脑外伤后脑干组织中血管内皮细胞及血浆蛋白分布改变的免疫组化研究
作者：邓平 宋一璇 祝家镇
单位：邓平(广州医学院神经科学研究所，广州 510182)；宋一璇 祝家镇(中山医科大学法医学系，广州 510089)
关键词：脑外伤；脑干；血脑屏障；血浆蛋白
广州医学院学报000102提要 目的：探讨脑外伤后脑干组织中血脑屏障和神经细胞的病理学改变。方法：采用免疫组化染色显示人体脑干组织中的血管内皮细胞(CD31)和某些血浆蛋白(白蛋白及 IgM)。结果：1.在正常脑干组织中， CD31阳性物呈连续的线条状，围成规则的血管腔，其周围无明显间隙；血浆蛋白位于血管内，未见到血浆/蛋白阳性神经细胞或神经纤维。2.脑外伤后，脑干中的 CD31阳性物呈不规则弯曲的小片段状，围成不规则的血管腔，其周围间隙明显增宽；同时可见到白蛋白及IgM阳性神经细胞和神经纤维。结论：脑外伤后，脑干组织中的血脑屏障受到了破坏，而且神经细胞也有不同程度的损伤。
, 百拇医药
中图分类号 R651.1 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)01-0007-04
An Immunohistochemical Study on Changes of Vascular
Endothelial Cells and Plasma Proteins in Brainstem Following Cerebral Trauma
Deng Ping, Song Yixuan,Zhu Jiazhen
(Research Institute of Neuroscience, Guangzhou Medical
College,Guangzhou 510182)
, http://www.100md.com
Objective:To understand the pathological changes of blood-brain barrier and neural cells in brainstem following cerebral trauma. Methods:The vascular endothelial cells(CD31) and plasma proteins (albumin and IgM) in human brainstem were demonstrated immunohistochemically.Results∶(1) In normal brainstem tissue,the vascular endothelial cells stained with anti-CD31 antiserum were continuous with each other without obvious perivascular spaces.Positively stained plasma proteins could only be observed within blood vessels,there seemed to be no plasma protein-positive neural cells or nerve fibers.(2) In the brainstem with cerebral trauma,clusters of divorced endothelial cells were observed in blood vessels with perivascular space remarkably widened.Moreover,staining of albumin,IgM positive neural cells and nerve fibers were observed.Conclusion:The blood-brain barrier as well as neural cells in brainstem were damaged after cerebral trauma.
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Key words Cerebral trauma;Brainstem;Blood-brain barrier;Plasma protein
脑组织损伤后，血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)将受到破坏[1]，血浆蛋白可从血液中达到血管周围的神经组织，甚至进入神经细胞的胞浆中。有实验发现，在脑挫伤后数分钟内，血管周围的神经组织呈白蛋白免疫阳性反应[2]，说明在脑损伤早期即有血浆蛋白的免疫组化改变。 CD31是血管内皮细胞的标记物之一，是内皮细胞膜上的一种糖蛋白，分子量为100～110kD，应用抗CD31抗体能显示血管内皮细胞[3]。本研究拟探讨脑外伤后脑干组织中血脑屏障和神经细胞的病理学改变，为进一步阐明脑干损伤后的机能改变提供实验依据。1 材料与方法
1.1 人体标本 13例脑干标本取自广州市公安局近年部分尸检案例。其中，脑外伤组7例，在伤后0.5～22h死亡，均有明确的头面部外伤史，排除疾病、中毒及颅脑以外脏器损伤致死等死因，常规检查无颅骨骨折，颅内无明显占位性病变，脑干有轻微水肿或点状出血，其它部位的脑组织损伤极轻微；正常脑干组6例，无头面部外伤史，有明确的颅脑以外的死因，常规检查脑组织无病理改变。死后24h内取出脑干，冠状切取中脑下丘平面、桥脑听结节平面及延髓橄榄中部平面等组织块，常规制成蜡块，连续切片(1Oμm)。
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1.2 实验试剂 兔抗人白蛋白(DAKO，1∶50)和 IgM(Maxim，即用型)，鼠抗人 CD31 (Neomarks，1：25)； LSAB Kit(广谱)(Maxim，即用型)；其它免疫组织化学常规试剂。
1.3 HE 染色及免疫组织化学染色 HE染色按常规进行； LSAB免疫组织化学染色按试剂盒提供的步骤进行，苏木素轻度复染。阴性对照用正常血清或 PBS代替一抗。
2 结果
2.1 HE 染色 正常脑干组未见明显病变。而在脑外伤组，可见脑干组织水肿及点状出血，神经元肿胀；伤后较长时间死亡者，部分神经元出现缺血性改变。
2.2 免疫组化染色 (1)正常脑干组， CD31 阳性物呈连续的线条状，围成规则的血管腔，结构完整，血管周围的组织间隙窄(图1)。白蛋白及 IgM 阳性物主要f位于血管腔内，未见血浆蛋白阳性神经细胞和神经纤维。(2)脑外伤组， CD31阳性物呈不规则弯曲的小片段状，不连续，围成不规则的血管腔，并且血管周围的组织间隙明显增宽(图2)；部分 CD31 阳性物不围成血管，无完整结构。脑干组织中可见大量白蛋白及 IgM 阳性神经细胞和神经纤维(图3，4)。在神经细胞中，阳性物主要位于胞浆，呈弥漫性分布或靠近胞膜呈一环状；在神经纤维中，阳性物呈节段性分布，阳性纤维弯曲、粗细不均，多数为中间段粗，两端较细。
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图1 正常脑干组(桥脑听结节平面)，CD31 阳性物呈连续的线状，围成规则的血管腔，其周围无明显组织间隙(×200)
图2 脑外伤组(中脑下丘平面)，CD31阳性物围成不规则的血管腔，周围组织间隙明显增宽(×200)
图3 脑外伤组(延髓橄榄中部平面)，网状结构中有大量的白蛋白阳性神经细胞和神经纤维(×200)
图4 脑外伤组(延髓橄榄中部平面)，网状结构中有大量的IgM阳性神经细胞和神经纤维(×00)3 讨论
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3.1 脑损伤后 BBB 的改变 脑组织受到损伤后，血液中的辣根过氧化物酶及Evans蓝[4]等物质均可进入脑组织，说明 BBB 受到了破坏。本研究用 CD31标记血管内皮细胞，发现在正常脑干组织中，CD31 阳性物呈连续的线条状，围成规则的血管腔；而在脑外伤组的脑干组织中，CD31 阳性物呈不规则弯曲的小片段状，围成不规则的血管腔。目前，有关脑损伤后血管内皮细胞改变的类似研究尚未见报道。我们推测，血管内皮细胞发生上述形态学改变可能与血管在损伤后发生痉挛导致内皮细胞从血管壁上脱落等有关。已有研究表明， BBB 异常可表现为两种形式[2]：(1)结构破坏，多由外力作用于脑组织直接造成血管破裂，血液中的各种成分均可进入脑组织，不受分子大小的限制；(2)功能障碍，多由缺血、早期梗死等病理改变间接导致血管通透性增加，对进入脑组织的血液成分具有选择性。本研究发现，在脑外伤组的脑干组织中，可见到白蛋白及 IgM进入到血管周围的神经组织中，并出现免疫阳性细胞，说明脑干中的 BBB 在脑外伤后发生了功能障碍或/和结构破坏。
, 百拇医药
3.2 脑损伤后出现血浆蛋白阳性神经细胞的意义 研究表明[5]，脑损伤后，血浆蛋白可达到血管外，并出现血浆蛋白阳性神经细胞。目前，有关血浆蛋白阳性神经细胞产生的机理尚不清楚。一般认为，在 BBB 损伤的基础上，血浆蛋白进入神经细胞可能有两条途径：(1)以渗透方式顺浓度梯度进入，为被动转运过程；(2)经胞膜上的蛋白通道进入，为主动摄取过程[6]。而对某一细胞，两种途径是单独或共同存在，尚需进一步研究。我们推测，对于损伤较重的细胞，细胞膜功能在早期尚未完全丧失，可通过蛋白通道主动摄取血浆蛋白，而晚期由于细胞膜功能完全丧失，血浆蛋白可顺浓度梯度渗入胞浆，至胞内外浓度达到平衡；对于损伤轻微或未受损伤的细胞，胞膜功能可一直维持正常，可通过胞膜上的蛋白通道摄取或不摄取血浆蛋白。血浆蛋白阳性物在胞浆内的多少及分布有两种情况[7]：(1)阳性物少而仅位于靠近胞膜的胞浆中，可能是由胞体的细胞膜、树突及轴突末端摄入所致，这类细胞所受损伤极轻或末受损伤；(2)阳性物多，在胞浆中呈弥散分布，可能是被动转入所致，提示细胞膜功能丧失，神经细胞可能发生了不可逆损伤。本实验同时观察了白蛋白和 IgM在脑外伤后的改变，根据两者本身的理化特性，白蛋白的分子量小，容易通过受损的 BBB和细胞膜，因而在损伤后的改变较为敏感；IgM 的分子量大，只有当 BBB 和细胞膜的损伤达到相当程度后才能进入胞浆内，因而其改变比白蛋白更能反映脑干损伤程度。我们还观察到，除血浆蛋白阳性神经细胞外，还可见到大量阳性神经纤维，并且阳性物呈节段性分布，这可能与神经纤维的质膜受到损伤及其通透性增加有关[8]。值得指出的是，呈血浆蛋白阳性反应的神经细胞(特别是胞浆内的阳性物呈弥散性分布者)和神经纤维，其功能必将发生改变，它们对脑干整体机能的影响值得进一步研究。
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基金项目：国家自然科学基金(39470766)。
作者简介：邓平，男，(1970.11-)，博士，助理研究员。研究方向：颅脑损伤与癫痫发病机理。
参考文献
[1]Schmidt R.H. Grady M.S Regional patterns of blood-brain barrier breakdown following cemtral and lateral fluid percrssion injury in rodents[J].J Neurotrauma,1993;10:415～430
[2]Liu H.M,Sturner W.Q.Extravasation of plasma proteins in brain trauma[J].Forensic Sci Int,1988;38:285～295
, 百拇医药
[3]Parums D.V,Cordell J.L Micklem K,et al.JC70:a new monoclonal antibody that detects vascular endothelium associated antigen on routinely processed tissue sections[J].J Clin Pathol,1990;43:752～757
[4]Tengvar C.Extensive intraneuronal spread of horseradish peroxidase from a focus of vasogenic edema into remote areas of central nervous system[J].Acta Neuropathol,1986;71:177～189
[5]Baldwin S.A,Fugaccia Brown D.R,et al.Blood-brain barrier breach following cortical contusion in the rat[J].J Neurosurg,1996;85:476～481
, 百拇医药
[6]Loberg E.M, Torvik A.Uptake of plasma proteins into damaged neurons[J].Acta Neuropathol,1991;81:479～485
[7]Hoshino S,Kobayashi S., Nakazawa S.Prolonged and extensive IgG immunoreactivity after severe fluid-percussion injury in rat brain[J]. Brain Res,1996;711:73～83
[8]Pettus E.H, Povishock J.T.Characterization of a distinct set of intra-axonal ultrastructural changes associated with traumatically induced alteration in axolemmal permeability[J].Brain Res,1996;722:1～11
(收稿：1999-12-14), 百拇医药
单位：邓平(广州医学院神经科学研究所，广州 510182)；宋一璇 祝家镇(中山医科大学法医学系，广州 510089)
关键词：脑外伤；脑干；血脑屏障；血浆蛋白
广州医学院学报000102提要 目的：探讨脑外伤后脑干组织中血脑屏障和神经细胞的病理学改变。方法：采用免疫组化染色显示人体脑干组织中的血管内皮细胞(CD31)和某些血浆蛋白(白蛋白及 IgM)。结果：1.在正常脑干组织中， CD31阳性物呈连续的线条状，围成规则的血管腔，其周围无明显间隙；血浆蛋白位于血管内，未见到血浆/蛋白阳性神经细胞或神经纤维。2.脑外伤后，脑干中的 CD31阳性物呈不规则弯曲的小片段状，围成不规则的血管腔，其周围间隙明显增宽；同时可见到白蛋白及IgM阳性神经细胞和神经纤维。结论：脑外伤后，脑干组织中的血脑屏障受到了破坏，而且神经细胞也有不同程度的损伤。
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中图分类号 R651.1 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)01-0007-04
An Immunohistochemical Study on Changes of Vascular
Endothelial Cells and Plasma Proteins in Brainstem Following Cerebral Trauma
Deng Ping, Song Yixuan,Zhu Jiazhen
(Research Institute of Neuroscience, Guangzhou Medical
College,Guangzhou 510182)
, http://www.100md.com
Objective:To understand the pathological changes of blood-brain barrier and neural cells in brainstem following cerebral trauma. Methods:The vascular endothelial cells(CD31) and plasma proteins (albumin and IgM) in human brainstem were demonstrated immunohistochemically.Results∶(1) In normal brainstem tissue,the vascular endothelial cells stained with anti-CD31 antiserum were continuous with each other without obvious perivascular spaces.Positively stained plasma proteins could only be observed within blood vessels,there seemed to be no plasma protein-positive neural cells or nerve fibers.(2) In the brainstem with cerebral trauma,clusters of divorced endothelial cells were observed in blood vessels with perivascular space remarkably widened.Moreover,staining of albumin,IgM positive neural cells and nerve fibers were observed.Conclusion:The blood-brain barrier as well as neural cells in brainstem were damaged after cerebral trauma.
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Key words Cerebral trauma;Brainstem;Blood-brain barrier;Plasma protein
脑组织损伤后，血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)将受到破坏[1]，血浆蛋白可从血液中达到血管周围的神经组织，甚至进入神经细胞的胞浆中。有实验发现，在脑挫伤后数分钟内，血管周围的神经组织呈白蛋白免疫阳性反应[2]，说明在脑损伤早期即有血浆蛋白的免疫组化改变。 CD31是血管内皮细胞的标记物之一，是内皮细胞膜上的一种糖蛋白，分子量为100～110kD，应用抗CD31抗体能显示血管内皮细胞[3]。本研究拟探讨脑外伤后脑干组织中血脑屏障和神经细胞的病理学改变，为进一步阐明脑干损伤后的机能改变提供实验依据。1 材料与方法
1.1 人体标本 13例脑干标本取自广州市公安局近年部分尸检案例。其中，脑外伤组7例，在伤后0.5～22h死亡，均有明确的头面部外伤史，排除疾病、中毒及颅脑以外脏器损伤致死等死因，常规检查无颅骨骨折，颅内无明显占位性病变，脑干有轻微水肿或点状出血，其它部位的脑组织损伤极轻微；正常脑干组6例，无头面部外伤史，有明确的颅脑以外的死因，常规检查脑组织无病理改变。死后24h内取出脑干，冠状切取中脑下丘平面、桥脑听结节平面及延髓橄榄中部平面等组织块，常规制成蜡块，连续切片(1Oμm)。
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1.2 实验试剂 兔抗人白蛋白(DAKO，1∶50)和 IgM(Maxim，即用型)，鼠抗人 CD31 (Neomarks，1：25)； LSAB Kit(广谱)(Maxim，即用型)；其它免疫组织化学常规试剂。
1.3 HE 染色及免疫组织化学染色 HE染色按常规进行； LSAB免疫组织化学染色按试剂盒提供的步骤进行，苏木素轻度复染。阴性对照用正常血清或 PBS代替一抗。
2 结果
2.1 HE 染色 正常脑干组未见明显病变。而在脑外伤组，可见脑干组织水肿及点状出血，神经元肿胀；伤后较长时间死亡者，部分神经元出现缺血性改变。
2.2 免疫组化染色 (1)正常脑干组， CD31 阳性物呈连续的线条状，围成规则的血管腔，结构完整，血管周围的组织间隙窄(图1)。白蛋白及 IgM 阳性物主要f位于血管腔内，未见血浆蛋白阳性神经细胞和神经纤维。(2)脑外伤组， CD31阳性物呈不规则弯曲的小片段状，不连续，围成不规则的血管腔，并且血管周围的组织间隙明显增宽(图2)；部分 CD31 阳性物不围成血管，无完整结构。脑干组织中可见大量白蛋白及 IgM 阳性神经细胞和神经纤维(图3，4)。在神经细胞中，阳性物主要位于胞浆，呈弥漫性分布或靠近胞膜呈一环状；在神经纤维中，阳性物呈节段性分布，阳性纤维弯曲、粗细不均，多数为中间段粗，两端较细。
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图1 正常脑干组(桥脑听结节平面)，CD31 阳性物呈连续的线状，围成规则的血管腔，其周围无明显组织间隙(×200)
图2 脑外伤组(中脑下丘平面)，CD31阳性物围成不规则的血管腔，周围组织间隙明显增宽(×200)
图3 脑外伤组(延髓橄榄中部平面)，网状结构中有大量的白蛋白阳性神经细胞和神经纤维(×200)
图4 脑外伤组(延髓橄榄中部平面)，网状结构中有大量的IgM阳性神经细胞和神经纤维(×00)3 讨论
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3.1 脑损伤后 BBB 的改变 脑组织受到损伤后，血液中的辣根过氧化物酶及Evans蓝[4]等物质均可进入脑组织，说明 BBB 受到了破坏。本研究用 CD31标记血管内皮细胞，发现在正常脑干组织中，CD31 阳性物呈连续的线条状，围成规则的血管腔；而在脑外伤组的脑干组织中，CD31 阳性物呈不规则弯曲的小片段状，围成不规则的血管腔。目前，有关脑损伤后血管内皮细胞改变的类似研究尚未见报道。我们推测，血管内皮细胞发生上述形态学改变可能与血管在损伤后发生痉挛导致内皮细胞从血管壁上脱落等有关。已有研究表明， BBB 异常可表现为两种形式[2]：(1)结构破坏，多由外力作用于脑组织直接造成血管破裂，血液中的各种成分均可进入脑组织，不受分子大小的限制；(2)功能障碍，多由缺血、早期梗死等病理改变间接导致血管通透性增加，对进入脑组织的血液成分具有选择性。本研究发现，在脑外伤组的脑干组织中，可见到白蛋白及 IgM进入到血管周围的神经组织中，并出现免疫阳性细胞，说明脑干中的 BBB 在脑外伤后发生了功能障碍或/和结构破坏。
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3.2 脑损伤后出现血浆蛋白阳性神经细胞的意义 研究表明[5]，脑损伤后，血浆蛋白可达到血管外，并出现血浆蛋白阳性神经细胞。目前，有关血浆蛋白阳性神经细胞产生的机理尚不清楚。一般认为，在 BBB 损伤的基础上，血浆蛋白进入神经细胞可能有两条途径：(1)以渗透方式顺浓度梯度进入，为被动转运过程；(2)经胞膜上的蛋白通道进入，为主动摄取过程[6]。而对某一细胞，两种途径是单独或共同存在，尚需进一步研究。我们推测，对于损伤较重的细胞，细胞膜功能在早期尚未完全丧失，可通过蛋白通道主动摄取血浆蛋白，而晚期由于细胞膜功能完全丧失，血浆蛋白可顺浓度梯度渗入胞浆，至胞内外浓度达到平衡；对于损伤轻微或未受损伤的细胞，胞膜功能可一直维持正常，可通过胞膜上的蛋白通道摄取或不摄取血浆蛋白。血浆蛋白阳性物在胞浆内的多少及分布有两种情况[7]：(1)阳性物少而仅位于靠近胞膜的胞浆中，可能是由胞体的细胞膜、树突及轴突末端摄入所致，这类细胞所受损伤极轻或末受损伤；(2)阳性物多，在胞浆中呈弥散分布，可能是被动转入所致，提示细胞膜功能丧失，神经细胞可能发生了不可逆损伤。本实验同时观察了白蛋白和 IgM在脑外伤后的改变，根据两者本身的理化特性，白蛋白的分子量小，容易通过受损的 BBB和细胞膜，因而在损伤后的改变较为敏感；IgM 的分子量大，只有当 BBB 和细胞膜的损伤达到相当程度后才能进入胞浆内，因而其改变比白蛋白更能反映脑干损伤程度。我们还观察到，除血浆蛋白阳性神经细胞外，还可见到大量阳性神经纤维，并且阳性物呈节段性分布，这可能与神经纤维的质膜受到损伤及其通透性增加有关[8]。值得指出的是，呈血浆蛋白阳性反应的神经细胞(特别是胞浆内的阳性物呈弥散性分布者)和神经纤维，其功能必将发生改变，它们对脑干整体机能的影响值得进一步研究。
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基金项目：国家自然科学基金(39470766)。
作者简介：邓平，男，(1970.11-)，博士，助理研究员。研究方向：颅脑损伤与癫痫发病机理。
参考文献
[1]Schmidt R.H. Grady M.S Regional patterns of blood-brain barrier breakdown following cemtral and lateral fluid percrssion injury in rodents[J].J Neurotrauma,1993;10:415～430
[2]Liu H.M,Sturner W.Q.Extravasation of plasma proteins in brain trauma[J].Forensic Sci Int,1988;38:285～295
, 百拇医药
[3]Parums D.V,Cordell J.L Micklem K,et al.JC70:a new monoclonal antibody that detects vascular endothelium associated antigen on routinely processed tissue sections[J].J Clin Pathol,1990;43:752～757
[4]Tengvar C.Extensive intraneuronal spread of horseradish peroxidase from a focus of vasogenic edema into remote areas of central nervous system[J].Acta Neuropathol,1986;71:177～189
[5]Baldwin S.A,Fugaccia Brown D.R,et al.Blood-brain barrier breach following cortical contusion in the rat[J].J Neurosurg,1996;85:476～481
, 百拇医药
[6]Loberg E.M, Torvik A.Uptake of plasma proteins into damaged neurons[J].Acta Neuropathol,1991;81:479～485
[7]Hoshino S,Kobayashi S., Nakazawa S.Prolonged and extensive IgG immunoreactivity after severe fluid-percussion injury in rat brain[J]. Brain Res,1996;711:73～83
[8]Pettus E.H, Povishock J.T.Characterization of a distinct set of intra-axonal ultrastructural changes associated with traumatically induced alteration in axolemmal permeability[J].Brain Res,1996;722:1～11
(收稿：1999-12-14), 百拇医药