急性淋巴细胞白血病P16基因纯合子缺失的研究
作者：黄毓 甘登仕 薜小霞
单位：广西医科大学第一附属医院 南宁 530021
关键词：急性淋巴细胞性白血病；抑癌基因；MTS1；P16gene
广西医科大学学报000111
摘要 目的：为了解P16gene变异与急性淋巴细胞白血病(ALL )发生发展的关系。方法：采用差别PCR分析了30例ALL骨髓DNA和15例非恶性血液病骨髓 DNA P16gene纯合缺失。结果：30例ALL患者骨髓DNA有10例P16gene Exon 2纯合缺失 ，纯合缺失率为33.3%。结论：P16gene变异可能是ALL发生发展中的重要因素。
中国图书资料分类法分类号 R733.7
, 百拇医药
HOMOZYGOUS DELETION OF MTS1/P16 GENE IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEU KEMIA
Huang Yu,Gan Dengshi,Xue Xiaoxia
(First Affiliated Hospital of Guangxi M edical University,Nanning 530021 China)
Abstract Objective:To investigate the alteration of MTS1/P 16gene in acute lymphoblastic leukemia.Methods:A total of 45 marrow DNA specimens,composed of 30 acut e lymphoblastic leukemia and 15 controls marrow DNA specimens,were examined for homozygous deletion of MTS1/P16gene in by Differential PCR.Results:The results showed that no deletions were detected in 15 controls marrow DNA examples.However,10 of 30 acute lymphoblastic leukemia m arrow DNA specimens were found by differential PCR with a 33.3%(10/30) WTS1/P 16gene deletion rate.Conclusion:The result suggests that MTS1/P16gene alterat ion may be an important event in the progression of acute lymphoblastic leukemia .
, 百拇医药
Key words acute lymphoblastic leukemia;suppressive gene;MTS1/ P16gene
P16基因是新近发现的一种肿瘤抑制基因，位于人类染色体9P21 上，其表达产物P16蛋白系细胞周期依赖激酶4的抑制剂(CDK4I)，50%的恶性肿瘤与 P16基因失活有关[1]。近年来，有关P16gene在急性淋巴细胞白血病( ALL)的改变，尽管国外陆续有些报告[2，3]，但国内报告甚少[4]。为此 ，我们采用差别PCR对30例ALL的骨髓DNA进行P16gene纯合子缺失的分析，旨在探讨P 16gene与ALL的发生发展的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1标本来源：30例ALL均为我院血液科和儿科的住院病人，经骨髓检查确诊，男19例， 女 11例，年龄2～70岁，在治疗前取骨髓1～2ml；对照组15例，为良性血液病人的骨髓(缺铁性 贫血7例，血小板减少性紫殿8例)。
1.2 DNA提取：参照《分子克隆实验指南》[5]提取高相对分子质量DNA，用TE(pH 8.0)溶解，紫外分光光度计测其A值，调整浓度至50 mg/L，以备PCR扩增。
1.3 引物P16gene Exon 2序列(480bp)
PS1：5′-GGA AAT TGG AAA CTG GAA GC-3′
PS2：5′-TCT CAC CTT TGG AAG CTC T-3′
, 百拇医药
在反应体系中同时扩增DMD Exon 51作内对照，引物序列388bp：
PS1：5′-GGA AAT GGC TCT TTA GCT TGT GTT TC-3′
PS2：5′-GGA GAG TAA AGT GAT TGG TGG AAA ATC-3′
(上述引物均为中国科学院上海生化所合成)
1.4 PCR扩增：PCR反应混合液含10×PCR-Buffer，200 μmol/L dNTP，1 μmol/L Prim er ,200 ng模板DNA，Taq DNA 2.5 IU加H2O至终体积50 μl，在DNA扩增仪上进行如下循 环：95 ℃预变性5 min,95℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min 30 s,30个循环。取5 μl PCR产物在2 %琼脂糖凝胶(加EB 0.5 mg/L)上电泳分析(Taq DNA聚合酶为美国Life Techologies产品)。
, 百拇医药
2 结 果
30例ALL中，有20例和15例对照组P16gene Exon 2扩增阳性，10例ALL P16 gene Exon 2扩增阴性，表明有P16gene Exon 2纯合缺失，频率为33.3%(10/30)，见 图1。
图1 差别PCR检测ALL P16基因缺失电泳分析图谱
注：1.为相对分子质量标志，2. 2～10为ALL髓DNA标本，其中3，4，6，7，8为MTS1/ P16gene Exon 2纯合缺失，即扩增阴性；2，5，9，10为扩增阳性。
3 讨 论
, 百拇医药
P16gene定位于人类染色体9P21区，编码序列包括2个内含子和3个外显子 ，表达产物是相对分子质量为16 ku的蛋白质，而外显子1和外显子2约编码P16蛋白的 97%。P16基因的突变多发生在外显子2，常表现为缺失。P16蛋白与CDK4-Cy clin D复合物结合，使CDK4的激活功能丧失，阻滞细胞进入G1-S期，导致细胞生长停 滞[1]，当P16gene丢失或突变时，CDK4-Cyclin复合物催化Rb基因磷酸化 (Rb为一种抑癌基因)，磷酸化后的Rb基因，丧失对细胞增殖的负性调控作用，由此引发细胞 的恶性增殖[6]。
本实验检测30例ALL，10例存在P16gene Exon 2纯合缺失。文献报告[7] 血液系统恶性肿瘤P16gene缺失和突变的检出率为5.56%～43.6%，平均为13.8%，其 中以急性淋巴细胞性白血病(ALL)检出最高，平均为29.8%，与本研究结果相近。ALL中各型 间P16gene缺失和突变的检出率也不同，Hebert等[8]应用Southern blot法 检测55例ALL，T-ALL和B-ALL患者P16gene纯合子缺失检出率分别为91.7%和6.5% ，5例(4例T-ALL,1例B-ALL)患者和MOLT4细胞系检出P16gene Exon 1和P15 gene之间的25Kb DNA区域有一P16gene外显子缺失断裂点，1例T-ALL物P16gen e重排于Exon 2下游区，6例可能有一个等位基因的缺失。本实验10例存在P16gene基 因纯合子缺失，这些患者普遍对治疗反应差，虽经积极治疗，也极易复发。目前，仅5例还 在缓解期，1例患者在首诊治疗期间死亡，余2例患者未达完全缓解，放弃治疗出院，2例缓 解后复发，死于感染，脏器衰竭等症。P16gene在ALL中高频率的缺失以及P16g ene缺失患者的临床表现，提示P16gene与ALL的发生、发展有关。(此课题得到卢玉英 教授，程鹏、周建生、周吉成、彭志刚、周丽南老师的大力协助，特此致谢))
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Kamb A,Gruis NA,Feldhaus JW,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tunior types.Science,1994,264:436.
2，Quesncl B,Prcudhommc C,Philippc N,et al.P16gene homoszygous del etion in acute lymphoblastic leukemia.Blood,1995,85(3):657-663.
3，Iolascon A,Faienza UF,Coppola B,et al.Homozygous deletions of cyclin -dependent kinase inhibitor genes P16,INK4A and P18,in childhood T-cell lineage acute lymphoblastic leukemias.Leukemia,1996,10:255-260.
, 百拇医药
4，刘明利，楼方定，郭山春，等.淋巴细胞恶性肿瘤P16基因纯合缺失和突 变的研究.中国实验血液学杂志，1998，6(1)：49.
5，金冬雁.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学技术出版社，1996.465-467 .
6，Shapiro GI,Edwards CD,Kobzikl,et al.Reciprocal Rb imactivation and P 16 expression in primary lung cancers and cell lines.Cancer Res,1994,54(2 1):5 547.
7，Yazaki Y,Ogawa S,Hirano N,et al.Homozygous loss of the cyclindependen t kinase 4-inhibitor (P16)gene in humen leukemias.Blood,1994,84(8):2 431.
8，Hebert J,Coyuele JM,Berkeley J,et al.Candidate Tumor Suppressor gene MTS1,(P16 INK4A) and MTS2 (P16 INK4B) display frequent homozygou s deletions in primary cells from T-but not from B-cell lineage acute lymphobl astic leukemias.Blood,1994,84(12):4 038.
收稿日期：1998-08-10, http://www.100md.com
单位：广西医科大学第一附属医院 南宁 530021
关键词：急性淋巴细胞性白血病；抑癌基因；MTS1；P16gene
广西医科大学学报000111
摘要 目的：为了解P16gene变异与急性淋巴细胞白血病(ALL )发生发展的关系。方法：采用差别PCR分析了30例ALL骨髓DNA和15例非恶性血液病骨髓 DNA P16gene纯合缺失。结果：30例ALL患者骨髓DNA有10例P16gene Exon 2纯合缺失 ，纯合缺失率为33.3%。结论：P16gene变异可能是ALL发生发展中的重要因素。
中国图书资料分类法分类号 R733.7
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HOMOZYGOUS DELETION OF MTS1/P16 GENE IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEU KEMIA
Huang Yu,Gan Dengshi,Xue Xiaoxia
(First Affiliated Hospital of Guangxi M edical University,Nanning 530021 China)
Abstract Objective:To investigate the alteration of MTS1/P 16gene in acute lymphoblastic leukemia.Methods:A total of 45 marrow DNA specimens,composed of 30 acut e lymphoblastic leukemia and 15 controls marrow DNA specimens,were examined for homozygous deletion of MTS1/P16gene in by Differential PCR.Results:The results showed that no deletions were detected in 15 controls marrow DNA examples.However,10 of 30 acute lymphoblastic leukemia m arrow DNA specimens were found by differential PCR with a 33.3%(10/30) WTS1/P 16gene deletion rate.Conclusion:The result suggests that MTS1/P16gene alterat ion may be an important event in the progression of acute lymphoblastic leukemia .
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Key words acute lymphoblastic leukemia;suppressive gene;MTS1/ P16gene
P16基因是新近发现的一种肿瘤抑制基因，位于人类染色体9P21 上，其表达产物P16蛋白系细胞周期依赖激酶4的抑制剂(CDK4I)，50%的恶性肿瘤与 P16基因失活有关[1]。近年来，有关P16gene在急性淋巴细胞白血病( ALL)的改变，尽管国外陆续有些报告[2，3]，但国内报告甚少[4]。为此 ，我们采用差别PCR对30例ALL的骨髓DNA进行P16gene纯合子缺失的分析，旨在探讨P 16gene与ALL的发生发展的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1标本来源：30例ALL均为我院血液科和儿科的住院病人，经骨髓检查确诊，男19例， 女 11例，年龄2～70岁，在治疗前取骨髓1～2ml；对照组15例，为良性血液病人的骨髓(缺铁性 贫血7例，血小板减少性紫殿8例)。
1.2 DNA提取：参照《分子克隆实验指南》[5]提取高相对分子质量DNA，用TE(pH 8.0)溶解，紫外分光光度计测其A值，调整浓度至50 mg/L，以备PCR扩增。
1.3 引物P16gene Exon 2序列(480bp)
PS1：5′-GGA AAT TGG AAA CTG GAA GC-3′
PS2：5′-TCT CAC CTT TGG AAG CTC T-3′
, 百拇医药
在反应体系中同时扩增DMD Exon 51作内对照，引物序列388bp：
PS1：5′-GGA AAT GGC TCT TTA GCT TGT GTT TC-3′
PS2：5′-GGA GAG TAA AGT GAT TGG TGG AAA ATC-3′
(上述引物均为中国科学院上海生化所合成)
1.4 PCR扩增：PCR反应混合液含10×PCR-Buffer，200 μmol/L dNTP，1 μmol/L Prim er ,200 ng模板DNA，Taq DNA 2.5 IU加H2O至终体积50 μl，在DNA扩增仪上进行如下循 环：95 ℃预变性5 min,95℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min 30 s,30个循环。取5 μl PCR产物在2 %琼脂糖凝胶(加EB 0.5 mg/L)上电泳分析(Taq DNA聚合酶为美国Life Techologies产品)。
, 百拇医药
2 结 果
30例ALL中，有20例和15例对照组P16gene Exon 2扩增阳性，10例ALL P16 gene Exon 2扩增阴性，表明有P16gene Exon 2纯合缺失，频率为33.3%(10/30)，见 图1。
图1 差别PCR检测ALL P16基因缺失电泳分析图谱
注：1.为相对分子质量标志，2. 2～10为ALL髓DNA标本，其中3，4，6，7，8为MTS1/ P16gene Exon 2纯合缺失，即扩增阴性；2，5，9，10为扩增阳性。
3 讨 论
, 百拇医药
P16gene定位于人类染色体9P21区，编码序列包括2个内含子和3个外显子 ，表达产物是相对分子质量为16 ku的蛋白质，而外显子1和外显子2约编码P16蛋白的 97%。P16基因的突变多发生在外显子2，常表现为缺失。P16蛋白与CDK4-Cy clin D复合物结合，使CDK4的激活功能丧失，阻滞细胞进入G1-S期，导致细胞生长停 滞[1]，当P16gene丢失或突变时，CDK4-Cyclin复合物催化Rb基因磷酸化 (Rb为一种抑癌基因)，磷酸化后的Rb基因，丧失对细胞增殖的负性调控作用，由此引发细胞 的恶性增殖[6]。
本实验检测30例ALL，10例存在P16gene Exon 2纯合缺失。文献报告[7] 血液系统恶性肿瘤P16gene缺失和突变的检出率为5.56%～43.6%，平均为13.8%，其 中以急性淋巴细胞性白血病(ALL)检出最高，平均为29.8%，与本研究结果相近。ALL中各型 间P16gene缺失和突变的检出率也不同，Hebert等[8]应用Southern blot法 检测55例ALL，T-ALL和B-ALL患者P16gene纯合子缺失检出率分别为91.7%和6.5% ，5例(4例T-ALL,1例B-ALL)患者和MOLT4细胞系检出P16gene Exon 1和P15 gene之间的25Kb DNA区域有一P16gene外显子缺失断裂点，1例T-ALL物P16gen e重排于Exon 2下游区，6例可能有一个等位基因的缺失。本实验10例存在P16gene基 因纯合子缺失，这些患者普遍对治疗反应差，虽经积极治疗，也极易复发。目前，仅5例还 在缓解期，1例患者在首诊治疗期间死亡，余2例患者未达完全缓解，放弃治疗出院，2例缓 解后复发，死于感染，脏器衰竭等症。P16gene在ALL中高频率的缺失以及P16g ene缺失患者的临床表现，提示P16gene与ALL的发生、发展有关。(此课题得到卢玉英 教授，程鹏、周建生、周吉成、彭志刚、周丽南老师的大力协助，特此致谢))
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Kamb A,Gruis NA,Feldhaus JW,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tunior types.Science,1994,264:436.
2，Quesncl B,Prcudhommc C,Philippc N,et al.P16gene homoszygous del etion in acute lymphoblastic leukemia.Blood,1995,85(3):657-663.
3，Iolascon A,Faienza UF,Coppola B,et al.Homozygous deletions of cyclin -dependent kinase inhibitor genes P16,INK4A and P18,in childhood T-cell lineage acute lymphoblastic leukemias.Leukemia,1996,10:255-260.
, 百拇医药
4，刘明利，楼方定，郭山春，等.淋巴细胞恶性肿瘤P16基因纯合缺失和突 变的研究.中国实验血液学杂志，1998，6(1)：49.
5，金冬雁.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学技术出版社，1996.465-467 .
6，Shapiro GI,Edwards CD,Kobzikl,et al.Reciprocal Rb imactivation and P 16 expression in primary lung cancers and cell lines.Cancer Res,1994,54(2 1):5 547.
7，Yazaki Y,Ogawa S,Hirano N,et al.Homozygous loss of the cyclindependen t kinase 4-inhibitor (P16)gene in humen leukemias.Blood,1994,84(8):2 431.
8，Hebert J,Coyuele JM,Berkeley J,et al.Candidate Tumor Suppressor gene MTS1,(P16 INK4A) and MTS2 (P16 INK4B) display frequent homozygou s deletions in primary cells from T-but not from B-cell lineage acute lymphobl astic leukemias.Blood,1994,84(12):4 038.
收稿日期：1998-08-10, http://www.100md.com