塑料粘附δ实验检测骨髓原始祖细胞
作者：陈君敏 魏秀妹 陈志哲
单位：陈君敏(福建医科大学附属第一医院血液科,福州 350005); 魏秀妹(福建医科大学附属第一医院血液科,福州 350005); 陈志哲(福建医科大学附属协和医院血液科,福州 350005)
关键词：骨髓；造血干细胞；细胞粘附
福建医科大学学报000135
摘要:目的 采用塑料粘附δ实验(PΔ)估计骨髓原始祖细胞的相对数量。方法 取4例非血液病患者骨髓，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，取少量细胞加入甲基纤维素培养基，37℃，5%CO2孵箱培养，14天后计数集落(CFU-GM)，其余细胞作PΔ。结果 4份骨髓的PΔ相对数(/107细胞)分别为662,534,2220和1120，CFU-GM(/104细胞)分别为14.1,16.3,33.6和25.6，二者大致平行。结论 PΔ可作为骨髓原始祖细胞的评估方法，由于方法简便，耗时短，适合实际应用。
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中图分类号:R446.113 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0076-02
δ Assay of Plastic-adherent Cells for Evaluating Bone Marrow Primitive Progenitor
CHEN Jun-min,WEI Xiu-mei
(Department of Hematology,The Affiliated First Hospital,FujianMedical University,Fuzhou 350005,China
CHEN Zhi-zhe
(Department of Hematology,The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China)
, 百拇医药
ABSTRACT:Objective To introduce the δ assay of plastic-adherent cells(PΔ) for assessing bone marrow primitive progenitor.Methods Bone marrow samples were collected from four patients with other than hematological diseases and mononuclear cells(BMMNCs) were obtained by Ficoll-hypaque gradient centrifugation.Some BMMNCs were added to methycellulose medium for CFU-GM assay.The rest of BMMNCs were suspended in IMDM and incubated in 25 mm2tissue culture flask.Two hours later,non-adherent cell were removed and long term culture(LTC) medium was added to the flask.After 7 days of culture at 37℃ in humidified atmosphere of 5%CO2,non-adherent cells in supernant were collected and CFU-GM assay made.The colony number served as the relative level of PΔ.Results PΔ of 4 samples were 662,534,2220 and 1120/107 cells,respectively,which were paralleled with CFU-GM on the whole.Conclusion PΔ assay might serve as a method to evaluate bone marrow primitive progenitor.Because of less complexity and less time-comsuming,it might be suitable to practical application.
, 百拇医药
KEY WORDS:bone marrow；hematopoietic stem cell；cell adhesion
原始造血祖细胞的定量和功能分析对于造血干细胞移植及其基因治疗非常重要。原始祖细胞的检测一般用长期培养启动细胞实验[1，2]，由于该实验繁琐、耗时，实际应用有一定困难。采用塑料粘附δ实验(PΔ)估计骨髓原始祖细胞含量，所用材料少，方法简便，耗时短[3]。笔者于1998年8月～1998年12月进行实验研究，报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 为4例非血液系统疾病患者骨髓，用500 IU/ml的肝素抗凝，骨髓涂片常规检查正常。
1.2 PΔ实验[3]肝素抗凝的骨髓用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)梯度密度离心，分离单个核细胞(BMMNCs)，PBS洗涤2次，用含10%胎牛血清(FCS，杭州四季青生化公司)的IMDM(Gibco)培养基悬浮，计数并调整细胞浓度至约1×107/8 ml。上述BMMNCs加入25 cm2的塑料培养瓶(Corning)，37℃，5%CO2孵箱培养。2 h后去除非贴壁细胞，加入含钙镁的HBSS(室温)洗去非贴壁细胞，重复3次。粘附的细胞加含10-6 mol/L氢化可的松的LTC培养基(干细胞)8 ml，37℃，5%CO2孵箱继续培养。LTC培养基为含2 mmol/L谷氨酰胺，0.2 mmol/L肌醇，20 μmol/L叶酸，10-4mol/L二巯基乙醇(2ME)，12.5%马血清及12.5%FCS的αMEM。培养7天后吸取非贴壁细胞，离心。用含2%FCS的IMDM培养基洗2次并重新悬浮，计数，调整细胞浓度至约(2～5)×105/ml，取适量加入半固体培养基(下述)，14天后计数CFU-GM集落。按下式计算PΔ:
, 百拇医药
PΔ＝集落数÷加入半固体培养基的细胞数×非贴壁细胞总数÷初始BMMNCs总数
1.3 CFU-GM检测 新鲜分离的BMMNCs或上述PΔ实验培养7天的非贴壁细胞用 2%FCS的IMDM培养基悬浮，计数并调整细胞浓度约(2～5)×105 /ml。取0.2 ml加入半固体培养基2 ml充分混匀，分成2份，分别加入35 mm的培养皿，37℃，5%CO2孵箱培养 14天后，倒置显微镜下计集落数，取2个皿集落数的均值。半固体培养基为0.9%甲基纤维素(华美生物工程公司)IMDM溶液，含30%FCS，1%牛血清白蛋白(BSA，华美生物工程公司)，10-4 mol/L 2ME(Sigma)，2 mmol/L谷氨酰胺(华美生物工程公司)，以及细胞因子rhSCF(50 ng/ml)、rhGM-CSF(10 ng/ml)和rhIL-3(10 ng/ml)，3种细胞因子均为Kirin公司惠赠。
1.4 CD34表型分析 上述PΔ实验培养7天的粘附BMMNCs用0.25%胰酶枸橼酸钠溶液5 ml消化，37℃孵育约3 min，见贴壁层浮起时加FCS 1 ml中和胰酶，反复吹打使所有细胞脱落，离心，用PBS洗涤并重新悬浮。重悬浮的细胞悬液或新鲜分离的BMMNCs的PBS悬液加FITC标记的鼠抗人CD34(Immunotech)，4℃孵育30 min后离心，PBS洗涤，Bryte HS流式细胞仪(Bio-Rad,美国伯乐公司)检测，用WinBryte软件分析。
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2 结 果 (附表)
附表 4份骨髓标本造血祖细胞检测结果 标本
CD34+
细胞
(%)
CFU-GM
(集落数/
104细胞)
塑料粘附
BMMNCs中
CD34+细胞(%)
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PΔ
(集落数/107
细胞)
1
14.1
662
2
0.4
16.3
15.2
534
3
0.8
, 百拇医药
33.6
18.0
2220
4
25.6
1120
3 讨 论
对人造血祖细胞的定量分析可采用半固体培养基的集落形成实验，但该实验只说明较成熟的定向祖细胞如CFU-GM，这些祖细胞不具备长期植活能力。原始祖细胞具有长期植活能力，造血干细胞移植物中的原始祖细胞含量关系到移植的成败，因此原始祖细胞的定量检测有重要价值。检测原始祖细胞一般采用LTCIC试验[1,2]，整个过程需10周。不仅如此，由于所用材料多，实验繁琐，实验过程被污染的机会大，实际应用起来有一定困难。研究表明，塑料粘附的造血祖细胞对氟脲嘧啶抵抗[4]，表达Thy-1和CD34+[3]，是21天血岛形成细胞(CAFC)的前体细胞，能维持在长期骨髓培养(LTBMC)系统的造血[5]，因此是原始的造血祖细胞。
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通过塑料粘附δ实验(PΔ)，即检测塑料粘附的BMMNCs体外产生CFU-GM数，可估算骨髓原始祖细胞的相对数量[3]。笔者的4份标本PΔ为(544～2220)/107 BMMNCs，与Gordon报道接近[3]，同时与较成熟的定向祖细胞CFU-GM大致平行。不同标本之间有较大差异，可能由于实验本身造成，因为起始细胞数和培养7天后的非贴壁细胞数的误差均影响最后结果。不过根据Gordon的经验，同一份骨髓标本分开实验的重复性好，结果无显著不同。与LTCIC实验比较，PΔ实验不仅耗时短(整个过程3周，较CFU-GM检测多1周)，而且所用材料少，方法简便，污染机会少，因此较适合实际应用。
据文献报道[3]，塑料粘附的CD34+细胞占骨髓所有CD34+细胞的5%～10%。笔者结果显示，塑料粘附的BMMNCs中CD34+细胞占15.2%和18.0%，显著高于BMMNCs中的0.4%和0.8%，说明塑料粘附有富集骨髓CD34+细胞的作用，同时提示塑料粘附的CD34+细胞数也是评估骨髓原始祖细胞的一项指标，有待进一步考察。
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作者简介:陈君敏，男，1963年4月生，副教授，副主任医师，医学博士.
参考文献:
[1]Sutherland HJ,Lansdorp PM,Henkelman DH,et al.Functional characterization of individual human hematopoietic stem cells cultured at limiting dilution on supportive marrow stromal layers[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990;87:3584～3588
[2]Sutherland HJ,Eaves CJ,Lansdorp PM,et al.Differential regulation of primitive human hematopoietic cells in long-term cultures maintained on genetically engineered murine stromal cells[J].Blood，1991;78:666～672
, 百拇医药
[3]Gordon MY.Plastic-adherent cells in human bone marrow long-term hematopoiesis in vitro[J].Leukemia，1994;8:865～870
[4]Gordon MY,Riley GP,Greaves MF.Plastic-adherent progenitor cells in human bone marrow[J].Exp Hematol，1987;15:772～778
[5]Gordon MY,Lewis JL，Grand FH,et al.Phenotype and progeny of primitive adherent human hematopoietic progenitors[J].Leukemia，1996;10:1347～1353
收稿日期:1999-07-02, 百拇医药
单位：陈君敏(福建医科大学附属第一医院血液科,福州 350005); 魏秀妹(福建医科大学附属第一医院血液科,福州 350005); 陈志哲(福建医科大学附属协和医院血液科,福州 350005)
关键词：骨髓；造血干细胞；细胞粘附
福建医科大学学报000135
摘要:目的 采用塑料粘附δ实验(PΔ)估计骨髓原始祖细胞的相对数量。方法 取4例非血液病患者骨髓，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，取少量细胞加入甲基纤维素培养基，37℃，5%CO2孵箱培养，14天后计数集落(CFU-GM)，其余细胞作PΔ。结果 4份骨髓的PΔ相对数(/107细胞)分别为662,534,2220和1120，CFU-GM(/104细胞)分别为14.1,16.3,33.6和25.6，二者大致平行。结论 PΔ可作为骨髓原始祖细胞的评估方法，由于方法简便，耗时短，适合实际应用。
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中图分类号:R446.113 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0076-02
δ Assay of Plastic-adherent Cells for Evaluating Bone Marrow Primitive Progenitor
CHEN Jun-min,WEI Xiu-mei
(Department of Hematology,The Affiliated First Hospital,FujianMedical University,Fuzhou 350005,China
CHEN Zhi-zhe
(Department of Hematology,The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China)
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ABSTRACT:Objective To introduce the δ assay of plastic-adherent cells(PΔ) for assessing bone marrow primitive progenitor.Methods Bone marrow samples were collected from four patients with other than hematological diseases and mononuclear cells(BMMNCs) were obtained by Ficoll-hypaque gradient centrifugation.Some BMMNCs were added to methycellulose medium for CFU-GM assay.The rest of BMMNCs were suspended in IMDM and incubated in 25 mm2tissue culture flask.Two hours later,non-adherent cell were removed and long term culture(LTC) medium was added to the flask.After 7 days of culture at 37℃ in humidified atmosphere of 5%CO2,non-adherent cells in supernant were collected and CFU-GM assay made.The colony number served as the relative level of PΔ.Results PΔ of 4 samples were 662,534,2220 and 1120/107 cells,respectively,which were paralleled with CFU-GM on the whole.Conclusion PΔ assay might serve as a method to evaluate bone marrow primitive progenitor.Because of less complexity and less time-comsuming,it might be suitable to practical application.
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KEY WORDS:bone marrow；hematopoietic stem cell；cell adhesion
原始造血祖细胞的定量和功能分析对于造血干细胞移植及其基因治疗非常重要。原始祖细胞的检测一般用长期培养启动细胞实验[1，2]，由于该实验繁琐、耗时，实际应用有一定困难。采用塑料粘附δ实验(PΔ)估计骨髓原始祖细胞含量，所用材料少，方法简便，耗时短[3]。笔者于1998年8月～1998年12月进行实验研究，报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 为4例非血液系统疾病患者骨髓，用500 IU/ml的肝素抗凝，骨髓涂片常规检查正常。
1.2 PΔ实验[3]肝素抗凝的骨髓用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)梯度密度离心，分离单个核细胞(BMMNCs)，PBS洗涤2次，用含10%胎牛血清(FCS，杭州四季青生化公司)的IMDM(Gibco)培养基悬浮，计数并调整细胞浓度至约1×107/8 ml。上述BMMNCs加入25 cm2的塑料培养瓶(Corning)，37℃，5%CO2孵箱培养。2 h后去除非贴壁细胞，加入含钙镁的HBSS(室温)洗去非贴壁细胞，重复3次。粘附的细胞加含10-6 mol/L氢化可的松的LTC培养基(干细胞)8 ml，37℃，5%CO2孵箱继续培养。LTC培养基为含2 mmol/L谷氨酰胺，0.2 mmol/L肌醇，20 μmol/L叶酸，10-4mol/L二巯基乙醇(2ME)，12.5%马血清及12.5%FCS的αMEM。培养7天后吸取非贴壁细胞，离心。用含2%FCS的IMDM培养基洗2次并重新悬浮，计数，调整细胞浓度至约(2～5)×105/ml，取适量加入半固体培养基(下述)，14天后计数CFU-GM集落。按下式计算PΔ:
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PΔ＝集落数÷加入半固体培养基的细胞数×非贴壁细胞总数÷初始BMMNCs总数
1.3 CFU-GM检测 新鲜分离的BMMNCs或上述PΔ实验培养7天的非贴壁细胞用 2%FCS的IMDM培养基悬浮，计数并调整细胞浓度约(2～5)×105 /ml。取0.2 ml加入半固体培养基2 ml充分混匀，分成2份，分别加入35 mm的培养皿，37℃，5%CO2孵箱培养 14天后，倒置显微镜下计集落数，取2个皿集落数的均值。半固体培养基为0.9%甲基纤维素(华美生物工程公司)IMDM溶液，含30%FCS，1%牛血清白蛋白(BSA，华美生物工程公司)，10-4 mol/L 2ME(Sigma)，2 mmol/L谷氨酰胺(华美生物工程公司)，以及细胞因子rhSCF(50 ng/ml)、rhGM-CSF(10 ng/ml)和rhIL-3(10 ng/ml)，3种细胞因子均为Kirin公司惠赠。
1.4 CD34表型分析 上述PΔ实验培养7天的粘附BMMNCs用0.25%胰酶枸橼酸钠溶液5 ml消化，37℃孵育约3 min，见贴壁层浮起时加FCS 1 ml中和胰酶，反复吹打使所有细胞脱落，离心，用PBS洗涤并重新悬浮。重悬浮的细胞悬液或新鲜分离的BMMNCs的PBS悬液加FITC标记的鼠抗人CD34(Immunotech)，4℃孵育30 min后离心，PBS洗涤，Bryte HS流式细胞仪(Bio-Rad,美国伯乐公司)检测，用WinBryte软件分析。
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2 结 果 (附表)
附表 4份骨髓标本造血祖细胞检测结果 标本
CD34+
细胞
(%)
CFU-GM
(集落数/
104细胞)
塑料粘附
BMMNCs中
CD34+细胞(%)
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PΔ
(集落数/107
细胞)
1
14.1
662
2
0.4
16.3
15.2
534
3
0.8
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33.6
18.0
2220
4
25.6
1120
3 讨 论
对人造血祖细胞的定量分析可采用半固体培养基的集落形成实验，但该实验只说明较成熟的定向祖细胞如CFU-GM，这些祖细胞不具备长期植活能力。原始祖细胞具有长期植活能力，造血干细胞移植物中的原始祖细胞含量关系到移植的成败，因此原始祖细胞的定量检测有重要价值。检测原始祖细胞一般采用LTCIC试验[1,2]，整个过程需10周。不仅如此，由于所用材料多，实验繁琐，实验过程被污染的机会大，实际应用起来有一定困难。研究表明，塑料粘附的造血祖细胞对氟脲嘧啶抵抗[4]，表达Thy-1和CD34+[3]，是21天血岛形成细胞(CAFC)的前体细胞，能维持在长期骨髓培养(LTBMC)系统的造血[5]，因此是原始的造血祖细胞。
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通过塑料粘附δ实验(PΔ)，即检测塑料粘附的BMMNCs体外产生CFU-GM数，可估算骨髓原始祖细胞的相对数量[3]。笔者的4份标本PΔ为(544～2220)/107 BMMNCs，与Gordon报道接近[3]，同时与较成熟的定向祖细胞CFU-GM大致平行。不同标本之间有较大差异，可能由于实验本身造成，因为起始细胞数和培养7天后的非贴壁细胞数的误差均影响最后结果。不过根据Gordon的经验，同一份骨髓标本分开实验的重复性好，结果无显著不同。与LTCIC实验比较，PΔ实验不仅耗时短(整个过程3周，较CFU-GM检测多1周)，而且所用材料少，方法简便，污染机会少，因此较适合实际应用。
据文献报道[3]，塑料粘附的CD34+细胞占骨髓所有CD34+细胞的5%～10%。笔者结果显示，塑料粘附的BMMNCs中CD34+细胞占15.2%和18.0%，显著高于BMMNCs中的0.4%和0.8%，说明塑料粘附有富集骨髓CD34+细胞的作用，同时提示塑料粘附的CD34+细胞数也是评估骨髓原始祖细胞的一项指标，有待进一步考察。
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作者简介:陈君敏，男，1963年4月生，副教授，副主任医师，医学博士.
参考文献:
[1]Sutherland HJ,Lansdorp PM,Henkelman DH,et al.Functional characterization of individual human hematopoietic stem cells cultured at limiting dilution on supportive marrow stromal layers[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990;87:3584～3588
[2]Sutherland HJ,Eaves CJ,Lansdorp PM,et al.Differential regulation of primitive human hematopoietic cells in long-term cultures maintained on genetically engineered murine stromal cells[J].Blood，1991;78:666～672
, 百拇医药
[3]Gordon MY.Plastic-adherent cells in human bone marrow long-term hematopoiesis in vitro[J].Leukemia，1994;8:865～870
[4]Gordon MY,Riley GP,Greaves MF.Plastic-adherent progenitor cells in human bone marrow[J].Exp Hematol，1987;15:772～778
[5]Gordon MY,Lewis JL，Grand FH,et al.Phenotype and progeny of primitive adherent human hematopoietic progenitors[J].Leukemia，1996;10:1347～1353
收稿日期:1999-07-02, 百拇医药