中华眼镜蛇毒组分C抗白血病作用的实验研究
作者：谭获 冯莹 叶絮 庞缨 赖毅妍 余清声 管锦霞 林振桃 应红光 郝玉书 张广森
单位：谭获 冯莹 叶絮 庞缨 赖毅妍(广州医学院第二附属医院内科，广州 510260)；余清声 管锦霞 林振桃(广州医学院蛇毒研究所)；应红光 郝玉书(中国医学科学院血液学研究所)；张广森(湖南医科大学第二附属医院)
关键词：眼镜蛇毒；白血病；细胞株；细胞毒；凋亡Bcl-2/Bax基因
广州医学院学报000101提要 目的：研究眼镜蛇毒组分C对白血病细胞的直接作用及机制。方法：应用MTT、DNA电泳、流式细胞仪、RT-PCR等方法，观察眼镜蛇毒组分C对HL60等9株白血病细胞系的毒性作用、量效关系及白血病细胞经过眼镜蛇毒组分C处理后的生物化学、Bcl-2/Bax表达水平变化。结果：眼镜蛇毒组分对9株人白血病细胞系均有明显的抑制作用，IC50为0.0046～4.40μg/ml，且呈较好的量效关系(r为0.66～0.99)。眼镜蛇毒组分C能诱导HL60细胞发生凋亡生物化学变化；流式细胞仪分析发现眼镜蛇毒组分C能使一定比例的J6-1、562、HL60细胞发生凋亡，而且凋亡率随蛇毒浓度的增高而增加；RT-PCR方法检测发现眼镜蛇毒组分C能使HL60细胞Bcl-2基因的表达下调，而Bax变化不明显。结论：眼镜蛇毒组分C对多种白血病细胞株均具有较强的抑制作用；此种抑制作用与剂量呈正相关。眼镜蛇毒组分C能诱导白血病细胞发生凋亡，此作用与Bcl-2基因的表达下调有关。
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中图分类号 R733.7 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)01-0001-06
A Laboratory Study on the Anti-leukemia Effect of
Fraction C from Naja Naja Actra Venom
Tan Huo,Ying Hongguang,Hao Yushu,et al
(Department of Internal Medicine The Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510260)
Objective:To investigate the direct effect of fraction C from Naja Naja Actra Venom (FCNNAV) on leukemia cells and its mechanisms. Methods:MTT,DNA electrophoresis,flow cytometry and RT-PCR assay were used to detect the effect of FCNNAV on the growth of nine human l Leukemia eukemia cell lines,the biochemical changes and the expression level of Bcl-2/Bax of the cells after being exposed to FCNNAV were also observed. Results:FCNNAV showed toxic to all the cell lines,with IC50 of 0.0046～4.40μg/ml,and there were obvious dose-effect correlations (r=0.66～0.99). FCNNAV also induced typical biochemical changes of apoptosis in HL60 cells,data from analysis with flow cytometry showed that FCNNAV increased the rates of apoptotic cells in J6-1,K562 and HL60 cells in a dose-dependent manner;RT-PCR detection demonstrated that the expression level of Bcl-2 gene in HL60 cells was down-regulated by FCNNAV,while that of Bax gene was unaffected. Conclusion:FCNNAV is very potent in inhibiting the growth of various human leukemia cell lines,with close dose- effect correlation;FCNNAV could induce apoptosis in the cell lines and this effect seems to be related to the down-regulated expression level of Bcl-2 gene.
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Key words Naja Naja Actra Venom;Leukemia;Cell line;Cytotoxicity;Apoptosis;Bcl-2/Bax gene
眼镜蛇毒组分C(Fraction C from Naja Naja Actra Venom,FCNNAV)是中华眼镜蛇粗毒(产于广东省阳春市嘉华养殖场)经DEAE Sephadex A-50、CM Sephadex C-25离子交换柱、Sephadex G-75分子筛柱层析分离、纯化而来，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一区带，电位滴定法不能检出磷脂酶A2活性；其主要成份为膜毒素，LD50为2.88±0.41mg/kg(粗毒的LD50为0.69±0.12mg/kg)。实验研究证明FCNNAV有明显的抗癌活性[1]，为了进一步探讨其对白血病细胞的作用，我们对FCNNAV能否直接抑制白血病细胞生长及其机制进行了研究，现将结果报告如下。1 材料和方法
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1.1 材料
1.1.1 细胞系 人粒细胞白血病细胞系(HL60)、人单核细胞白血病细胞系(U937)、人T淋巴细胞白血病细胞系(HPB)、人B淋巴细胞白血病细胞系(Nalm-6)、人早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)、人巨核细胞白血病细胞系(Mo7e)、人粒单细胞白血病细胞系(J6-1)、人红白血病细胞系敏感株(K562/S)、人红白血病细胞系耐药株(K562/AO2)等9株细胞系均为中国医学科学院血液学研究所提供。
1.1.2 主要试剂 噻唑蓝(MTT)：Sigma产品；二甲基亚砜(DMSO)：北京亚太精细化工公司产品(分析纯)；RPMI1640：美国(GibcoBRT公司产品；谷氨酰胺：政翔化学试剂研究所产品。
1.1.3 RT-PCR引物 由上海生工公司合成。引物序列：
β-Adin正义链：5′-GGGGCGCCCCAGGCAC-3′；反义链：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；预期扩增产物长度为548bp。
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Bcl-2正义链：5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3′；反义链：5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3′；预期扩增产物长度为318bp。
Bax正义链：5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′；反义链5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′；预期扩增产物长度为257bp。
1.1.4 中华眼镜蛇毒组分C 为广州蛇毒研究所提供。
1.1.5 主要仪器 CO2培养箱(Forma Scientific,美国)；SPECTRAⅠ型酶标仪(Austria Medical and Hospital Engineering Co.Ltd)；流式细胞仪(EPICS-CS，美国Cotlter公司)。
1.2 方法
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1.2.1 细胞毒试验 采用MTT法[2]：取对数生长期细胞，接种于灭菌的96孔微培养板中，每孔160μl RPMI 1640培养液，含15%新生牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml、谷氨酸30μg/ml，细胞数为2×104，在37℃、5%CO2、全湿条件下孵箱培养12h后分组加药40μl，对照组加等体积的生理盐水(NS)，每孔总体积为200μl。每种药物浓度均设3个平行孔。68h后，各孔加MTT20μl(5mg/ml)，继续在前述条件下培养4h后，2000rpm离心10min，弃上清。加入DMSO150μl，振荡至MTT沉淀完全溶解，用酶标仪检测546nm波长条件下各孔的A值(光密度)，取3孔平均数，按下式计算细胞抑制率：
100%
1.2.2 流式细胞仪分析
1.2.2.1 细胞培养 HL60、K562、J6-1细胞：用RPMI1640培养液培养，15%新生牛血清，青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml，谷氨酰胺30μg/ml及NS(对照组)或FCNNAV稀释液(实验组)混合后总体积为10ml，内含细胞数为1×106，在37℃、5%CO2、全湿条件下孵箱中培养1～5h。
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1.2.2.2 流式细胞仪标本制备[3] 收集孵育后细胞，PBS洗涤2次，弃上清，将浓集细胞悬液逐滴加入4℃预冷的70%酒精中，并不断摇晃，使其充分分散，制备成单细胞悬液，4℃冰箱保存，1周内测试。
1.2.2.3 碘化丙啶(PI)染色[4] 采用一步法染色，106细胞，PI(Sigma)终浓度为5μg/ml 4℃染色30min。亚二倍体(0.2C～1.6C)计为凋亡细胞，FLSX90LS设立电子门，以除去细胞碎片。
1.2.2.4 Annexin V染色[5] 106细胞经PBS洗涤后，加入结合缓冲液，并加入Annexin V-FITC(绿色荧光)，PI(红色荧光)避光染色10～20min，PBS洗涤后流式细胞仪检测。由于凋亡细胞，尤其是早期的凋亡细胞仅表现为膜生化基团的改变，而无膜通透性的增加，故呈绿+，红-；凋亡又继发坏死的细胞既有膜生化基团的改变，又有膜通透性的增加，呈绿+，红+；坏死细胞呈绿-，红+；正常细胞呈绿-，红-。
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1.2.3 DNA电泳
1.2.3.1 DNA的提取 采用酚氯仿提取法[6]：取对数生长期的HL60细胞，接种于灭菌的培养瓶中，每瓶内含细胞数5×106，与15%新生牛血清、RPMI1640培养液、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml、谷氨酸30μg/ml及NS(对照组)或FCNNAV稀释液(实验组)混合后总体积为10ml，在37℃、5%CO2、全湿条件下孵箱孵育6h，细胞收集后用NS洗涤2次，离心弃上清，加入裂解液和蛋白酶K(终浓度100μg/ml)，37℃过夜，酚/氯仿提取，再经氯仿/异戊醇、冷异丙醇、3M NaAc沉淀，冷70%乙醇洗涤，空气干燥后溶于适量TE。
1.2.3.2 DNA电泳 1.5%琼脂糖凝胶，电压80V，电泳4h，0.5μg/ml溴乙锭(EB)染色30min，245nm紫外光下观察DNA条带，并摄影。
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1.2.4 Bcl-2/Bax检测
1.2.4.1 RNA的提取[7] 一步法提取：配制溶液D(4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠pH7、0.1MB巯基乙醇及0.5% Sarcosyl)并高压灭菌后室温避光保存；取对数生长期的HL60细胞，接种于灭菌的培养瓶中，每瓶内含细胞数5×106，与15%新生牛血清、RPMI1640培养液、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、谷氨酸30μg/ml及NS(对照组)或FCNNAV稀释液(实验组)混合后总体积为10ml，在37℃、5%CO2、全湿条件下孵箱孵育6h，收集细胞>1×106个，用NS洗涤2次，离心弃上清；依次加入溶液D100μl、2M NaAc(pH 4) 10μl、酚100μl、氯仿/异戊醇(49∶1)20μl，每加入一种试剂后均颠倒混匀，最后剧烈震荡10s，冰浴15min，4℃离心(10000rpm,20min)。转移上清液至另一2ml EP离心管中，加适量异丙醇，-20℃放置至少1h，4℃离心(同上)。沉淀重悬浮于适量溶液D，并加等体积异丙醇，-20℃放置1h，4℃离心(同上)，沉淀用75%乙醇洗涤1次，离心沉淀，真空干燥，溶于适量的DEPC-ddH2O中。
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1.2.4.2 RT-RCR
cDNA合成：取5μlRNA作模板，加5×逆转录缓冲液4μl，10mmol/L dNTP2μl,Rnasin 40U,MMLV逆转录酶200U，反义链引物50pmol，补无菌去离子水至20μl，42℃反应60min，95℃5min，冰浴速冷后保存于4℃或直接用于PCR。
PCR：应用PE2400-PCR仪(PE公司，美国)。50μl总反应体系中含cDNA模板10μl，10×PCR缓冲液5μl，正义链及反义链引物各50pmol，10mmol/L dNTP2cμl,Taq酶2U。
bcl-2和β-Actin的热循环条件：94℃预变形7min，然后94℃变性1min，72℃退火及延伸各30s，30个循环后，72℃再延伸7min。Bax循环条件改退火条件为60℃45s，延伸72℃45s，循环数为35个，余同bcl-2。
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琼脂糖凝胶电泳：取10μlPCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，90伏，60min。EB染色于紫外透射仪下观察并照相。
1.2.5 统计学方法 t检验法；IC50(细胞存活率减少50%时的药物剂量)根据线性回归方程计算。
2 结果
2.1 眼镜蛇毒对白血病细胞株的抑制作用
FCNNAV对K562、J6-1、Mo7e、HPB、U937、Nalm-6、HL60、NB4等8种白血病细胞株均有明显的直接抑制作用，且有良好的量效关系，相关系数依次为0.77、0.71、0.66、0.87、0.83、0.99、0.94、0.82；经线性回归处理求得各种白血病细胞的IC50分别为0.0046、0.21、0.35、1.68、3.06、3.23、4.00、4.40μg/ml，说明上述白血病细胞株对眼镜蛇毒组分C均较敏感。
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表1 不同浓度FCN NAV对各种 白血病细胞株的抑制作用(抑制率%) 细胞系
125μg/ml
250μg/ml
5μg/ml
10μg/ml
20μg/ml
40μg/ml
K562
725±0.92
91.8±2.14
94.9±0.83
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965±0.76
96.0±1.24
97.0±1.02
J6-1
48.1±27.44
93.7±3.14
98.9±1.47
99.1±1.21
98.4±1.64
98.8±1.54
Mo7e
35.0±16.26
, 百拇医药
99.6±0.06
99.6±0.06
99.6±0.06
98.9±1.32
97.1±3.21
HPB
54.3±9.44
41.4±22.17
61.5±17.53
85.1±22.65
87.4±10.32
95.5±5.17
, 百拇医药
U937
14.3±2.36
22.4±5.27
80.1±4.44
97.7±0.52
99.9±0.01
99.9±0.01
Nalm-6
1.0±0.23
21.0±3.22
41.6±2.33
61.0±4.56
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75.2±2.98
97.3±4.11
Hl60
10.0±7.42
28.3±5.32
66.6±3.89
94.9±0.92
97.1±0.88
97.1±0.31
NB4
11.9±4.08
17.3±5.58
, 百拇医药
69.7±11.82
91.6±0.75
92.5±1.44
96.0±0.36
2.2 流式细胞仪分析
2.2.1 用眼镜蛇毒(10μg/ml)处理3h后，能诱导白血病细胞株发生凋亡，与对照组比较，各实验组的凋亡细胞百分率明显增多(P值均<0.01)
表2 FCNNAV对不同白血病细胞系凋亡的影响 组别
对照组
蛇毒组
J6-1
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7.94%
28.09%
K562
2.20%
40.52%
HL60
8.00%
22.77%
2.2.2 固定作用时间为3h，眼镜蛇毒诱导HL60细胞凋亡随蛇毒浓度的增加而增加，呈现出良好的量效关系(r=0.99,P<0.05)。
表3 不同浓度FCNNAV诱导HL60细胞的凋亡 组别
凋亡细胞(%)
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对照组
7.94±0.578
510μg/ml蛇毒
11.56±0.784
10μg/ml蛇毒
17.80±0.644
20μg/ml蛇毒
34.07±19.219
2.2.3 固定作用终浓度为10μg/ml，眼镜蛇毒诱导白血病细胞凋亡的高峰时间为作用后5h，其后继发坏死的细胞增多。
表4 FCNNAV处理不同时间对HL60细胞凋亡的影响 蛇毒处理
, 百拇医药
min
凋亡细胞
比例(%)
凋亡继发坏死
细胞比例(%)
坏死细胞
比例(%)
对照组
4
0
1
1h
14
, 百拇医药
1
1
3h
33
16
0
5h
5
45
10
2.3 DNA电泳分析
琼脂糖电泳显示，FCNNAV诱导HL60细胞凋亡形成典型的“梯状”(DNA Ladder)DNA条带。
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2.4 Bcl-2/Bax:
与对照组比较，FCNNAV能诱导HL60细胞的Bcl-2基因的表达下调；而Bax变化不明显。
图1
1.Maker:Xφ174DNA/Hae;
2.FCNNAV20μg/ml;
3.FCNNAV35μg/ml;
4.FCNNAV0.5μg/ml
图2 RT-PCR结果
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1.Maker:PGEM-3Zf(+)HaeⅢ；
2.HL-60细胞对照组(bcl-2);
3.10μg/ml FCNNAV处理组(bcl-2);
4.20μg/mlFCNNAV处理组(bcl-2);
5.HL-60对照组(bax);
6.10μg/mlFCNNAV处理组(bax)；
7.20μg/mlFCNNAV处理组(bax)
3 讨论
近年来，国内外对蛇毒抗肿瘤作用的研究日趋重视。各类蛇毒中，眼镜蛇蛇毒的直接杀癌效应最强[8]。研究表明，膜毒素是其抗肿瘤作用的主要有效成份[9]。眼镜蛇蛇毒具有较广的抗瘤谱，其中对白血病细胞的杀伤最为明显[10]。
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本研究发现FCNNAV对多种白血病细胞株均有明显的抑制作用，其中敏感性最高的是K562、J6-1、Mo7e,以下依次为HPB、937、Nalm-6、HL60和NB4。FCNNAV对白血病细胞株的直接抑制作用与浓度呈正相关，其中Nalm-6、HL60、NB4的最效关系最明显，以下依次HPB、U937、K562、J6-1、Mo7e。结果提示FCNNAV具有广谱的抗不同类型的白血病细胞株的作用。
近十年来发现许多抗肿瘤药物是通过诱导细胞凋亡而发挥作用的[10]。为进一步阐明FCNNAV抗癌的作用机制，我们应用生物化学和分子生物学等手段对眼镜蛇毒是否能诱导白血病细胞凋亡进行了研究，结果发现白血病细胞与FCNNAV共同孵育后，DNA电泳可见明显的“梯状”条带[11]；流式细胞仪检测显示，经眼镜蛇毒处理后的白血病细胞发生了DNA含量及磷脂酰丝氨酸(PS)外翻(extemalization of phosphatidylserine)两方面的变化：由于眼镜蛇毒可使白血病细胞的基因组DNA断裂，并从细胞浆漏出，致使凋亡细胞余下的DNA少于G1期细胞的含量，表现为亚二倍体(0.2C～1.6C)明显增多[12]；许多类型的细胞在发生凋亡的早期，原位于细胞膜内表面的PS会转位到细胞膜的外表面[13]，PS发生外翻后便易于与Annexin V结合而被标记，利用这种技术能检测到早期的凋亡细胞[14]。我们的实验显示，眼镜蛇毒与HL60细胞作用1h后即可见早期凋亡的细胞增多；3h后早期凋亡的细胞达高峰；5h后晚期凋亡的细胞明显增多，并出现坏死细胞。说明眼镜蛇毒对HL60细胞诱导凋亡的作用发生迅速，长时间作用后亦可引起细胞坏死。
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许多基因均参与了凋亡的调控，其中Bcl-2/Bax是一对重要的凋亡调节基因[15]。当细胞内Bcl-2过量表达时，形成的异源二聚体Bcl-2/Bax多于Bax/Bax同源二聚体，凋亡被抑制；反之，凋亡被促进[16]。我们的实验表明，FCNNAV能使HL60细胞的Bcl-2表达下调，表现为RT-PCR，所得DNA电泳条带明显弱于对照组；而对Bax的表达影响不大。使得细胞内Bcl-2/Bax与Bax/Bax的数量比例降低，结果引起细胞凋亡。
基金项目：广东省自然科学基金(930190)。
作者简介：谭获(1961-)，男，博士，副教授。研究方向：白血病；出凝血疾病。
参考文献
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(收稿：1999-11-23), http://www.100md.com
单位：谭获 冯莹 叶絮 庞缨 赖毅妍(广州医学院第二附属医院内科，广州 510260)；余清声 管锦霞 林振桃(广州医学院蛇毒研究所)；应红光 郝玉书(中国医学科学院血液学研究所)；张广森(湖南医科大学第二附属医院)
关键词：眼镜蛇毒；白血病；细胞株；细胞毒；凋亡Bcl-2/Bax基因
广州医学院学报000101提要 目的：研究眼镜蛇毒组分C对白血病细胞的直接作用及机制。方法：应用MTT、DNA电泳、流式细胞仪、RT-PCR等方法，观察眼镜蛇毒组分C对HL60等9株白血病细胞系的毒性作用、量效关系及白血病细胞经过眼镜蛇毒组分C处理后的生物化学、Bcl-2/Bax表达水平变化。结果：眼镜蛇毒组分对9株人白血病细胞系均有明显的抑制作用，IC50为0.0046～4.40μg/ml，且呈较好的量效关系(r为0.66～0.99)。眼镜蛇毒组分C能诱导HL60细胞发生凋亡生物化学变化；流式细胞仪分析发现眼镜蛇毒组分C能使一定比例的J6-1、562、HL60细胞发生凋亡，而且凋亡率随蛇毒浓度的增高而增加；RT-PCR方法检测发现眼镜蛇毒组分C能使HL60细胞Bcl-2基因的表达下调，而Bax变化不明显。结论：眼镜蛇毒组分C对多种白血病细胞株均具有较强的抑制作用；此种抑制作用与剂量呈正相关。眼镜蛇毒组分C能诱导白血病细胞发生凋亡，此作用与Bcl-2基因的表达下调有关。
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中图分类号 R733.7 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)01-0001-06
A Laboratory Study on the Anti-leukemia Effect of
Fraction C from Naja Naja Actra Venom
Tan Huo,Ying Hongguang,Hao Yushu,et al
(Department of Internal Medicine The Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510260)
Objective:To investigate the direct effect of fraction C from Naja Naja Actra Venom (FCNNAV) on leukemia cells and its mechanisms. Methods:MTT,DNA electrophoresis,flow cytometry and RT-PCR assay were used to detect the effect of FCNNAV on the growth of nine human l Leukemia eukemia cell lines,the biochemical changes and the expression level of Bcl-2/Bax of the cells after being exposed to FCNNAV were also observed. Results:FCNNAV showed toxic to all the cell lines,with IC50 of 0.0046～4.40μg/ml,and there were obvious dose-effect correlations (r=0.66～0.99). FCNNAV also induced typical biochemical changes of apoptosis in HL60 cells,data from analysis with flow cytometry showed that FCNNAV increased the rates of apoptotic cells in J6-1,K562 and HL60 cells in a dose-dependent manner;RT-PCR detection demonstrated that the expression level of Bcl-2 gene in HL60 cells was down-regulated by FCNNAV,while that of Bax gene was unaffected. Conclusion:FCNNAV is very potent in inhibiting the growth of various human leukemia cell lines,with close dose- effect correlation;FCNNAV could induce apoptosis in the cell lines and this effect seems to be related to the down-regulated expression level of Bcl-2 gene.
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Key words Naja Naja Actra Venom;Leukemia;Cell line;Cytotoxicity;Apoptosis;Bcl-2/Bax gene
眼镜蛇毒组分C(Fraction C from Naja Naja Actra Venom,FCNNAV)是中华眼镜蛇粗毒(产于广东省阳春市嘉华养殖场)经DEAE Sephadex A-50、CM Sephadex C-25离子交换柱、Sephadex G-75分子筛柱层析分离、纯化而来，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一区带，电位滴定法不能检出磷脂酶A2活性；其主要成份为膜毒素，LD50为2.88±0.41mg/kg(粗毒的LD50为0.69±0.12mg/kg)。实验研究证明FCNNAV有明显的抗癌活性[1]，为了进一步探讨其对白血病细胞的作用，我们对FCNNAV能否直接抑制白血病细胞生长及其机制进行了研究，现将结果报告如下。1 材料和方法
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1.1 材料
1.1.1 细胞系 人粒细胞白血病细胞系(HL60)、人单核细胞白血病细胞系(U937)、人T淋巴细胞白血病细胞系(HPB)、人B淋巴细胞白血病细胞系(Nalm-6)、人早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)、人巨核细胞白血病细胞系(Mo7e)、人粒单细胞白血病细胞系(J6-1)、人红白血病细胞系敏感株(K562/S)、人红白血病细胞系耐药株(K562/AO2)等9株细胞系均为中国医学科学院血液学研究所提供。
1.1.2 主要试剂 噻唑蓝(MTT)：Sigma产品；二甲基亚砜(DMSO)：北京亚太精细化工公司产品(分析纯)；RPMI1640：美国(GibcoBRT公司产品；谷氨酰胺：政翔化学试剂研究所产品。
1.1.3 RT-PCR引物 由上海生工公司合成。引物序列：
β-Adin正义链：5′-GGGGCGCCCCAGGCAC-3′；反义链：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；预期扩增产物长度为548bp。
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Bcl-2正义链：5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3′；反义链：5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3′；预期扩增产物长度为318bp。
Bax正义链：5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′；反义链5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′；预期扩增产物长度为257bp。
1.1.4 中华眼镜蛇毒组分C 为广州蛇毒研究所提供。
1.1.5 主要仪器 CO2培养箱(Forma Scientific,美国)；SPECTRAⅠ型酶标仪(Austria Medical and Hospital Engineering Co.Ltd)；流式细胞仪(EPICS-CS，美国Cotlter公司)。
1.2 方法
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1.2.1 细胞毒试验 采用MTT法[2]：取对数生长期细胞，接种于灭菌的96孔微培养板中，每孔160μl RPMI 1640培养液，含15%新生牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml、谷氨酸30μg/ml，细胞数为2×104，在37℃、5%CO2、全湿条件下孵箱培养12h后分组加药40μl，对照组加等体积的生理盐水(NS)，每孔总体积为200μl。每种药物浓度均设3个平行孔。68h后，各孔加MTT20μl(5mg/ml)，继续在前述条件下培养4h后，2000rpm离心10min，弃上清。加入DMSO150μl，振荡至MTT沉淀完全溶解，用酶标仪检测546nm波长条件下各孔的A值(光密度)，取3孔平均数，按下式计算细胞抑制率：
100%1.2.2 流式细胞仪分析
1.2.2.1 细胞培养 HL60、K562、J6-1细胞：用RPMI1640培养液培养，15%新生牛血清，青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml，谷氨酰胺30μg/ml及NS(对照组)或FCNNAV稀释液(实验组)混合后总体积为10ml，内含细胞数为1×106，在37℃、5%CO2、全湿条件下孵箱中培养1～5h。
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1.2.2.2 流式细胞仪标本制备[3] 收集孵育后细胞，PBS洗涤2次，弃上清，将浓集细胞悬液逐滴加入4℃预冷的70%酒精中，并不断摇晃，使其充分分散，制备成单细胞悬液，4℃冰箱保存，1周内测试。
1.2.2.3 碘化丙啶(PI)染色[4] 采用一步法染色，106细胞，PI(Sigma)终浓度为5μg/ml 4℃染色30min。亚二倍体(0.2C～1.6C)计为凋亡细胞，FLSX90LS设立电子门，以除去细胞碎片。
1.2.2.4 Annexin V染色[5] 106细胞经PBS洗涤后，加入结合缓冲液，并加入Annexin V-FITC(绿色荧光)，PI(红色荧光)避光染色10～20min，PBS洗涤后流式细胞仪检测。由于凋亡细胞，尤其是早期的凋亡细胞仅表现为膜生化基团的改变，而无膜通透性的增加，故呈绿+，红-；凋亡又继发坏死的细胞既有膜生化基团的改变，又有膜通透性的增加，呈绿+，红+；坏死细胞呈绿-，红+；正常细胞呈绿-，红-。
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1.2.3 DNA电泳
1.2.3.1 DNA的提取 采用酚氯仿提取法[6]：取对数生长期的HL60细胞，接种于灭菌的培养瓶中，每瓶内含细胞数5×106，与15%新生牛血清、RPMI1640培养液、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml、谷氨酸30μg/ml及NS(对照组)或FCNNAV稀释液(实验组)混合后总体积为10ml，在37℃、5%CO2、全湿条件下孵箱孵育6h，细胞收集后用NS洗涤2次，离心弃上清，加入裂解液和蛋白酶K(终浓度100μg/ml)，37℃过夜，酚/氯仿提取，再经氯仿/异戊醇、冷异丙醇、3M NaAc沉淀，冷70%乙醇洗涤，空气干燥后溶于适量TE。
1.2.3.2 DNA电泳 1.5%琼脂糖凝胶，电压80V，电泳4h，0.5μg/ml溴乙锭(EB)染色30min，245nm紫外光下观察DNA条带，并摄影。
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1.2.4 Bcl-2/Bax检测
1.2.4.1 RNA的提取[7] 一步法提取：配制溶液D(4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠pH7、0.1MB巯基乙醇及0.5% Sarcosyl)并高压灭菌后室温避光保存；取对数生长期的HL60细胞，接种于灭菌的培养瓶中，每瓶内含细胞数5×106，与15%新生牛血清、RPMI1640培养液、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、谷氨酸30μg/ml及NS(对照组)或FCNNAV稀释液(实验组)混合后总体积为10ml，在37℃、5%CO2、全湿条件下孵箱孵育6h，收集细胞>1×106个，用NS洗涤2次，离心弃上清；依次加入溶液D100μl、2M NaAc(pH 4) 10μl、酚100μl、氯仿/异戊醇(49∶1)20μl，每加入一种试剂后均颠倒混匀，最后剧烈震荡10s，冰浴15min，4℃离心(10000rpm,20min)。转移上清液至另一2ml EP离心管中，加适量异丙醇，-20℃放置至少1h，4℃离心(同上)。沉淀重悬浮于适量溶液D，并加等体积异丙醇，-20℃放置1h，4℃离心(同上)，沉淀用75%乙醇洗涤1次，离心沉淀，真空干燥，溶于适量的DEPC-ddH2O中。
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1.2.4.2 RT-RCR
cDNA合成：取5μlRNA作模板，加5×逆转录缓冲液4μl，10mmol/L dNTP2μl,Rnasin 40U,MMLV逆转录酶200U，反义链引物50pmol，补无菌去离子水至20μl，42℃反应60min，95℃5min，冰浴速冷后保存于4℃或直接用于PCR。
PCR：应用PE2400-PCR仪(PE公司，美国)。50μl总反应体系中含cDNA模板10μl，10×PCR缓冲液5μl，正义链及反义链引物各50pmol，10mmol/L dNTP2cμl,Taq酶2U。
bcl-2和β-Actin的热循环条件：94℃预变形7min，然后94℃变性1min，72℃退火及延伸各30s，30个循环后，72℃再延伸7min。Bax循环条件改退火条件为60℃45s，延伸72℃45s，循环数为35个，余同bcl-2。
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琼脂糖凝胶电泳：取10μlPCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，90伏，60min。EB染色于紫外透射仪下观察并照相。
1.2.5 统计学方法 t检验法；IC50(细胞存活率减少50%时的药物剂量)根据线性回归方程计算。
2 结果
2.1 眼镜蛇毒对白血病细胞株的抑制作用
FCNNAV对K562、J6-1、Mo7e、HPB、U937、Nalm-6、HL60、NB4等8种白血病细胞株均有明显的直接抑制作用，且有良好的量效关系，相关系数依次为0.77、0.71、0.66、0.87、0.83、0.99、0.94、0.82；经线性回归处理求得各种白血病细胞的IC50分别为0.0046、0.21、0.35、1.68、3.06、3.23、4.00、4.40μg/ml，说明上述白血病细胞株对眼镜蛇毒组分C均较敏感。
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表1 不同浓度FCN NAV对各种 白血病细胞株的抑制作用(抑制率%) 细胞系
125μg/ml
250μg/ml
5μg/ml
10μg/ml
20μg/ml
40μg/ml
K562
725±0.92
91.8±2.14
94.9±0.83
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965±0.76
96.0±1.24
97.0±1.02
J6-1
48.1±27.44
93.7±3.14
98.9±1.47
99.1±1.21
98.4±1.64
98.8±1.54
Mo7e
35.0±16.26
, 百拇医药
99.6±0.06
99.6±0.06
99.6±0.06
98.9±1.32
97.1±3.21
HPB
54.3±9.44
41.4±22.17
61.5±17.53
85.1±22.65
87.4±10.32
95.5±5.17
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U937
14.3±2.36
22.4±5.27
80.1±4.44
97.7±0.52
99.9±0.01
99.9±0.01
Nalm-6
1.0±0.23
21.0±3.22
41.6±2.33
61.0±4.56
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75.2±2.98
97.3±4.11
Hl60
10.0±7.42
28.3±5.32
66.6±3.89
94.9±0.92
97.1±0.88
97.1±0.31
NB4
11.9±4.08
17.3±5.58
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69.7±11.82
91.6±0.75
92.5±1.44
96.0±0.36
2.2 流式细胞仪分析
2.2.1 用眼镜蛇毒(10μg/ml)处理3h后，能诱导白血病细胞株发生凋亡，与对照组比较，各实验组的凋亡细胞百分率明显增多(P值均<0.01)
表2 FCNNAV对不同白血病细胞系凋亡的影响 组别
对照组
蛇毒组
J6-1
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7.94%
28.09%
K562
2.20%
40.52%
HL60
8.00%
22.77%
2.2.2 固定作用时间为3h，眼镜蛇毒诱导HL60细胞凋亡随蛇毒浓度的增加而增加，呈现出良好的量效关系(r=0.99,P<0.05)。
表3 不同浓度FCNNAV诱导HL60细胞的凋亡 组别
凋亡细胞(%)
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对照组
7.94±0.578
510μg/ml蛇毒
11.56±0.784
10μg/ml蛇毒
17.80±0.644
20μg/ml蛇毒
34.07±19.219
2.2.3 固定作用终浓度为10μg/ml，眼镜蛇毒诱导白血病细胞凋亡的高峰时间为作用后5h，其后继发坏死的细胞增多。
表4 FCNNAV处理不同时间对HL60细胞凋亡的影响 蛇毒处理
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min
凋亡细胞
比例(%)
凋亡继发坏死
细胞比例(%)
坏死细胞
比例(%)
对照组
4
0
1
1h
14
, 百拇医药
1
1
3h
33
16
0
5h
5
45
10
2.3 DNA电泳分析
琼脂糖电泳显示，FCNNAV诱导HL60细胞凋亡形成典型的“梯状”(DNA Ladder)DNA条带。
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2.4 Bcl-2/Bax:
与对照组比较，FCNNAV能诱导HL60细胞的Bcl-2基因的表达下调；而Bax变化不明显。
图1
1.Maker:Xφ174DNA/Hae;
2.FCNNAV20μg/ml;
3.FCNNAV35μg/ml;
4.FCNNAV0.5μg/ml
图2 RT-PCR结果
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1.Maker:PGEM-3Zf(+)HaeⅢ；
2.HL-60细胞对照组(bcl-2);
3.10μg/ml FCNNAV处理组(bcl-2);
4.20μg/mlFCNNAV处理组(bcl-2);
5.HL-60对照组(bax);
6.10μg/mlFCNNAV处理组(bax)；
7.20μg/mlFCNNAV处理组(bax)
3 讨论
近年来，国内外对蛇毒抗肿瘤作用的研究日趋重视。各类蛇毒中，眼镜蛇蛇毒的直接杀癌效应最强[8]。研究表明，膜毒素是其抗肿瘤作用的主要有效成份[9]。眼镜蛇蛇毒具有较广的抗瘤谱，其中对白血病细胞的杀伤最为明显[10]。
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本研究发现FCNNAV对多种白血病细胞株均有明显的抑制作用，其中敏感性最高的是K562、J6-1、Mo7e,以下依次为HPB、937、Nalm-6、HL60和NB4。FCNNAV对白血病细胞株的直接抑制作用与浓度呈正相关，其中Nalm-6、HL60、NB4的最效关系最明显，以下依次HPB、U937、K562、J6-1、Mo7e。结果提示FCNNAV具有广谱的抗不同类型的白血病细胞株的作用。
近十年来发现许多抗肿瘤药物是通过诱导细胞凋亡而发挥作用的[10]。为进一步阐明FCNNAV抗癌的作用机制，我们应用生物化学和分子生物学等手段对眼镜蛇毒是否能诱导白血病细胞凋亡进行了研究，结果发现白血病细胞与FCNNAV共同孵育后，DNA电泳可见明显的“梯状”条带[11]；流式细胞仪检测显示，经眼镜蛇毒处理后的白血病细胞发生了DNA含量及磷脂酰丝氨酸(PS)外翻(extemalization of phosphatidylserine)两方面的变化：由于眼镜蛇毒可使白血病细胞的基因组DNA断裂，并从细胞浆漏出，致使凋亡细胞余下的DNA少于G1期细胞的含量，表现为亚二倍体(0.2C～1.6C)明显增多[12]；许多类型的细胞在发生凋亡的早期，原位于细胞膜内表面的PS会转位到细胞膜的外表面[13]，PS发生外翻后便易于与Annexin V结合而被标记，利用这种技术能检测到早期的凋亡细胞[14]。我们的实验显示，眼镜蛇毒与HL60细胞作用1h后即可见早期凋亡的细胞增多；3h后早期凋亡的细胞达高峰；5h后晚期凋亡的细胞明显增多，并出现坏死细胞。说明眼镜蛇毒对HL60细胞诱导凋亡的作用发生迅速，长时间作用后亦可引起细胞坏死。
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许多基因均参与了凋亡的调控，其中Bcl-2/Bax是一对重要的凋亡调节基因[15]。当细胞内Bcl-2过量表达时，形成的异源二聚体Bcl-2/Bax多于Bax/Bax同源二聚体，凋亡被抑制；反之，凋亡被促进[16]。我们的实验表明，FCNNAV能使HL60细胞的Bcl-2表达下调，表现为RT-PCR，所得DNA电泳条带明显弱于对照组；而对Bax的表达影响不大。使得细胞内Bcl-2/Bax与Bax/Bax的数量比例降低，结果引起细胞凋亡。
基金项目：广东省自然科学基金(930190)。
作者简介：谭获(1961-)，男，博士，副教授。研究方向：白血病；出凝血疾病。
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(收稿：1999-11-23), http://www.100md.com