不同胃液胃蛋白酶含量及活性的测定
作者：周素芳 邓勇 周德义 吴耀生 凌江红
单位：周素芳 邓勇 周德义 吴耀生(广西医科大学生化教研室 南宁 530021)；凌江红(广西医科大学第一附属医院消化内科)
关键词：红桂木凝集素；胃蛋白酶；含量；活性
广西医科大学学报000127
摘要 目的：探讨红桂木凝集素用于胃液胃蛋白酶定量的可行性； 证实胃蛋白酶在胃部疾病中的作用。方法：将红桂木凝集素(ALL)标记上辣根过氧化物酶(HRP)，用夹心 酶联法测定不同胃病患者胃液中胃蛋白酶的含量，并用改良安宋氏法测定其相应的酶活性。结果：正常组(16例)、胃炎组(32例)、十二指肠溃疡组(32例)、胃 溃疡组(21例)及胃癌组(5例)中胃蛋白酶的含量及其活性均无显著性差异，但胃液pH值<3的 酶 含量要高于pH值>4的酶含量，而酶活性无明显差异。表明在胃酸增加时，胃蛋白酶的分泌亦 增加，但酶含量并不与酶活性成正相关，提示胃蛋白酶与胃部疾病的发生关系不密切，可能 不是胃部疾病发生的主要原因。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R446.61
ASSAY OF PEPSIN CONTENT AND ACTIVITY IN VARIOUS GASTRIC JUICE
Zhou Sufang，Deng Yong
(Department of Biochemistry,Guangxi Medical Unive rsity,Nanning，530021 China)
Ling Jianghong
(First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Nanning 5300 21 China)
Abstract Objective:To prove the possibility of quantitating g astric juice pepsin by ALL,and to prove pepsin effects on stomach diseases.Methods:The gastric juice pepsin contents and its activity wer e determined by ALL-HRP sandwich assay and modification Anon's method respectiv ely.Result:There were no significant differences in both pepsin co ntents and its activity among the normal controls and patients with various gast ric diseases including gastritis,duodenal ulcer,gastric ulcer and carcinoma of s tomach.But the pepsin contents of the gastric secretions with pH<3 were signifi cantly higher than those with pH>4,the pepsin activities had no significant dif ferences in the change of pH.Conclusion:There is no closely relation between pepsin and st omach diseases.Pepsin is no primary cause in producting stomach diseases.
, 百拇医药
Key words artocarpus lingnanesis lectin;pepsin;content;activi ty
凝集素具有与糖蛋白特异结合的性质，笔者在研究红桂木凝集素(Artocarpus lingnane sis lectin,ALL)对各种糖蛋白的结合特性中发现ALL与胃蛋白酶特异结合，且亲和力很强 [1]。由此采用辣根过氧化物酶(HRP)标记ALL,用ELISA法检测不同胃病患者胃液中胃 蛋白酶含量，同时用改良安宋氏法测定胃蛋白酶活性，拟观察该酶的含量与活性之间的关系 及其对不同胃部疾病的影响。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 ALL：红桂木种子由广西亚热带作物研究所提供，本室自备达电泳纯。
, 百拇医药 1.1.2 胃液：收集胃镜确诊患者的空腹胃液，-20℃保存。广西医科大 学第一附属医院胃镜室提供。
1.1.3 试剂和仪器：HRP为上海丽珠东风生物技术有限公司产品；底物TMB，A、B液，终 止液为华美公司产品；电泳纯胃蛋白酶为Sigma产品；牛血红蛋白为中科院生化研究所产品 ；Σ960酶标仪为台湾产品。
1.2 方 法
1.2.1 ALL-HRP的制备：按郭春祥的HRP标记抗体的过碘酸钠法[2]稍加改进， 标记物过Sephardex G200柱，收集含ALL-HRP的洗脱峰混合，加甘油至50%，分装后于-20 ℃贮存备用。
1.2.2 制作胃蛋白酶标准曲线：ALL-HRP测定胃蛋白酶的作用模式为：ALL-胃蛋白酶-AL L-HRP,以5 mg/L ALL包被酶标板0.1 ml/孔，4℃过夜，PBS吐温洗板3次，加入稀释成不同 浓度的标准胃蛋白酶，37℃ 30 min洗板，加入1/1 000的ALL-HRP,37℃ 30 min， 洗板，加含有底物TMB的A、B液各1滴，37℃ 10 min,加终止液1滴,混匀测A450。每次同时作 空白及阴性对照，并进行重复性实验。
, 百拇医药
1.2.3 ALL-HRP对胃液中胃蛋白酶的检测：各种胃液经解冻后3 000 r/min离心 10 min,取上清液进行检测并测定其pH值。测定胃蛋白酶的作用模式为ALL-胃液-ALL-HRP, 条件及方法和标准曲线制作保持一致，每次同时作空白及阴性对照。
1.2.4 胃液胃蛋白酶活性的测定：采用改良安宋氐法[3]，标准曲线是将L-酪氨 酸用0.2 mol/L盐酸溶液稀释处理呈色后绘制。
2 结 果
2.1各组胃病患者胃液中胃蛋白酶含量比较：将胃蛋白酶稀释成0.1 mg/L至5mg/L,据其 吸光度A450与浓度关系制作标准曲线并求出其直线回归方程y=11.186x+0.265,相关 系数 r=0.991，将酶联法测定的各种胃液胃蛋白酶的A450代入直线回归方程，求出酶的含量 。各组数据
±s按组间进行方差分析。统计分析表明各种胃病患者正常组16例 ，慢性浅表性胃炎及胃窦炎32例，十二指肠溃疡组32例，胃溃疡组21例及胃癌组5例中，各 组胃蛋白酶含量无明显差异，见表1。
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表1 胃病患者胃液中胃蛋白酶含量及活性(±s) 组 别
n
含量
(ρB/mg.L-1)
活性
(ρB/mg.L -1，min)
正 常
16
3.326±1.626
, 百拇医药
668.2±427.5
胃 炎
32
3.323±1.599
584.3±505.1
十二指肠溃疡
32
3.376±1.634
707.3±485.1
胃溃疡
21
3.418±1.755
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668.1±663.1
胃 癌
5
3.880±2.168
419.8±510.9
各组间P均>0.05
2.2 各组胃液中胃蛋白酶活性的比较：将L-酪氨酸稀释成不同浓度后制作标准曲线，其 直线回归方程y=103.663x+0.798，相关系数r=0.995。胃液胃蛋白酶活性,以1 m l 胃液在37℃ 1 min时，水解血红蛋白所生成酪氨酸样物质，经呈色反应后测出吸光度值A640 ，将A640代入直线回归方程求出酪氨酸含量并计算出胃蛋白酶活性。在各组胃病患者中，十 二指肠溃疡组胃蛋白酶活性稍高，但统计分析显示各组胃蛋白酶活性亦无明显差异,见表1。
, 百拇医药
2.3 pH值对胃液胃蛋白酶活性及含量的影响：将胃液pH值1.5～3的作一组，而pH>4的为 另一组，结果pH值在1.5～3的胃蛋白酶含量明显高于pH值>4的一组，而胃蛋白酶活性两组 无显著差别。见表2。表2 胃液pH值对酶含量及活性(±s)影响 组别
pH值
n
含量
(ρB/mg.L-1)
活性
(ρB/mg.L -1，min)
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1
1.5～3
84
3.573±1.69
635.81±456.3
2
>4
22
2.523±1.26
505.12±496.1
P
<0.05
>0.05
, 百拇医药
3 讨 论
胃蛋白酶长期以来被认为是消化性溃疡的攻击因子之一，对胃液中胃蛋白酶的检测基本 上沿用经典的变性血红蛋白法测其活性。而对胃液中胃蛋白酶含量的检测未见报道。我们利 用ALL能与胃蛋白酶高度结合的特异性，采用HRP标记ALL，ELISA法测定胃液中胃蛋白酶含量 ，经重复实验，重现性好，且方法简单易行，因此，用ALL-HRP来测定胃蛋白酶含量是一种 可行的方法。
许多研究报道十二指肠溃疡时，胃液胃蛋白酶活性增加，而胃炎的酶活性降低[2 ，3]，但本文 实验表明十二指肠溃疡时胃蛋白酶活性虽较其他各组稍有增加，但统计学上无显著差异，重 复实验结果一样，与文献报道不同，原因有待进一步探讨。同时我们测定各组相应的胃液胃 蛋白酶含量亦无明显差异，而胃液pH值对胃蛋白酶的含量有影响，低pH值可促进酶的分泌， 但其活性增加不明显，推测胃液中某些因素可影响酶的活性。
从实验结果看，无论是胃蛋白酶活性或含量对各种胃部疾病的影响均不显著，酶含量与 活性也不成正相关，认为胃蛋白酶可能不是胃部疾病发生的主要原因，而胃粘膜的防御性因 素及其他胃的攻击因子与溃疡的发生关系可能更为密切。
参 考 文 献
1，周素芳，吴耀生，曾麒燕，等.采用酶标凝集素检测特异的糖蛋白.广西医科大 学学报，1997，14(4):58-60.
2，郭春祥，郭锡琼.介绍一种简单、快速高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸 钠法.上海免疫学杂志,1983,3(2):97-100.
3，叶应妩，李健斋，王玉琛主编.临床实验诊断学.北京:人民卫生出版社，1989 .1 495-1496
收稿日期：1998-12-21, http://www.100md.com
单位：周素芳 邓勇 周德义 吴耀生(广西医科大学生化教研室 南宁 530021)；凌江红(广西医科大学第一附属医院消化内科)
关键词：红桂木凝集素；胃蛋白酶；含量；活性
广西医科大学学报000127
摘要 目的：探讨红桂木凝集素用于胃液胃蛋白酶定量的可行性； 证实胃蛋白酶在胃部疾病中的作用。方法：将红桂木凝集素(ALL)标记上辣根过氧化物酶(HRP)，用夹心 酶联法测定不同胃病患者胃液中胃蛋白酶的含量，并用改良安宋氏法测定其相应的酶活性。结果：正常组(16例)、胃炎组(32例)、十二指肠溃疡组(32例)、胃 溃疡组(21例)及胃癌组(5例)中胃蛋白酶的含量及其活性均无显著性差异，但胃液pH值<3的 酶 含量要高于pH值>4的酶含量，而酶活性无明显差异。表明在胃酸增加时，胃蛋白酶的分泌亦 增加，但酶含量并不与酶活性成正相关，提示胃蛋白酶与胃部疾病的发生关系不密切，可能 不是胃部疾病发生的主要原因。
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中国图书资料分类法分类号 R446.61
ASSAY OF PEPSIN CONTENT AND ACTIVITY IN VARIOUS GASTRIC JUICE
Zhou Sufang，Deng Yong
(Department of Biochemistry,Guangxi Medical Unive rsity,Nanning，530021 China)
Ling Jianghong
(First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Nanning 5300 21 China)
Abstract Objective:To prove the possibility of quantitating g astric juice pepsin by ALL,and to prove pepsin effects on stomach diseases.Methods:The gastric juice pepsin contents and its activity wer e determined by ALL-HRP sandwich assay and modification Anon's method respectiv ely.Result:There were no significant differences in both pepsin co ntents and its activity among the normal controls and patients with various gast ric diseases including gastritis,duodenal ulcer,gastric ulcer and carcinoma of s tomach.But the pepsin contents of the gastric secretions with pH<3 were signifi cantly higher than those with pH>4,the pepsin activities had no significant dif ferences in the change of pH.Conclusion:There is no closely relation between pepsin and st omach diseases.Pepsin is no primary cause in producting stomach diseases.
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Key words artocarpus lingnanesis lectin;pepsin;content;activi ty
凝集素具有与糖蛋白特异结合的性质，笔者在研究红桂木凝集素(Artocarpus lingnane sis lectin,ALL)对各种糖蛋白的结合特性中发现ALL与胃蛋白酶特异结合，且亲和力很强 [1]。由此采用辣根过氧化物酶(HRP)标记ALL,用ELISA法检测不同胃病患者胃液中胃 蛋白酶含量，同时用改良安宋氏法测定胃蛋白酶活性，拟观察该酶的含量与活性之间的关系 及其对不同胃部疾病的影响。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 ALL：红桂木种子由广西亚热带作物研究所提供，本室自备达电泳纯。
, 百拇医药 1.1.2 胃液：收集胃镜确诊患者的空腹胃液，-20℃保存。广西医科大 学第一附属医院胃镜室提供。
1.1.3 试剂和仪器：HRP为上海丽珠东风生物技术有限公司产品；底物TMB，A、B液，终 止液为华美公司产品；电泳纯胃蛋白酶为Sigma产品；牛血红蛋白为中科院生化研究所产品 ；Σ960酶标仪为台湾产品。
1.2 方 法
1.2.1 ALL-HRP的制备：按郭春祥的HRP标记抗体的过碘酸钠法[2]稍加改进， 标记物过Sephardex G200柱，收集含ALL-HRP的洗脱峰混合，加甘油至50%，分装后于-20 ℃贮存备用。
1.2.2 制作胃蛋白酶标准曲线：ALL-HRP测定胃蛋白酶的作用模式为：ALL-胃蛋白酶-AL L-HRP,以5 mg/L ALL包被酶标板0.1 ml/孔，4℃过夜，PBS吐温洗板3次，加入稀释成不同 浓度的标准胃蛋白酶，37℃ 30 min洗板，加入1/1 000的ALL-HRP,37℃ 30 min， 洗板，加含有底物TMB的A、B液各1滴，37℃ 10 min,加终止液1滴,混匀测A450。每次同时作 空白及阴性对照，并进行重复性实验。
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1.2.3 ALL-HRP对胃液中胃蛋白酶的检测：各种胃液经解冻后3 000 r/min离心 10 min,取上清液进行检测并测定其pH值。测定胃蛋白酶的作用模式为ALL-胃液-ALL-HRP, 条件及方法和标准曲线制作保持一致，每次同时作空白及阴性对照。
1.2.4 胃液胃蛋白酶活性的测定：采用改良安宋氐法[3]，标准曲线是将L-酪氨 酸用0.2 mol/L盐酸溶液稀释处理呈色后绘制。
2 结 果
2.1各组胃病患者胃液中胃蛋白酶含量比较：将胃蛋白酶稀释成0.1 mg/L至5mg/L,据其 吸光度A450与浓度关系制作标准曲线并求出其直线回归方程y=11.186x+0.265,相关 系数 r=0.991，将酶联法测定的各种胃液胃蛋白酶的A450代入直线回归方程，求出酶的含量 。各组数据
±s按组间进行方差分析。统计分析表明各种胃病患者正常组16例 ，慢性浅表性胃炎及胃窦炎32例，十二指肠溃疡组32例，胃溃疡组21例及胃癌组5例中，各 组胃蛋白酶含量无明显差异，见表1。, http://www.100md.com
表1 胃病患者胃液中胃蛋白酶含量及活性(
±s) 组 别n
含量
(ρB/mg.L-1)
活性
(ρB/mg.L -1，min)
正 常
16
3.326±1.626
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668.2±427.5
胃 炎
32
3.323±1.599
584.3±505.1
十二指肠溃疡
32
3.376±1.634
707.3±485.1
胃溃疡
21
3.418±1.755
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668.1±663.1
胃 癌
5
3.880±2.168
419.8±510.9
各组间P均>0.05
2.2 各组胃液中胃蛋白酶活性的比较：将L-酪氨酸稀释成不同浓度后制作标准曲线，其 直线回归方程y=103.663x+0.798，相关系数r=0.995。胃液胃蛋白酶活性,以1 m l 胃液在37℃ 1 min时，水解血红蛋白所生成酪氨酸样物质，经呈色反应后测出吸光度值A640 ，将A640代入直线回归方程求出酪氨酸含量并计算出胃蛋白酶活性。在各组胃病患者中，十 二指肠溃疡组胃蛋白酶活性稍高，但统计分析显示各组胃蛋白酶活性亦无明显差异,见表1。
, 百拇医药
2.3 pH值对胃液胃蛋白酶活性及含量的影响：将胃液pH值1.5～3的作一组，而pH>4的为 另一组，结果pH值在1.5～3的胃蛋白酶含量明显高于pH值>4的一组，而胃蛋白酶活性两组 无显著差别。见表2。表2 胃液pH值对酶含量及活性(
±s)影响 组别pH值
n
含量
(ρB/mg.L-1)
活性
(ρB/mg.L -1，min)
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1
1.5～3
84
3.573±1.69
635.81±456.3
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>4
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2.523±1.26
505.12±496.1
P
<0.05
>0.05
, 百拇医药
3 讨 论
胃蛋白酶长期以来被认为是消化性溃疡的攻击因子之一，对胃液中胃蛋白酶的检测基本 上沿用经典的变性血红蛋白法测其活性。而对胃液中胃蛋白酶含量的检测未见报道。我们利 用ALL能与胃蛋白酶高度结合的特异性，采用HRP标记ALL，ELISA法测定胃液中胃蛋白酶含量 ，经重复实验，重现性好，且方法简单易行，因此，用ALL-HRP来测定胃蛋白酶含量是一种 可行的方法。
许多研究报道十二指肠溃疡时，胃液胃蛋白酶活性增加，而胃炎的酶活性降低[2 ，3]，但本文 实验表明十二指肠溃疡时胃蛋白酶活性虽较其他各组稍有增加，但统计学上无显著差异，重 复实验结果一样，与文献报道不同，原因有待进一步探讨。同时我们测定各组相应的胃液胃 蛋白酶含量亦无明显差异，而胃液pH值对胃蛋白酶的含量有影响，低pH值可促进酶的分泌， 但其活性增加不明显，推测胃液中某些因素可影响酶的活性。
从实验结果看，无论是胃蛋白酶活性或含量对各种胃部疾病的影响均不显著，酶含量与 活性也不成正相关，认为胃蛋白酶可能不是胃部疾病发生的主要原因，而胃粘膜的防御性因 素及其他胃的攻击因子与溃疡的发生关系可能更为密切。
参 考 文 献
1，周素芳，吴耀生，曾麒燕，等.采用酶标凝集素检测特异的糖蛋白.广西医科大 学学报，1997，14(4):58-60.
2，郭春祥，郭锡琼.介绍一种简单、快速高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸 钠法.上海免疫学杂志,1983,3(2):97-100.
3，叶应妩，李健斋，王玉琛主编.临床实验诊断学.北京:人民卫生出版社，1989 .1 495-1496
收稿日期：1998-12-21, http://www.100md.com