细胞周期分析软件，计算出DNA组方图各时相分布的百分比，用PI和SPF来表示细胞的增殖活性。其计算公式如下：
1.5.2 p16、Rb的定量分析：p16、Rb基因表达的定量分析按照Morkve[2]等提出的分析方法，以荧光指数(flurorescene index，FI)表示蛋白的相对含量 ，计算方法如下式：
, 百拇医药
Rb、p16基因蛋白表达以FI<1.0为阳性，FI≥1.0为阴性
1.6 统计学处理：所得数据采用t检验，以P<0.05 具统计学意义，并采用直线相关进行两两分析。
2 结 果
2.1 GBMs组p16、Rb的异常:见表1。在GBM中，p16、Rb基因蛋白表达量(FI值) 较正常脑组织降低(P<0.01，P<0.05)。
表1 两组p16,Rb基因蛋白表达量(FI值)的比较
Table 1 Comparison of amounts of expression of p16,Rb genes in GBMs and mornal brain
(
±s) Groups, http://www.100md.com
n
p16
Rb
GBMs
32
0.939 ± 0.093**
0.975±0.115*
Normal brain
8
1.000±0.077
1.000±0.084
* P<0.05 ** P<0.01 vs normal brain by t test2.2 GBMs组的PI 、SPF值:见表2。GBMs组的PI、SPF值较正常脑组织增高，并有显著性差异(P<0.05，P<0.05)。
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表2 两组PI,SPF值的比较
Table 2 Comparison of PI,SPF in GBMs and normal brain
(
±s) Groupsn
PI
SPF
GBMs
32
19.653±6.502*
10.751±3.049*
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Normal brain
8
13.938±5.058
7.59±1.366
* P<0.05 vs normal brain by t test2.3 p16、Rb与PI、SPF的关系:见表3。p16蛋白低表达(阳性)组较p16蛋白正常表达组PI、SPF值增高(P<0.05),Rb蛋白低表达(阳性)组较Rb蛋白正常表达组PI、SPF值增高(P<0.01)。
表3 p16,Rb与PI,SPF的关系
Table 3 Relationship between p16,Rb and PI,SPF
(
±s), 百拇医药
Expression
n
PI
SPF
p16
+
24
20.10±7.245*
11.984±2.236*
-
8
16.52±3.505
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9.051±3.258
Rb
+
20
21.47±7.060**
11.590±2.887**
-
12
15.94±2.870
8.948±2.612
* P<0.05 ** P<0.01 vs negative group by t test 3 讨 论
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3.1 GBMs中p16蛋白表达异常:多肿瘤抑制基因(p16/CDKN2/MTS1基因)，定位于人染色体9P21，由3个外显子(126 bp、37 bp、11 bp)组成，编码蛋白的相对分子质量为15.845 ku(约16 ku )，能与细胞周期蛋白激酶CDK4结合，使其不能解除Rb蛋白对转录因子E2F的抑制，从而阻止细胞由G1期向S期过渡，而直接参与细胞周期的调控[3]。p16基因变异可使细胞无限增殖，而发生癌变。p16基因改变包括基因纯合性缺失[4]、 点突变[5]及5′-CPG区甲基化[6]。 而神经胶质瘤中主要以纯合性缺失为主，但发生率各家报道不一,变动于16 %～69 %之间[7]。Tsuzuki[8]等发现胶质母细胞瘤中p16基因异常与蛋白表达异常的发生率并不一致，43.5 %的患者p16蛋白低表达,而只有30.4 %的患者发生p16基因的缺失或突变，从而认为p16蛋白表达可更好地衡量p16的功能情况。本实验结果显示：GBMs中p16基因蛋白的低表达率为75 %，表明p16缺失与胶质母细胞瘤的发生有关 。并且p16基因蛋白低表达的病例的PI、SPF值明显高于阳性表达的病例，说明p16蛋白量的降低可导致GBMs细胞由G1期向S期过渡，使细胞发生无限制增殖而形成肿瘤。
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3.2 GBMs中Rb蛋白表达异常:视网膜母细胞瘤基因(retinoblastoma gene，Rb基因)，是人类克隆成功的第1个抗癌基因。该基因定位于人染色体13q14，全长约200 kb，所编码蛋白质的相对分子质量为110 ku，Rb蛋白有磷酸化和非磷酸化两种形式存在，并随着细胞周期不同时相的变迁进行着磷酸化和脱磷酸化的过程，而只有脱磷酸化的Rb蛋白才是具有生长抑制作用的活性形式的Rb蛋白[9]。当Rb蛋白处于非磷酸化状态时，与E2F结合成复合物抑制细胞增殖，当其被Cyclin D1.CDK4等复合物磷酸化后，即丧失了结合功能，使细胞通过G1/S调控点，进入新的细胞周期。另外，Rb基因尚可调节一些与细胞增殖有关的基因的转录，如C-fos，TGF-β1，TGF-β2，neu等。当Rb基因发生异常时，细胞进入过度增殖状态，而发生癌变。已发现Rb基因异常(主要为突变和等位性丢失)和蛋白表达异常除与视网膜母细胞瘤异常相关外，还与食管癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[10]。Ueki[11]等研究发现GBMs中Rb基因的异常率为35 %。He[12] 等研究显示Rb蛋白表达的丢失存在于2/18的恶性胶质瘤细胞系和10/45恶性胶质瘤中。本研究显示：62.5 %(20/32)患者有Rb基因蛋白表达量的降低，同时Rb蛋白低表达病例的PI、SPF值明显高于Rb蛋白正常表达的病例，表明Rb蛋白在细胞周期调控中亦起着非常重要的作用，它可使GBMs细胞发生过度增殖而形成肿瘤。■
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参考文献：
[1]左连富主编.流式细胞术与生物医学.沈阳: 辽宁科学技术出版社，1996.11
[2]Morkve O, Laerum OD. Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin embedded tissue from bronchial carcinomas.Cytometry, 1991,12(5):438
[3]Serrano M,Hannon GJ,Beach D. A new regulatory motify in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D1/CDK4. Nature, 1993,366(6456): 704
, http://www.100md.com
[4]Deryugina EI ,Bardon MA.Tenascin mediates human glioma cell migration and modulates cell migration on fibronectin. J Cell Sci,1996,109(Pt3):643
[5]Giese A ,Loo MA,Norman SA,et al. Contrasting migratory response of astrocytoma cells to tenascin mediated by different integrins. J Cell Sci, 1996, 1099(Pt8) : 2161
[6]Costello JF,Berger MS,Huang HS, et al. Silencing of p16/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation. Cancer Res, 1996,56(10):2405
, 百拇医药
[7]Chintala SK,Sawaya R,Gokaslan ZL,et al. Modulation of matrix metalloprotease-2 and invasion in human glioma cells by alpha 3 beta 1 integrin. Cancer Lett,1996,103(2):201
[8]Tsuzuki T,Tsunoda S,Sakaki T,et al. Alterations of retinoblastoma,p53, p16(CDKN2), and p15 genes in human astrocytomas.Cancer, 1996, 78(2): 287
[9]DeCaprio JA,Ludlow JW,Lynch D,et al.The product of the retinoblastoma susceptibility gene has properties of a cell cycle regulatory element. Cell，1989,58(6):1089
, 百拇医药
[10]岛田守，中村佑辅，门田守人.食管癌における遗传子异常.癌の临床，1996,42:1601
[11]Ueki K,Ono Y,Henson JW,et al. CDKN2/p16 or Rb alterations occur in the majority of glioblastomas and are inversely correlated.Cancer Res, 1996,56(1):150
[12]He J,Olson JJ,James CD,et al. Lack of p16 or retinoblastoma protein or amplification-associated overexpression of CDK4 is observed in distinct subesets of malignant glial tumors and cell lines. Cancer Res,1995,55(21):4833
收稿日期：1999-07-21, http://www.100md.com