Genistein对aFGF诱导的AGZY-83A细胞增殖的抑制作用
作者：孙黎光 马际 侯伟健 邢伟
单位：侯伟健(中国医科大学生物技术研究所)；孙黎光(中国医科大学基础医学院生物化学教研室，沈阳 110001)；马际(中国医科大学基础医学院生物化学教研室，沈阳 110001)；侯伟健(中国医科大学基础医学院生物化学教研室，沈阳 110001)；邢伟(中国医科大学基础医学院生物化学教研室，沈阳 110001)
关键词：酪氨酸蛋白激酶；抑制剂；酸性成纤维细胞生长因子；细胞增殖
中国医科大学学报000104 摘要 目的：探讨酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制剂Genistein对酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)诱导的肺腺癌细胞株AGZY-83A细胞增殖的抑制作用。方法：以不同浓度的aFGF刺激AGZY-83A细胞，再对由aFGF引起增殖的细胞施加不同浓度的Genistein，用细胞计数器计数细胞，观察Genistein对细胞增殖的抑制作用。结果：aFGF可使该细胞株增殖比明显增加，而Genistein可引起细胞增殖比明显下降，其程度均随浓度增高而增强。结论：该细胞株中aFGF受体有TPK活性，Genistein对aFGF引起的细胞增殖的抑制作用有效。
, 百拇医药
The Suppressing Role of Tyrosine Protein Kinase Inhibitor Genistein on AGZY-83A Cell
Proliferation Induced by Acid Fibroblast Growth Factor
Sun Liguang Ma Ji Hou Weijian et al
(Department of Biochemistry, College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang, 110001)
ABSTRACT Objective:This study was designed to explore the suppressing role of the tyrosine protein kinase(TPK) inhibitor-genistein in the proliferation of AGZY-83A cells induced by acid fibroblast growth factor(aFGF). Methods：The AGZY-83A cells were stimulated by adding various concentration of aFGF, and cell proliferation inhibited by various concentration of genistein was determined by cell counter. Results:Cell proliferation was promoted by aFGF with increasing proliferation percentage, but genistein suppressed the proliferation with decreasing percentage. Both of the two substances showed dose-dependent manners. Conclusion:We could conclude that aFGF receptor possessed TPK activity. Genistein could more efficiently inhibit the cell proliferation induced by aFGF.
, 百拇医药
KEY WORDS tyrosine protein kinase; inhibitor; acid fibroblast growth factor; cell proliferation
酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase, TPK)是一种催化蛋白质分子中酪氨酸残基磷酸化的蛋白激酶。当相应的生长因子(Insulin、FGF)与其受体结合后，即可诱导受体变构，进而导致受体胞内段一定位置的酪氨酸残基自身磷酸化，并激活受体的TPK活性。TPK激活后，相继使其底物蛋白质磷酸化，构成激酶级联，从而将胞外信息传递到细胞内，对细胞分裂、分化及增殖进行调控[1]。
Genistein是一种TPK的特异性抑制剂。本研究以肺腺癌细胞株AGZY-83A细胞作为研究对象，以不同剂量的酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor, aFGF)刺激细胞增殖，再以不同剂量的Genistein作用于由aFGF诱导增殖的细胞，观察Genistein对该株细胞增殖的抑制，进一步认识肿瘤细胞内的信号传导机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验对象
肺腺癌细胞株AGZY-83A细胞，由中国医科大学病理教研室惠赠。
1.2 试剂
aFGF由本实验室提取[2]；Genistein，DMEM培养基购自Sigma公司；其它试剂均为分析纯。Genistein用DMSO配成2.5 mg/ml的保存液于-20℃冰箱中保存。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养：
将低温冷冻的肺腺癌细胞株AGZY-83A细胞在37℃水浴下速溶，台式离心机1 000 r/min离心10 min，沉淀加含10%小牛血清的DMEM培养液，常规方法制成均匀细胞悬液(8×104/ml)37℃，5%CO2孵箱中培养。24 h换液。密度达到106个以上时收集对数生长期细胞，以6×104/ml接种于培养瓶，每24 h换液1次。
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1.3.2 实验分组及施加试验因素：
将培养的肺癌细胞按随机原则分为：(1) 对照组：分为两种，一为空白对照(作为aFGF组及Gen组的对照)，另一为只加aFGF的对照(作为aFGF+Gen组的对照)。(2) aFGF组：观察aFGF对细胞的作用。(3) Gen组：观察Genistein对细胞的作用。(4) aFGF+Gen组：观察aFGF及Genistein同时施加时对细胞的作用。
当细胞达到亚融合状态时，吸出旧培养液，每瓶加入2.5 ml无血清培养液，12 h后吸出旧培养液按分组要求分别加入肝素15 μl(40 ng/ml)，不同量的aFGF、Genistein及培养液。使各瓶终体积均为2 ml。aFGF+Gen组，细胞与Genistein温浴30 min后加入aFGF。将各瓶细胞放回孵箱，2 d后测定细胞数。各组具体剂量见表1。
表1 各组施加因素剂量
, 百拇医药
Table 1 Dosages of the factors added to every group 分 组
aFGF(μg/ml)
Gen(μg/ml)
培养液(ml)
对照组
0
0
0.6
0.6
0
0
0
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0
2
2
1
1
aFGF组
0.15
0.3
0.6
1.2
0
0
0
0
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1.75
1.5
1
0
Gen组
0
0
0
0
6
12
24
48
1.875
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1.75
1.5
1
aFGF+Gen组
0.6
0.6
0.6
0.6
6
12
24
48
0.875
, 百拇医药
0.75
0.5
0
aFGF溶液：1.2 μg/ml， Gen溶液：96 μg/ml
1.4 细胞增殖程度的计算
将培养液逐瓶吸出，按常规制成均匀细胞悬液，吸20 μl细胞悬液与20 μl 0.4%台盼蓝混匀，于倒置显微镜下用计数板计数细胞。以增殖比表示细胞增殖程度，(增殖比=实验组细胞/对照组细胞×100%)。aFGF组及Gen组，可与空白对照组相对照；aFGF+Gen组，可与含aFGF的对照组相对照计算。
2 结果
2.1 细胞增殖程度分析(表2)
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表2 aFGF对AGZY-83A细胞增殖的影响(
±s)
Table 2 Effect of aFGF on proliferation of
AGZY-83A cells(±s) aFGF浓度(μg/ml)
细胞数(×105个/ml)
增殖比(%)
0
7.20±0.81
100
, http://www.100md.com
0.15
7.81±1.21
108
0.3
9.65±0.54*
134
0.6
11.51±1.34*
160
1.2
13.94±1.28*
193
, 百拇医药
与对照组相比*P<0.05
随aFGF浓度升高，aFGF组细胞增殖比明显增加。当aFGF浓度为1.2 μg/ml时，细胞增殖比为193%。
2.2 Genistein对细胞增殖的抑制作用 加入Genistein后，Gen组及aFGF+Gen组细胞增殖比明显下降，其下降程度随Genistein浓度增高而加大(表3)。两组比较，Genistein对aFGF引起的细胞增殖抑制作用更大(P<0.05)。
表3 Genistein对aFGF诱导的AGZY-83A
细胞增殖的影响(±s)
Table 3 Effect of Genistein on proliferation of AGZY-83A
, http://www.100md.com
cells induced by aFGF(±s) Genistein浓度
(μg/ml)
Gen组
aFGF+Gen组
细胞数
(×105个/ml)
增殖比
(%)
细胞数
(×105个/ml)
, 百拇医药
增殖比
(%)
0
7.20±0.81
100
11.51±1.34
100
6
6.70±0.93
93
10.24±1.27
89
12
, 百拇医药
5.83±1.07
81
8.74±1.42
76
24
5.18±1.70*
78
7.36±0.92
64
48
4.97±0.56*
72
, 百拇医药
5.87±0.86
51
与对照组相比*P<0.05
3 讨论
近年来，随着对细胞内信号传导途径研究的日益深入，发现癌变与异常的细胞间信息传递密切相关。许多癌基因编码的蛋白质是具有TPK活性的生长因子受体或生长因子信号通路中的某一成分或类似物，如fms及erb-B等癌基因编码的蛋白是生长因子受体，而src、ras及raf等癌基因编码的蛋白则是具有TPK活性或丝/苏氨酸蛋白激酶活性的信号传导通路中的某一组分。这表明癌变与TPK、生长因子受体之间存在着本质联系[3，4]。
为了深入研究蛋白激酶的生理作用，许多学者致力于寻找特异的蛋白激酶抑制剂，用以检测某一特异反应是否有相应蛋白激酶参与，并可有助于认识可逆的磷酸化所介导的生理过程。特异的拮抗剂还可能在抗肿瘤、抗炎等方面具有一定的实用意义。Genistein是从假单胞菌属中分离得到的一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂，它是一种异黄酮染料，可与ATP竞争TPK上的结合位点，以μmol水平的Ki值抑制EGFR和PP60v-src的TPK活性，Genistein特异性强，对丝/苏氨酸蛋白激酶无抑制性。
, http://www.100md.com
本实验观察到，aFGF可以促进该株细胞的增殖，且随浓度升高，作用加强，当aFGF浓度为1.2 μg/ml时，细胞数与对照组相比增加近一倍。加入TPK抑制剂后，细胞增殖明显受抑，且随浓度升高，抑制加强。说明该株细胞的增殖主要是由TPK活化介导的。其对aFGF+Gen组细胞的抑制程度明显大于Gen组细胞的抑制。这是否表明，TPK抑制剂Genistein对aFGF诱导的细胞增殖的抑制更有效，进而推断，Genistein对正常细胞的作用会很小。这种差别的产生是否是因为正常细胞中aFGF受体表达很少或只有少量蛋白是在酪氨酸残基上磷酸化的，而肿瘤细胞则丧失了上述特点，导致恶性增殖。有文献报道，PKC和Ca2+是TPK下游的信号分子，Genistein对它们的活性是否有影响，还需进一步探讨。此方面的进一步研究也许会有助于细胞癌变机制的阐明。
国家自然科学基金资助项目，39070454
参考文献
, 百拇医药
1，张喆，肖殿模.细胞信息转导中的蛋白激酶与磷酸酶.基础医学与临床，1996，16(2)：81～85
2，Tetsu Akiyama, Junko Ishida, Suguru Nakagawa, et al. Genistein, a specific Inhibitor of Tyrosine-specific protein kinases. J Biol Chem, 1987;262:5592_5597
3，王敬泽，孟琨，刘亚兵，等.RFP134对UMR106细胞EGF受体酪氨酸蛋白激酶的调节作用.生物化学杂志，1995，11(1)：22～26
4，程万里，邓仲端.成纤维细胞生长因子研究进展.国外医学分子生物学分册，1992；(2)：76～79
5，孙黎光，邢伟，刘素媛.aFGF对肺腺癌AGZY-83A细胞株TPK、PKC活性及Ca2+浓度的影响.中国医科大学学报，1998，27(6)：562～565
收稿1999-06-25
, 百拇医药
单位：侯伟健(中国医科大学生物技术研究所)；孙黎光(中国医科大学基础医学院生物化学教研室，沈阳 110001)；马际(中国医科大学基础医学院生物化学教研室，沈阳 110001)；侯伟健(中国医科大学基础医学院生物化学教研室，沈阳 110001)；邢伟(中国医科大学基础医学院生物化学教研室，沈阳 110001)
关键词：酪氨酸蛋白激酶；抑制剂；酸性成纤维细胞生长因子；细胞增殖
中国医科大学学报000104 摘要 目的：探讨酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制剂Genistein对酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)诱导的肺腺癌细胞株AGZY-83A细胞增殖的抑制作用。方法：以不同浓度的aFGF刺激AGZY-83A细胞，再对由aFGF引起增殖的细胞施加不同浓度的Genistein，用细胞计数器计数细胞，观察Genistein对细胞增殖的抑制作用。结果：aFGF可使该细胞株增殖比明显增加，而Genistein可引起细胞增殖比明显下降，其程度均随浓度增高而增强。结论：该细胞株中aFGF受体有TPK活性，Genistein对aFGF引起的细胞增殖的抑制作用有效。
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The Suppressing Role of Tyrosine Protein Kinase Inhibitor Genistein on AGZY-83A Cell
Proliferation Induced by Acid Fibroblast Growth Factor
Sun Liguang Ma Ji Hou Weijian et al
(Department of Biochemistry, College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang, 110001)
ABSTRACT Objective:This study was designed to explore the suppressing role of the tyrosine protein kinase(TPK) inhibitor-genistein in the proliferation of AGZY-83A cells induced by acid fibroblast growth factor(aFGF). Methods：The AGZY-83A cells were stimulated by adding various concentration of aFGF, and cell proliferation inhibited by various concentration of genistein was determined by cell counter. Results:Cell proliferation was promoted by aFGF with increasing proliferation percentage, but genistein suppressed the proliferation with decreasing percentage. Both of the two substances showed dose-dependent manners. Conclusion:We could conclude that aFGF receptor possessed TPK activity. Genistein could more efficiently inhibit the cell proliferation induced by aFGF.
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KEY WORDS tyrosine protein kinase; inhibitor; acid fibroblast growth factor; cell proliferation
酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase, TPK)是一种催化蛋白质分子中酪氨酸残基磷酸化的蛋白激酶。当相应的生长因子(Insulin、FGF)与其受体结合后，即可诱导受体变构，进而导致受体胞内段一定位置的酪氨酸残基自身磷酸化，并激活受体的TPK活性。TPK激活后，相继使其底物蛋白质磷酸化，构成激酶级联，从而将胞外信息传递到细胞内，对细胞分裂、分化及增殖进行调控[1]。
Genistein是一种TPK的特异性抑制剂。本研究以肺腺癌细胞株AGZY-83A细胞作为研究对象，以不同剂量的酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor, aFGF)刺激细胞增殖，再以不同剂量的Genistein作用于由aFGF诱导增殖的细胞，观察Genistein对该株细胞增殖的抑制，进一步认识肿瘤细胞内的信号传导机制。
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1 材料与方法
1.1 实验对象
肺腺癌细胞株AGZY-83A细胞，由中国医科大学病理教研室惠赠。
1.2 试剂
aFGF由本实验室提取[2]；Genistein，DMEM培养基购自Sigma公司；其它试剂均为分析纯。Genistein用DMSO配成2.5 mg/ml的保存液于-20℃冰箱中保存。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养：
将低温冷冻的肺腺癌细胞株AGZY-83A细胞在37℃水浴下速溶，台式离心机1 000 r/min离心10 min，沉淀加含10%小牛血清的DMEM培养液，常规方法制成均匀细胞悬液(8×104/ml)37℃，5%CO2孵箱中培养。24 h换液。密度达到106个以上时收集对数生长期细胞，以6×104/ml接种于培养瓶，每24 h换液1次。
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1.3.2 实验分组及施加试验因素：
将培养的肺癌细胞按随机原则分为：(1) 对照组：分为两种，一为空白对照(作为aFGF组及Gen组的对照)，另一为只加aFGF的对照(作为aFGF+Gen组的对照)。(2) aFGF组：观察aFGF对细胞的作用。(3) Gen组：观察Genistein对细胞的作用。(4) aFGF+Gen组：观察aFGF及Genistein同时施加时对细胞的作用。
当细胞达到亚融合状态时，吸出旧培养液，每瓶加入2.5 ml无血清培养液，12 h后吸出旧培养液按分组要求分别加入肝素15 μl(40 ng/ml)，不同量的aFGF、Genistein及培养液。使各瓶终体积均为2 ml。aFGF+Gen组，细胞与Genistein温浴30 min后加入aFGF。将各瓶细胞放回孵箱，2 d后测定细胞数。各组具体剂量见表1。
表1 各组施加因素剂量
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Table 1 Dosages of the factors added to every group 分 组
aFGF(μg/ml)
Gen(μg/ml)
培养液(ml)
对照组
0
0
0.6
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2
2
1
1
aFGF组
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0.3
0.6
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0
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1.75
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1
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Gen组
0
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1
aFGF+Gen组
0.6
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0.75
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aFGF溶液：1.2 μg/ml， Gen溶液：96 μg/ml
1.4 细胞增殖程度的计算
将培养液逐瓶吸出，按常规制成均匀细胞悬液，吸20 μl细胞悬液与20 μl 0.4%台盼蓝混匀，于倒置显微镜下用计数板计数细胞。以增殖比表示细胞增殖程度，(增殖比=实验组细胞/对照组细胞×100%)。aFGF组及Gen组，可与空白对照组相对照；aFGF+Gen组，可与含aFGF的对照组相对照计算。
2 结果
2.1 细胞增殖程度分析(表2)
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表2 aFGF对AGZY-83A细胞增殖的影响(
±s)Table 2 Effect of aFGF on proliferation of
AGZY-83A cells(
±s) aFGF浓度(μg/ml)细胞数(×105个/ml)
增殖比(%)
0
7.20±0.81
100
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0.15
7.81±1.21
108
0.3
9.65±0.54*
134
0.6
11.51±1.34*
160
1.2
13.94±1.28*
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与对照组相比*P<0.05
随aFGF浓度升高，aFGF组细胞增殖比明显增加。当aFGF浓度为1.2 μg/ml时，细胞增殖比为193%。
2.2 Genistein对细胞增殖的抑制作用 加入Genistein后，Gen组及aFGF+Gen组细胞增殖比明显下降，其下降程度随Genistein浓度增高而加大(表3)。两组比较，Genistein对aFGF引起的细胞增殖抑制作用更大(P<0.05)。
表3 Genistein对aFGF诱导的AGZY-83A
细胞增殖的影响(
±s)Table 3 Effect of Genistein on proliferation of AGZY-83A
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cells induced by aFGF(
±s) Genistein浓度(μg/ml)
Gen组
aFGF+Gen组
细胞数
(×105个/ml)
增殖比
(%)
细胞数
(×105个/ml)
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增殖比
(%)
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7.20±0.81
100
11.51±1.34
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5.83±1.07
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8.74±1.42
76
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5.18±1.70*
78
7.36±0.92
64
48
4.97±0.56*
72
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5.87±0.86
51
与对照组相比*P<0.05
3 讨论
近年来，随着对细胞内信号传导途径研究的日益深入，发现癌变与异常的细胞间信息传递密切相关。许多癌基因编码的蛋白质是具有TPK活性的生长因子受体或生长因子信号通路中的某一成分或类似物，如fms及erb-B等癌基因编码的蛋白是生长因子受体，而src、ras及raf等癌基因编码的蛋白则是具有TPK活性或丝/苏氨酸蛋白激酶活性的信号传导通路中的某一组分。这表明癌变与TPK、生长因子受体之间存在着本质联系[3，4]。
为了深入研究蛋白激酶的生理作用，许多学者致力于寻找特异的蛋白激酶抑制剂，用以检测某一特异反应是否有相应蛋白激酶参与，并可有助于认识可逆的磷酸化所介导的生理过程。特异的拮抗剂还可能在抗肿瘤、抗炎等方面具有一定的实用意义。Genistein是从假单胞菌属中分离得到的一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂，它是一种异黄酮染料，可与ATP竞争TPK上的结合位点，以μmol水平的Ki值抑制EGFR和PP60v-src的TPK活性，Genistein特异性强，对丝/苏氨酸蛋白激酶无抑制性。
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本实验观察到，aFGF可以促进该株细胞的增殖，且随浓度升高，作用加强，当aFGF浓度为1.2 μg/ml时，细胞数与对照组相比增加近一倍。加入TPK抑制剂后，细胞增殖明显受抑，且随浓度升高，抑制加强。说明该株细胞的增殖主要是由TPK活化介导的。其对aFGF+Gen组细胞的抑制程度明显大于Gen组细胞的抑制。这是否表明，TPK抑制剂Genistein对aFGF诱导的细胞增殖的抑制更有效，进而推断，Genistein对正常细胞的作用会很小。这种差别的产生是否是因为正常细胞中aFGF受体表达很少或只有少量蛋白是在酪氨酸残基上磷酸化的，而肿瘤细胞则丧失了上述特点，导致恶性增殖。有文献报道，PKC和Ca2+是TPK下游的信号分子，Genistein对它们的活性是否有影响，还需进一步探讨。此方面的进一步研究也许会有助于细胞癌变机制的阐明。
国家自然科学基金资助项目，39070454
参考文献
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1，张喆，肖殿模.细胞信息转导中的蛋白激酶与磷酸酶.基础医学与临床，1996，16(2)：81～85
2，Tetsu Akiyama, Junko Ishida, Suguru Nakagawa, et al. Genistein, a specific Inhibitor of Tyrosine-specific protein kinases. J Biol Chem, 1987;262:5592_5597
3，王敬泽，孟琨，刘亚兵，等.RFP134对UMR106细胞EGF受体酪氨酸蛋白激酶的调节作用.生物化学杂志，1995，11(1)：22～26
4，程万里，邓仲端.成纤维细胞生长因子研究进展.国外医学分子生物学分册，1992；(2)：76～79
5，孙黎光，邢伟，刘素媛.aFGF对肺腺癌AGZY-83A细胞株TPK、PKC活性及Ca2+浓度的影响.中国医科大学学报，1998，27(6)：562～565
收稿1999-06-25
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