胸腹腔积液细胞端粒酶活性的表达
作者：魏秀妹 陈君敏 陈仁奋 庄祥龙
单位：魏秀妹(福建医科大学 附属第一医院检验科,福州 350005); 陈君敏(福建医科大学 附属第一医院检验科,福州 350005); 陈仁奋(福建医科大学 附属第一医院检验科,福州 350005); 庄祥龙(福建医科大学 附属第一医院检验科,福州 350005)
关键词：端粒；端粒酶；胸腔积液；酶联免疫吸附测定
福建医科大学学报000123
中图分类号:R561.304;R446.61;R442.5 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0061-02
端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，即染色体末端的DNA重复序列，能防止染色体DNA降解、末端融合、异常重组与染色体缺失[1]。端粒被称为细胞的“分裂钟”，与细胞衰老与癌变密切相关。端粒的DNA合成必须依赖端粒酶(telomerase),该酶是一种核糖核酸蛋白酶，其模板区的一段序列5’CUAACCCUAAC 3’与端粒序列互补[2]，通过逆转录合成端粒。近年来，端粒与端粒酶已成为医学、生物学界的研究热点。许多学者认为，端粒酶的激活和端粒长度的稳定是肿瘤细胞永生化所必需[3]。笔者1998年6月～1999年3月采用端粒重复扩增-酶联免疫法(TRAP-ELISA法)检测良恶性胸腹腔积液细胞中端粒酶的表达，结果如下。
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1 材料与方法
1.1 标本来源 35份胸腹腔积液标本选自我院住院病人，年龄28～74岁，病人分为二组。良性组:肝炎后肝硬化5例，均为失代偿期，经临床表现、肝功能、B超和X线检查确诊；肺结核5例，经临床表现、X线和/或抗酸杆菌检测确诊。恶性组:肺癌11例，经纤维支气管镜活检和/或术后病理证实；肝癌8例，经临床、CT扫描、甲胎蛋白(AFP)和/或手术病理证实。
1.2 试剂与仪器 Lysis Buffer:155 mmol/L NH4Cl,10 mmol/L KHCO3,0.1 mmol/L EDTA。 Detection Telomeric Kit(德国宝灵曼公司)，PE-9600型PCR扩增仪(美国PE公司)，AvantiTM30型低温高速离心机(美国贝克曼公司)，BIO-RAD Model 550酶标仪(美国伯乐公司)。
, 百拇医药
1.3 端粒酶活性测定
1.3.1 标本处理 所有实验耗材均经过DEPC(SERVA)水处理，高压灭菌备用。无菌收集10 ml胸腹水，按20 IU/ ml EDTA抗凝，计细胞数，转移2×106细胞数的胸腹水至离心管中，4℃ 3000 g离心10 min，弃上清；悬浮细胞于PBS中，4℃ 3000 g离心10 min，弃上清。若红细胞数太多，可用Lysis Buffer室温溶解10 min后离心。细胞扣储存于-80℃。另收集20～50 ml胸腹水做病理学检查，2000 g离心10 min，取沉渣涂片，HE染色，镜检。
1.3.2 阴性对照 经65℃ 10 min处理的HL60细胞。
1.3.3 实验步骤 按操作说明书。
1.3.3.1 延伸/扩增 细胞扣加入反应液25 μl，细胞裂解液3 μl，无菌水补足至50 μl。按以下程序:25℃，15 min→94℃，5 min→94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环→72℃，10 min→4℃。
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1.3.3.2 变性 扩增产物5 μl加入变性剂20 μl，室温孵育10 min。
1.3.3.3 杂交/ELISA 加入杂交缓冲液225 μl，转移100 μl至MTP孔中，37℃孵育，2 h，洗3次，然后加入抗-DIG-POD工作液100 μl,室温30 min,洗5次，加入底物，显色10 min，加入终止液，酶标仪比色(主波长450 nm，参考波长690 nm)。
1.4 阳性判断 (样品A-空白A)>0.2 A450-A690判断为阳性。
1.5 统计学处理 配对χ2检验。
2 结 果
端粒酶活性与脱落细胞病理学检查结果(附表)
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附表 端粒酶活性与脱落细胞病理学检查 分 组
n
端粒酶活性
脱落细胞学病理
阳性数
%
阳性数
%
良性组
10
0
0
肝硬化腹水
, 百拇医药
5
0
0
结核性胸水
5
0
0
恶性组
25
15
60.0
7
28.0*
, 百拇医药
肺癌胸水
11
6
54.5
3
27.3
肝癌腹水
8
5
62.5
2
25.0
其他癌性胸腹水
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6
4
66.7
2
33.3
与端粒酶活性检测比较，*:P<0.05.
3 讨 论
正常哺乳动物细胞的增殖具有精细的调节机制，其一是细胞凋亡，另一是端粒随细胞分裂进行性缩短，使细胞衰老降低生殖能力，最终死亡。近来，端粒-端粒酶假说系统异常成为肿瘤发生的一种新假说[4，5]。据统计，肿瘤组织中检出端粒酶活性占84.3%，而相应癌旁组织或正常组织仅占3.4%[6]。Shay等实验表明，在肿瘤细胞的恶性进展和永生细胞的维持中，端粒酶可能起到关键作用[5]。
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自1994年Kim等建立了灵敏、快速、高效的端粒重复扩增法后，极大地促进了端粒、端粒酶的研究[3，4]。端粒酶的检测目前主要有TRAP-放免、TRAP-银染与TRAP-ELISA等法[7]。笔者采用TRAP-ELISA法测定端粒酶的活性，避免了放射性同位素的污染，安全、简便、可靠、敏感，一步法操作，耗时仅5 h。随着端粒酶基因克隆的成功，端粒酶的检测有望用于临床检测。
笔者检测35份胸腹腔积液细胞端粒酶的表达，25份恶性肿瘤标本有15份端粒酶表达阳性，10份良性胸腹腔积液无阳性表达。临床上，胸腹腔积液脱落细胞涂片的病理学检查是常规诊断手段之一，但由于受经验、技术条件及细胞数量的限制，其对癌性积液很难定性诊断。笔者将二者进行比较，端粒酶活性的检测较脱落细胞涂片的病理学检查有较高的阳性率(χ2=4.85，P<0.05)。本文表明，恶性组的胸腹腔积液端粒酶阳性率显著高于良性组，对鉴别诊断良、恶性的胸腹腔积液有较重要的指导作用。笔者将进一步研究端粒酶的活性变化与肿瘤发生和发展的因果关系。
, 百拇医药
作者简介:魏秀妹，女，1974年8月生，检验师.
参考文献:
[1]Gottschling DE,Aparicio OM,Billing BL,et al.Position effect at S.Cerevisiae telomeres:reversible repression of Poly Ⅱ transcription[J].Cell,1990;63:751～756
[2]Feng J,Funk WD,Wang SS,et al.The RNA component of human telomerase[J].Science,1995;269:1236～1241
[3]Hiyama E,Kodama T,Shinbara K,et al.Telomerase activity is detected in pancreatic cancer but not in benign tumors[J].Cancer Res,1997;57:326
, http://www.100md.com
[4]Holt SE,Shay JW,Wright WE.Refining the telomere-telomerase hypothesis of aging and cancer[J].Nature Biotechnol,1996;14(7):836～839
[5]Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994;266:2011～2015
[6]张 桥，万德森.端粒酶在人类肿瘤发展过程的表达及其利用[J].癌症，1997;16(6):461～463
[7]Saito Y,Suda T,Hatakeyama K,et al.Method of measuring telomere length and telomerase activity-pratice and problems[J].Nippon Rinsho,1998;56(5):1153～1158
收稿日期:1999-05-31, 百拇医药
单位：魏秀妹(福建医科大学 附属第一医院检验科,福州 350005); 陈君敏(福建医科大学 附属第一医院检验科,福州 350005); 陈仁奋(福建医科大学 附属第一医院检验科,福州 350005); 庄祥龙(福建医科大学 附属第一医院检验科,福州 350005)
关键词：端粒；端粒酶；胸腔积液；酶联免疫吸附测定
福建医科大学学报000123
中图分类号:R561.304;R446.61;R442.5 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0061-02
端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，即染色体末端的DNA重复序列，能防止染色体DNA降解、末端融合、异常重组与染色体缺失[1]。端粒被称为细胞的“分裂钟”，与细胞衰老与癌变密切相关。端粒的DNA合成必须依赖端粒酶(telomerase),该酶是一种核糖核酸蛋白酶，其模板区的一段序列5’CUAACCCUAAC 3’与端粒序列互补[2]，通过逆转录合成端粒。近年来，端粒与端粒酶已成为医学、生物学界的研究热点。许多学者认为，端粒酶的激活和端粒长度的稳定是肿瘤细胞永生化所必需[3]。笔者1998年6月～1999年3月采用端粒重复扩增-酶联免疫法(TRAP-ELISA法)检测良恶性胸腹腔积液细胞中端粒酶的表达，结果如下。
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1 材料与方法
1.1 标本来源 35份胸腹腔积液标本选自我院住院病人，年龄28～74岁，病人分为二组。良性组:肝炎后肝硬化5例，均为失代偿期，经临床表现、肝功能、B超和X线检查确诊；肺结核5例，经临床表现、X线和/或抗酸杆菌检测确诊。恶性组:肺癌11例，经纤维支气管镜活检和/或术后病理证实；肝癌8例，经临床、CT扫描、甲胎蛋白(AFP)和/或手术病理证实。
1.2 试剂与仪器 Lysis Buffer:155 mmol/L NH4Cl,10 mmol/L KHCO3,0.1 mmol/L EDTA。 Detection Telomeric Kit(德国宝灵曼公司)，PE-9600型PCR扩增仪(美国PE公司)，AvantiTM30型低温高速离心机(美国贝克曼公司)，BIO-RAD Model 550酶标仪(美国伯乐公司)。
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1.3 端粒酶活性测定
1.3.1 标本处理 所有实验耗材均经过DEPC(SERVA)水处理，高压灭菌备用。无菌收集10 ml胸腹水，按20 IU/ ml EDTA抗凝，计细胞数，转移2×106细胞数的胸腹水至离心管中，4℃ 3000 g离心10 min，弃上清；悬浮细胞于PBS中，4℃ 3000 g离心10 min，弃上清。若红细胞数太多，可用Lysis Buffer室温溶解10 min后离心。细胞扣储存于-80℃。另收集20～50 ml胸腹水做病理学检查，2000 g离心10 min，取沉渣涂片，HE染色，镜检。
1.3.2 阴性对照 经65℃ 10 min处理的HL60细胞。
1.3.3 实验步骤 按操作说明书。
1.3.3.1 延伸/扩增 细胞扣加入反应液25 μl，细胞裂解液3 μl，无菌水补足至50 μl。按以下程序:25℃，15 min→94℃，5 min→94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环→72℃，10 min→4℃。
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1.3.3.2 变性 扩增产物5 μl加入变性剂20 μl，室温孵育10 min。
1.3.3.3 杂交/ELISA 加入杂交缓冲液225 μl，转移100 μl至MTP孔中，37℃孵育，2 h，洗3次，然后加入抗-DIG-POD工作液100 μl,室温30 min,洗5次，加入底物，显色10 min，加入终止液，酶标仪比色(主波长450 nm，参考波长690 nm)。
1.4 阳性判断 (样品A-空白A)>0.2 A450-A690判断为阳性。
1.5 统计学处理 配对χ2检验。
2 结 果
端粒酶活性与脱落细胞病理学检查结果(附表)
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附表 端粒酶活性与脱落细胞病理学检查 分 组
n
端粒酶活性
脱落细胞学病理
阳性数
%
阳性数
%
良性组
10
0
0
肝硬化腹水
, 百拇医药
5
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结核性胸水
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0
0
恶性组
25
15
60.0
7
28.0*
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肺癌胸水
11
6
54.5
3
27.3
肝癌腹水
8
5
62.5
2
25.0
其他癌性胸腹水
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6
4
66.7
2
33.3
与端粒酶活性检测比较，*:P<0.05.
3 讨 论
正常哺乳动物细胞的增殖具有精细的调节机制，其一是细胞凋亡，另一是端粒随细胞分裂进行性缩短，使细胞衰老降低生殖能力，最终死亡。近来，端粒-端粒酶假说系统异常成为肿瘤发生的一种新假说[4，5]。据统计，肿瘤组织中检出端粒酶活性占84.3%，而相应癌旁组织或正常组织仅占3.4%[6]。Shay等实验表明，在肿瘤细胞的恶性进展和永生细胞的维持中，端粒酶可能起到关键作用[5]。
, http://www.100md.com
自1994年Kim等建立了灵敏、快速、高效的端粒重复扩增法后，极大地促进了端粒、端粒酶的研究[3，4]。端粒酶的检测目前主要有TRAP-放免、TRAP-银染与TRAP-ELISA等法[7]。笔者采用TRAP-ELISA法测定端粒酶的活性，避免了放射性同位素的污染，安全、简便、可靠、敏感，一步法操作，耗时仅5 h。随着端粒酶基因克隆的成功，端粒酶的检测有望用于临床检测。
笔者检测35份胸腹腔积液细胞端粒酶的表达，25份恶性肿瘤标本有15份端粒酶表达阳性，10份良性胸腹腔积液无阳性表达。临床上，胸腹腔积液脱落细胞涂片的病理学检查是常规诊断手段之一，但由于受经验、技术条件及细胞数量的限制，其对癌性积液很难定性诊断。笔者将二者进行比较，端粒酶活性的检测较脱落细胞涂片的病理学检查有较高的阳性率(χ2=4.85，P<0.05)。本文表明，恶性组的胸腹腔积液端粒酶阳性率显著高于良性组，对鉴别诊断良、恶性的胸腹腔积液有较重要的指导作用。笔者将进一步研究端粒酶的活性变化与肿瘤发生和发展的因果关系。
, 百拇医药
作者简介:魏秀妹，女，1974年8月生，检验师.
参考文献:
[1]Gottschling DE,Aparicio OM,Billing BL,et al.Position effect at S.Cerevisiae telomeres:reversible repression of Poly Ⅱ transcription[J].Cell,1990;63:751～756
[2]Feng J,Funk WD,Wang SS,et al.The RNA component of human telomerase[J].Science,1995;269:1236～1241
[3]Hiyama E,Kodama T,Shinbara K,et al.Telomerase activity is detected in pancreatic cancer but not in benign tumors[J].Cancer Res,1997;57:326
, http://www.100md.com
[4]Holt SE,Shay JW,Wright WE.Refining the telomere-telomerase hypothesis of aging and cancer[J].Nature Biotechnol,1996;14(7):836～839
[5]Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994;266:2011～2015
[6]张 桥，万德森.端粒酶在人类肿瘤发展过程的表达及其利用[J].癌症，1997;16(6):461～463
[7]Saito Y,Suda T,Hatakeyama K,et al.Method of measuring telomere length and telomerase activity-pratice and problems[J].Nippon Rinsho,1998;56(5):1153～1158
收稿日期:1999-05-31, 百拇医药