联合应用反义核酸对慢性粒细胞性白血病骨髓及外周血的净化作用
作者：李澄宇 刘陕西
单位：李澄宇(广州医学院第二附属医院血液科，广州 510260)；刘陕西(西安医科大学第一临床医学院血液科,西安 710061)
关键词：慢性粒细胞白血病；反义寡核苷酸
广州医学院学报000103
提要 目的：比较单独及联合应用BCR-ABL反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide, AS ODN)及C-MYB AS ODN 对慢性粒细胞性细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia, CML)细胞及正常造血细胞的抑制作用。方法：用BCR-ABL AS ODN、C-MYB AS ODN 及错配ODN，分别对10例CML骨髓和外周血单个核细胞(Mononuclear cells, MNC)及8例正常骨髓MNC单独及联合进行处理，用半固体培养检测细胞集落形成率，并用RT-PCR法检测CML细胞BCR-ABL基因表达。结果：3种ODN均对CML细胞集落形成及BCR-ABL基因表达有抑制作用，由强到弱依次为BCR-ABL AS ODN+C-MYB AS ODN组，二者单独应用组及错配组(P<0.05)，三者对于正常造血细胞的集落形成也有一定抑制作用(P<0.01)，其中联合组作用弱于C-MYB AS ODN组。结论：BCR-ABL AS ODN及C-MYB AS ODN联合应用可增强它们对CML细胞生长及BCR-ABL基因表达的抑制作用，而对正常造血细胞的抑制作用则有所减弱。
, 百拇医药
中图分类号 R733.7 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)01-0010-05
The Effect of Antisense Oligodeoxynucleotides in
Combination on the Purge of Bone Marrow and
Peripheral Blood in Cases with Chronic Myelogenous Leukemia
Li Chengyu
(Department of Hematology, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical Collage, Guangzhou 510260)
, 百拇医药
Lin Shanxi
(Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Xian Medical University, Xian 710061)
Objective: To compare the inhibitory effects of BCR-ABL antisense oligodeoxynucleotide (AS ODN) and C-MYB AS ODN used individually and in combination on the growth of chronic myelogenous leukemia(CML)cells and normal hemotopoietic stem cells. Methods: Samples of bone marrow and peripheral blood mononuclear cells (MNC) from 10 cases with CML and 8 normal controls were treated with BCR-ABL AS ODN, C-MYB AS ODN and mismatched ODN individually and in combination respectively, then the colony-forming efficiencies of the cells were scored after being cultured in semisolid medium and the expression of BCR-ABL gene was tested by RT-PCR. Results: All of the ODNs could inhibit the colony-forming efficiency and BCR-ABL gene′s expression in CML cells. The inhibitory effect in BCR-ABL AS ODN +C-MYB AS ODN group was the strongest, that in group of each of them applied individually was weaker, and that in the group of mismatched ODN was the weakest. (P<0.05). They also had a little inhibitory effect on the colony-forming of normal hemotopoietic stem cells (P<0.01), and the effect in combination group was weaker than that in C-MYB AS ODN group (P<0.05). Conclusion: BCR-ABL AS ODN and C-MYB AS ODN used in combination could increase their inhibitory effect on the growth and BCR-ABL gene′s expression in CML cells, but decreased the inhibitory effect on normal hemotopoietic stem cells.
, http://www.100md.com
Key words Chronic myelogenous leukemia；BCR-ABL fusion gene;C-MYB gene;Antisense oligodeoxynucleotide(AS ODN)
目前发现针对慢性粒细胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia, CML)BCR-ABL 融合基因及另一癌基因 C-MYB 的反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide, AS-ODN )均可有效抑制CML 细胞生长而起治疗作用。国外已有将二者应用于临床的报道[1,2]，国内对于这方面亦做了大量实验室研究，但研究对象多限于K562细胞系。而关于联合应用这两种AS ODN 的效果则目前国内外未见报道。我们以CML患者骨髓或外周血单个核细胞(Mononuclear cells, MNC)为实验对象，对单独及联合应用这两种AS ODN对CML的疗效及对正常造血细胞生长的抑制作用进行了研究。1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验对象 CML患者10名，均系1997～1998年西安医科大学第一临床医学院门诊及住院病人，经骨髓形态学检查及Ph染色体检查确诊，抽取其骨髓或外周血并分离出MNC(见表1)。正常造血细胞来自5例非恶性血液病患者骨髓。
1.2 试剂
1.2.1 AS ODN(上海生工) 针对BCR-ABL基因两种类型b2a2及b3a2的mRNA分别合成两条26mer的AS ODN，序列分别为b2a2 AS ODN：CGC TGA AGG GCT TCT TCC TTA TTG AT，b3a2 AS ODN：CGC TGA AGG GCT TTT GAA CTC TGC TT。针对C-MYB mRNA合成18mer AS ODN，序列为 GTG CCG GGG TCT TCG GGC。另合成一条较b3a2 AS ODN缺失3个碱基的23 mer错配ODN，序列为CGC TGA AGG GCT TCT TCC TTA AT。均采用硫代化修饰。
, 百拇医药
1.2.2 CML BCR-ABL融合基因RT-PCR检测试剂盒由上海复星公司提供，PGEM7zf(+)HaeⅢDNA Markers由华美公司提供,粒-单系集落刺激因子(GM-CSF)由美国Schering-plough公司提供，10%聚丙烯酰胺凝胶为美国Sigma公司产品。
表1 CML患者临床资料 序号
性别
年龄
病程
病期
采集细胞来源
1
女
30
, http://www.100md.com
15天
慢性期
骨髓
2
男
42
1年
慢性期
外周血
3
男
70
13年
慢性期
, 百拇医药
骨髓
4
女
45
4月
慢性期
外周血
5
女
46
2月
慢性期
外周血
6
, 百拇医药
女
35
7月
慢性期
骨髓
7
男
50
5年
慢性期
骨髓
8
男
49
, http://www.100md.com
10年
慢性期
骨髓
9
男
40
1.5年
慢性期
骨髓
10
女
32
3月
慢性期
, 百拇医药
外周血
1.3 方法
1.3.1 CML细胞BCR-ABL基因分型鉴定 取适量患者骨髓或外周血MNC，用RT-PCR试剂盒进行扩增，方法参见文献[3]，产物3μl置于10%聚丙烯酰胺凝胶中，在20℃，120V条件下电泳2h，银染法观察DNA条带，方法详见文献[4]。以PGEM7zf(+)HaeⅢ DNA Markers为参照，判定CML细胞BCR-ABL基因类型。
1.3.2 培养及加药 患者MNC培养于含10%小牛血清，100μg/ml GM-CSF的RPMI 1640培养液中，以1×105/孔的密度接种于96孔板内，分6组加药。(1)组为对照组，仅加稀释剂，(2)～(6)组分别加入b2a2 AS ODN，b3a2 AS ODN，C-MYB AS ODN，BCR-ABL AS ODN (b2a2 AS ODN 或b3a2 AS ODN，依患者BCR-ABL基因类型确定)与C-MYB AS ODN1：1混合物及错配ODN，终浓度为80μg/ml，于37℃、5%CO2及完全饱和湿度下培养，3天后移入含20%小牛血清，100μg/mlGM-CSF的0.88%甲基纤维素培养基中行半固体培养，10天后于倒置显微镜下计数细胞集落数。具体操作详见文献[5]。同法分组处理正常骨髓MNC。
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1.3.3 检测BCR-ABL基因表达 收集患者各组细胞，用RT-PCR试剂盒 扩增其BCR-ABL基因，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其表达状况，操作方法同步骤(1.3.1)。依据其银染颜色深浅判定基因表达情况。
1.2.3 计算集落抑制率及统计学处理：
数据用平均值+标准差(
±s)表示，以方差分析及t检验处理。
2 结果
2.1 各AS ODN对CML细胞抑制效果
见表2及表3，其中b3a2 AS ODN对b3a2型CML细胞抑制率为17.25%，b2a2 AS ODN对b2a2型CML细胞为21.87%，C-MYB AS ODN 对两类CML细胞平均为20.27%，均高于错配及未处理组(P<0.01)，而BCR-ABL AS ODN+C-MYB AS ODN联合组平均抑制率为33.89%，高于单独应用组(P<0.01)。
, 百拇医药
2.2 AS ODN 的非序列特异性抑制作用
2.2.1 b2a2 AS ODN 与b3a2 AS ODN对CML集落形成的交叉抑制作用
b3a2 AS ODN对b3a2型CML细胞以及b3a2 AS ODN对b2a2型CML细胞抑制率见表2、表3，与未处理组比较均有显著差异(P<0.05)。
2.2.2 错配ODN对两类CML细胞抑制作用 见表2、表3。错配ODN对b2a2CML细胞及b3a2 CML细胞平均抑制率7.91%,与未处理组比较有显著差异(P<0.05)。
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2.2.3 各ODN对正常造血细胞的抑制作用 所有加入ODN组抑制率均高于未处理组(P<0.01)，其中联合组抑制率小于C-MYB AS ODN组(P<0.05)(见表4)。
表2 单独及联合应用AS ODN对b3a2型CML细胞集落形成的抑制作用(±s) 序号
未处理
联合
b2a2AS
ODN
b3a2AS
, 百拇医药
ODN
C-MYB
AS ODN
Mismatched
ODN
1
153.7±21.6
91.3±14.8
141.7±19
115±28.2
113±18
142±15
, http://www.100md.com
3
267.7±16.8
178.3±15
246±15.7
230.7±13.1
225.3±13.7
237.7±18.5
5
259±19.1
172.7±18.2
237±25.9
210±21.6
, 百拇医药
212.7±20.6
234.3±17.6
6
216.7±20.1
162.7±18.2
208.3±19.2
182.3±16.5
184.7±24.2
214.0±16.7
8
201±12.5
129.3±13.3
, http://www.100md.com
193±17.1
154.7±10.6
158.7±15.5
189±12.2
9
164±20.2
149.7±15.2
160.7±12
158.3±22.3
150.7±11.2
158.3±14.7
10
, 百拇医药
98.3±16.4
62.7±11.6
91.7±8.7
74.7±12.2
72.7±20.2
88.3±10.7
平均值
194.3±60.4
135.2±43.7
182.6±55
160.8±53.7
159.7±54.1
, 百拇医药
180.5±54.5
抑制率(%)
-
30.41*
6.03△
17.25#
17.84#
7.10△
注：*与b3a2 AS ODN组及C-MYB AS ODN组相比，P<0.01;△与未处理组相比，P<0.05；
, 百拇医药
#与b2a2AS ODN组及mismatch ODN组相比，P<0.01表3 单独及联合应用AS ODN对b2a2型CML细胞集落形成的作用(±s) 序号
未处理
联合
b2a2AS
ODN
b3a2AS
ODN
C-MYB
, http://www.100md.com
AS ODN
Mismatched
ODN
2
165.3±14.5
104±15.7
136.7±20
157.7±12.2
137±15.9
157±17
4
216±13.7
, http://www.100md.com
136±16.5
163.3±15.4
194±10.4
158.3±13.6
186.7±23
7
135.3±15
81.3±9.5
104±12
131.7±19.5
102.3±18.6
127.33±25
, 百拇医药
平均值
172.2±40.8
107.1±27.5
134.6±29.7
161.1±31.3
132.5±28.3
157±29.7
抑制率(%)
-
37.81*
21.87#
6.45△
, http://www.100md.com
23.03#
8.84△
注：A与b2a2AS ODN组及C-MYB AS ODN组相比P<0.01；△与未处理组相比，P<0.01；
#与b3a2AS ODN组及mismatch ODN组相比，P<0.01表4 ASODN对正常造血细胞集落形成的影晌 序号
未处理
联合
b2a2ASODN
, 百拇医药 b3a2AS
ODN
C-MYB
AS ODN
Mismatched
ODN
1
109.7±12.6
105±11.5
106.3±15.3
107±12.1
98.7±18
, 百拇医药
105.3±19.5
2
111.3±12.1
107.3±8.3
110.3±10
109.7±18
101±17
110±14.2
3
97±15.9
93.3±16.2
95±17.8
, http://www.100md.com
94±23.3
85±21.5
94.7±25.2
4
72±18.4
69.7±25
71±16.6
70.7±18.8
64.3±18.6
70.7±17.8
5
61±8.7
, 百拇医药
58.7±5.5
59.7±7
59±6.6
55±9.6
60±7.2
平均值
90.5±23
86.8±21.7
88.5±22.2
88.1±22.4
81.6±20.8
88.1±21.9
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抑制率(%)
-
4.12*
2.28*
2.72*
9.87△
2.65*
注：*与未处理组相比P<0.01；A与联合组相比P<0.05
2.3 经处理后CML细胞BCR-ABL基因表达状况：依染色深浅显示，除1例CML患者外(该患者MNC经AS ODN处理生长受抑不明显)，其余9例CML患者MNC经前述处理后，其BCR-ABL基因表达结果为：未处理组与错配组表达最强，联合用药组表达最弱，几乎为阴性，单独用药组介于二者之间。
, 百拇医药
3 讨论
BCR-ABL AS ODN及C-MYB AS ODN是作用机制不同的两种反义核酸，分别通过促进细胞凋亡[6]及抑制细胞增殖[7]来干扰CML细胞生长。因C-MYB基因亦见于正常造血细胞，并对其生长有调控作用，故相应AS ODN对正常造血细胞生长也有一定抑制作用[7]。实验中，当这两种AS ODN联用时，其对CML细胞抑制作用显著提高，而对正常造血细胞生长的抑制作用较单用C-MYB AS ODN为弱，提示从多途径多环节抑制CML细胞生长效果较单一机制优越。且CML细胞对AS ODN也可能存在“耐药”问题，而联用两种作用机制不同的反义核酸可使CML细胞同时对它们产生耐受的机会大为减少，如同联用不同类型抗生素可减少耐药菌产生的机会一样，从而使疗效提高。另外，由于联用时C-MYB AS ODN用量减少，故其对正常造血细胞抑制作用减弱。因此，将两种不同作用机理的反义核酸联用可能是提高AS ODN疗效并降低其毒副作用的有效手段。
, 百拇医药
实验中，所有ODN均对不含互补序列的细胞产生了一定的抑制作用，即表现出非序列特异性抑制作用。这种现象的出现，Maekawa[8]解释说，是由于反义核酸与靶序列之间的结合并非完全遵照碱基互补原理造成的，一般认为至少有10个连续互补的碱基序列存在就可使二者结合并激活核糖核酸酶H(Rnase H)对其降解。本实验中，b2a2 AS ODN、b3a2 AS ODN以及错配ODN均有10个碱基以上的相同序列，因此可产生交叉抑制作用。另外，硫代化ODN分解产物及硫原子的毒性作用亦可影响细胞生长而表现出非序列特异性抑制作用[9]。不过，从实验结果来看，这种作用对正常造血细胞生长的影响是比较弱的。
经AS ODN处理后，CML细胞BCR-ABL基因表达明显减弱，并与细胞集落形成实验的结果有较好的一致性，其机理我们考虑有以下几点：(1)经处理CML细胞由于大量凋亡或增殖受抑，导致其数目明显减少，以至难以用RT-PCR法测出其基因表达。(2)BCR-ABL AS ODN与靶序列结合后激活Rnase H使之降解从而测不出，而CML细胞则有可能存活。因C-MYB基因也在一定程度上调节BCR-ABL基因的表达，故相应AS ODN也可对BCR-ABL基因表达起抑制作用。由于有第二种情况存在的可能，在用RT-PCR法检测经AS ODN治疗的CML患者体内微小残留灶的过程中，有可能存在假阴性结果。这是值得我们重视的问题。
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作者简介：李澄宇，男，(1973.4-)，硕士，住院医师。研究方向：白血病的诊断与治疗。
参考文献
[1]Gewirtz AM, Luger SM, Sokol D,et al.Treating human myelogenous leukemia with c-myb antisense oligodeoxynucleotides: Two years clinical experience[J].J Invest Med,1996；44:227a
[2]Fabritiis P, Amadori S, Petti MC, et al. In vitro purging with BCR-ABL antisense oligodeoxynucleotides does not prevent haematologic reconstitation after antologous bone marrow transplantation[J]. Leukemia,1995;9:662
, 百拇医药
[3]李慧玉,陈燕,李崇渔等. 慢性粒细胞白血病bcr-abl基因检测及临床意义[J]. 临床血液学杂志，1999;11:47
[4]钟东,姜泊,万田谟. DNA的凝胶电泳. 见:姜泊，张亚利,周殿元. 分子生物学常用实验方法[M]. 北京:人民军医出版社, 1996:47
[5]McGahon A,Bissonnette R,Schmitt M, et al. BCR-ABL maintains resistance of chronic myelogenous leukemia cells to apoptotic cell death[J]. Blood, 1994;83:1179
[6] Calabretta B,Sims RB,Valiteri M,et al. Normal and leukemic hematopoietic cells manifest differential sensitivity to inhibitory effects to C-MYB antisense oligodeoxynucleotides: An in vitro study relevant to bone marrow purging[J]. PN AS USA, 1991;88:2351
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[7]Skorski T, Nieborowska-Skorska M, Wlodarski P, et al. Antisense oligodeoxynucleotide combination therapy of primary chronic myelogenous leukemia blast crisis in SCID mice[J]. Blood, 1996;88:1005
[8] Maekawa T, Kimura S, Hirakawa K, et al. Sequence specificity on the growth suppression cells by bcr-abl antisense oligodeoxynucleoside phosphorothioates[J]. Int J Cancer, 1995;62:63
[9] Vaerman JL, Moureau P, Deldime F, et al. Antisense oligodeoxyrib-onucleotides suppress hematologic cell growth through stepsise release of deoxyribonuclestides[J]. Blood, 1997;90:3311
(收稿：1999-12-13), 百拇医药
单位：李澄宇(广州医学院第二附属医院血液科，广州 510260)；刘陕西(西安医科大学第一临床医学院血液科,西安 710061)
关键词：慢性粒细胞白血病；反义寡核苷酸
广州医学院学报000103
提要 目的：比较单独及联合应用BCR-ABL反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide, AS ODN)及C-MYB AS ODN 对慢性粒细胞性细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia, CML)细胞及正常造血细胞的抑制作用。方法：用BCR-ABL AS ODN、C-MYB AS ODN 及错配ODN，分别对10例CML骨髓和外周血单个核细胞(Mononuclear cells, MNC)及8例正常骨髓MNC单独及联合进行处理，用半固体培养检测细胞集落形成率，并用RT-PCR法检测CML细胞BCR-ABL基因表达。结果：3种ODN均对CML细胞集落形成及BCR-ABL基因表达有抑制作用，由强到弱依次为BCR-ABL AS ODN+C-MYB AS ODN组，二者单独应用组及错配组(P<0.05)，三者对于正常造血细胞的集落形成也有一定抑制作用(P<0.01)，其中联合组作用弱于C-MYB AS ODN组。结论：BCR-ABL AS ODN及C-MYB AS ODN联合应用可增强它们对CML细胞生长及BCR-ABL基因表达的抑制作用，而对正常造血细胞的抑制作用则有所减弱。
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中图分类号 R733.7 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)01-0010-05
The Effect of Antisense Oligodeoxynucleotides in
Combination on the Purge of Bone Marrow and
Peripheral Blood in Cases with Chronic Myelogenous Leukemia
Li Chengyu
(Department of Hematology, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical Collage, Guangzhou 510260)
, 百拇医药
Lin Shanxi
(Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Xian Medical University, Xian 710061)
Objective: To compare the inhibitory effects of BCR-ABL antisense oligodeoxynucleotide (AS ODN) and C-MYB AS ODN used individually and in combination on the growth of chronic myelogenous leukemia(CML)cells and normal hemotopoietic stem cells. Methods: Samples of bone marrow and peripheral blood mononuclear cells (MNC) from 10 cases with CML and 8 normal controls were treated with BCR-ABL AS ODN, C-MYB AS ODN and mismatched ODN individually and in combination respectively, then the colony-forming efficiencies of the cells were scored after being cultured in semisolid medium and the expression of BCR-ABL gene was tested by RT-PCR. Results: All of the ODNs could inhibit the colony-forming efficiency and BCR-ABL gene′s expression in CML cells. The inhibitory effect in BCR-ABL AS ODN +C-MYB AS ODN group was the strongest, that in group of each of them applied individually was weaker, and that in the group of mismatched ODN was the weakest. (P<0.05). They also had a little inhibitory effect on the colony-forming of normal hemotopoietic stem cells (P<0.01), and the effect in combination group was weaker than that in C-MYB AS ODN group (P<0.05). Conclusion: BCR-ABL AS ODN and C-MYB AS ODN used in combination could increase their inhibitory effect on the growth and BCR-ABL gene′s expression in CML cells, but decreased the inhibitory effect on normal hemotopoietic stem cells.
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Key words Chronic myelogenous leukemia；BCR-ABL fusion gene;C-MYB gene;Antisense oligodeoxynucleotide(AS ODN)
目前发现针对慢性粒细胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia, CML)BCR-ABL 融合基因及另一癌基因 C-MYB 的反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide, AS-ODN )均可有效抑制CML 细胞生长而起治疗作用。国外已有将二者应用于临床的报道[1,2]，国内对于这方面亦做了大量实验室研究，但研究对象多限于K562细胞系。而关于联合应用这两种AS ODN 的效果则目前国内外未见报道。我们以CML患者骨髓或外周血单个核细胞(Mononuclear cells, MNC)为实验对象，对单独及联合应用这两种AS ODN对CML的疗效及对正常造血细胞生长的抑制作用进行了研究。1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验对象 CML患者10名，均系1997～1998年西安医科大学第一临床医学院门诊及住院病人，经骨髓形态学检查及Ph染色体检查确诊，抽取其骨髓或外周血并分离出MNC(见表1)。正常造血细胞来自5例非恶性血液病患者骨髓。
1.2 试剂
1.2.1 AS ODN(上海生工) 针对BCR-ABL基因两种类型b2a2及b3a2的mRNA分别合成两条26mer的AS ODN，序列分别为b2a2 AS ODN：CGC TGA AGG GCT TCT TCC TTA TTG AT，b3a2 AS ODN：CGC TGA AGG GCT TTT GAA CTC TGC TT。针对C-MYB mRNA合成18mer AS ODN，序列为 GTG CCG GGG TCT TCG GGC。另合成一条较b3a2 AS ODN缺失3个碱基的23 mer错配ODN，序列为CGC TGA AGG GCT TCT TCC TTA AT。均采用硫代化修饰。
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1.2.2 CML BCR-ABL融合基因RT-PCR检测试剂盒由上海复星公司提供，PGEM7zf(+)HaeⅢDNA Markers由华美公司提供,粒-单系集落刺激因子(GM-CSF)由美国Schering-plough公司提供，10%聚丙烯酰胺凝胶为美国Sigma公司产品。
表1 CML患者临床资料 序号
性别
年龄
病程
病期
采集细胞来源
1
女
30
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15天
慢性期
骨髓
2
男
42
1年
慢性期
外周血
3
男
70
13年
慢性期
, 百拇医药
骨髓
4
女
45
4月
慢性期
外周血
5
女
46
2月
慢性期
外周血
6
, 百拇医药
女
35
7月
慢性期
骨髓
7
男
50
5年
慢性期
骨髓
8
男
49
, http://www.100md.com
10年
慢性期
骨髓
9
男
40
1.5年
慢性期
骨髓
10
女
32
3月
慢性期
, 百拇医药
外周血
1.3 方法
1.3.1 CML细胞BCR-ABL基因分型鉴定 取适量患者骨髓或外周血MNC，用RT-PCR试剂盒进行扩增，方法参见文献[3]，产物3μl置于10%聚丙烯酰胺凝胶中，在20℃，120V条件下电泳2h，银染法观察DNA条带，方法详见文献[4]。以PGEM7zf(+)HaeⅢ DNA Markers为参照，判定CML细胞BCR-ABL基因类型。
1.3.2 培养及加药 患者MNC培养于含10%小牛血清，100μg/ml GM-CSF的RPMI 1640培养液中，以1×105/孔的密度接种于96孔板内，分6组加药。(1)组为对照组，仅加稀释剂，(2)～(6)组分别加入b2a2 AS ODN，b3a2 AS ODN，C-MYB AS ODN，BCR-ABL AS ODN (b2a2 AS ODN 或b3a2 AS ODN，依患者BCR-ABL基因类型确定)与C-MYB AS ODN1：1混合物及错配ODN，终浓度为80μg/ml，于37℃、5%CO2及完全饱和湿度下培养，3天后移入含20%小牛血清，100μg/mlGM-CSF的0.88%甲基纤维素培养基中行半固体培养，10天后于倒置显微镜下计数细胞集落数。具体操作详见文献[5]。同法分组处理正常骨髓MNC。
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1.3.3 检测BCR-ABL基因表达 收集患者各组细胞，用RT-PCR试剂盒 扩增其BCR-ABL基因，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其表达状况，操作方法同步骤(1.3.1)。依据其银染颜色深浅判定基因表达情况。
1.2.3 计算集落抑制率及统计学处理：
数据用平均值+标准差(
±s)表示，以方差分析及t检验处理。2 结果
2.1 各AS ODN对CML细胞抑制效果
见表2及表3，其中b3a2 AS ODN对b3a2型CML细胞抑制率为17.25%，b2a2 AS ODN对b2a2型CML细胞为21.87%，C-MYB AS ODN 对两类CML细胞平均为20.27%，均高于错配及未处理组(P<0.01)，而BCR-ABL AS ODN+C-MYB AS ODN联合组平均抑制率为33.89%，高于单独应用组(P<0.01)。
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2.2 AS ODN 的非序列特异性抑制作用
2.2.1 b2a2 AS ODN 与b3a2 AS ODN对CML集落形成的交叉抑制作用
b3a2 AS ODN对b3a2型CML细胞以及b3a2 AS ODN对b2a2型CML细胞抑制率见表2、表3，与未处理组比较均有显著差异(P<0.05)。
2.2.2 错配ODN对两类CML细胞抑制作用 见表2、表3。错配ODN对b2a2CML细胞及b3a2 CML细胞平均抑制率7.91%,与未处理组比较有显著差异(P<0.05)。
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2.2.3 各ODN对正常造血细胞的抑制作用 所有加入ODN组抑制率均高于未处理组(P<0.01)，其中联合组抑制率小于C-MYB AS ODN组(P<0.05)(见表4)。
表2 单独及联合应用AS ODN对b3a2型CML细胞集落形成的抑制作用(
±s) 序号未处理
联合
b2a2AS
ODN
b3a2AS
, 百拇医药
ODN
C-MYB
AS ODN
Mismatched
ODN
1
153.7±21.6
91.3±14.8
141.7±19
115±28.2
113±18
142±15
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3
267.7±16.8
178.3±15
246±15.7
230.7±13.1
225.3±13.7
237.7±18.5
5
259±19.1
172.7±18.2
237±25.9
210±21.6
, 百拇医药
212.7±20.6
234.3±17.6
6
216.7±20.1
162.7±18.2
208.3±19.2
182.3±16.5
184.7±24.2
214.0±16.7
8
201±12.5
129.3±13.3
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193±17.1
154.7±10.6
158.7±15.5
189±12.2
9
164±20.2
149.7±15.2
160.7±12
158.3±22.3
150.7±11.2
158.3±14.7
10
, 百拇医药
98.3±16.4
62.7±11.6
91.7±8.7
74.7±12.2
72.7±20.2
88.3±10.7
平均值
194.3±60.4
135.2±43.7
182.6±55
160.8±53.7
159.7±54.1
, 百拇医药
180.5±54.5
抑制率(%)
-
30.41*
6.03△
17.25#
17.84#
7.10△
注：*与b3a2 AS ODN组及C-MYB AS ODN组相比，P<0.01;△与未处理组相比，P<0.05；
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#与b2a2AS ODN组及mismatch ODN组相比，P<0.01表3 单独及联合应用AS ODN对b2a2型CML细胞集落形成的作用(
±s) 序号未处理
联合
b2a2AS
ODN
b3a2AS
ODN
C-MYB
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AS ODN
Mismatched
ODN
2
165.3±14.5
104±15.7
136.7±20
157.7±12.2
137±15.9
157±17
4
216±13.7
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136±16.5
163.3±15.4
194±10.4
158.3±13.6
186.7±23
7
135.3±15
81.3±9.5
104±12
131.7±19.5
102.3±18.6
127.33±25
, 百拇医药
平均值
172.2±40.8
107.1±27.5
134.6±29.7
161.1±31.3
132.5±28.3
157±29.7
抑制率(%)
-
37.81*
21.87#
6.45△
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23.03#
8.84△
注：A与b2a2AS ODN组及C-MYB AS ODN组相比P<0.01；△与未处理组相比，P<0.01；
#与b3a2AS ODN组及mismatch ODN组相比，P<0.01表4 ASODN对正常造血细胞集落形成的影晌 序号
未处理
联合
b2a2ASODN
, 百拇医药 b3a2AS
ODN
C-MYB
AS ODN
Mismatched
ODN
1
109.7±12.6
105±11.5
106.3±15.3
107±12.1
98.7±18
, 百拇医药
105.3±19.5
2
111.3±12.1
107.3±8.3
110.3±10
109.7±18
101±17
110±14.2
3
97±15.9
93.3±16.2
95±17.8
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94±23.3
85±21.5
94.7±25.2
4
72±18.4
69.7±25
71±16.6
70.7±18.8
64.3±18.6
70.7±17.8
5
61±8.7
, 百拇医药
58.7±5.5
59.7±7
59±6.6
55±9.6
60±7.2
平均值
90.5±23
86.8±21.7
88.5±22.2
88.1±22.4
81.6±20.8
88.1±21.9
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抑制率(%)
-
4.12*
2.28*
2.72*
9.87△
2.65*
注：*与未处理组相比P<0.01；A与联合组相比P<0.05
2.3 经处理后CML细胞BCR-ABL基因表达状况：依染色深浅显示，除1例CML患者外(该患者MNC经AS ODN处理生长受抑不明显)，其余9例CML患者MNC经前述处理后，其BCR-ABL基因表达结果为：未处理组与错配组表达最强，联合用药组表达最弱，几乎为阴性，单独用药组介于二者之间。
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3 讨论
BCR-ABL AS ODN及C-MYB AS ODN是作用机制不同的两种反义核酸，分别通过促进细胞凋亡[6]及抑制细胞增殖[7]来干扰CML细胞生长。因C-MYB基因亦见于正常造血细胞，并对其生长有调控作用，故相应AS ODN对正常造血细胞生长也有一定抑制作用[7]。实验中，当这两种AS ODN联用时，其对CML细胞抑制作用显著提高，而对正常造血细胞生长的抑制作用较单用C-MYB AS ODN为弱，提示从多途径多环节抑制CML细胞生长效果较单一机制优越。且CML细胞对AS ODN也可能存在“耐药”问题，而联用两种作用机制不同的反义核酸可使CML细胞同时对它们产生耐受的机会大为减少，如同联用不同类型抗生素可减少耐药菌产生的机会一样，从而使疗效提高。另外，由于联用时C-MYB AS ODN用量减少，故其对正常造血细胞抑制作用减弱。因此，将两种不同作用机理的反义核酸联用可能是提高AS ODN疗效并降低其毒副作用的有效手段。
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实验中，所有ODN均对不含互补序列的细胞产生了一定的抑制作用，即表现出非序列特异性抑制作用。这种现象的出现，Maekawa[8]解释说，是由于反义核酸与靶序列之间的结合并非完全遵照碱基互补原理造成的，一般认为至少有10个连续互补的碱基序列存在就可使二者结合并激活核糖核酸酶H(Rnase H)对其降解。本实验中，b2a2 AS ODN、b3a2 AS ODN以及错配ODN均有10个碱基以上的相同序列，因此可产生交叉抑制作用。另外，硫代化ODN分解产物及硫原子的毒性作用亦可影响细胞生长而表现出非序列特异性抑制作用[9]。不过，从实验结果来看，这种作用对正常造血细胞生长的影响是比较弱的。
经AS ODN处理后，CML细胞BCR-ABL基因表达明显减弱，并与细胞集落形成实验的结果有较好的一致性，其机理我们考虑有以下几点：(1)经处理CML细胞由于大量凋亡或增殖受抑，导致其数目明显减少，以至难以用RT-PCR法测出其基因表达。(2)BCR-ABL AS ODN与靶序列结合后激活Rnase H使之降解从而测不出，而CML细胞则有可能存活。因C-MYB基因也在一定程度上调节BCR-ABL基因的表达，故相应AS ODN也可对BCR-ABL基因表达起抑制作用。由于有第二种情况存在的可能，在用RT-PCR法检测经AS ODN治疗的CML患者体内微小残留灶的过程中，有可能存在假阴性结果。这是值得我们重视的问题。
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作者简介：李澄宇，男，(1973.4-)，硕士，住院医师。研究方向：白血病的诊断与治疗。
参考文献
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(收稿：1999-12-13), 百拇医药