胆道感染时PMN产生MDA和释放MPO的变化及其意义
作者：黄显凯 朱锡光 韩本立
单位：黄显凯 朱锡光(第三军医大学大坪医院普外科 重庆 400042)；韩本立(第三军医大学西南医院肝胆中心 重庆 400038)
关键词：胆管炎；中性粒细胞；丙二醛；髓过氧化物酶
中国现代医学杂志000106
该文观察了胆道感染时PMN产生MDA和释放MPO的变化。结果显示：胆管炎大鼠术后3 h PMN产生MDA的量明显升高(P<0.01)，以后各时相点PMN产生的量进行性升高。胆管炎大鼠各时相点PMN释放MPO的量均显著增高，明显高于SO组(P<0.01)，并呈进行性增高。表明胆道感染时PMN被炎症介质激活，产生氧自由基及脱颗粒释放各种酶增多，从而产生肝细胞损伤作用。
分类号：R575.7▲
, 百拇医药
本文观察胆道感染大鼠中性粒细胞(Polymor phonuclear,PMN)产生丙二醛(MDA)及释放髓过氧化物酶(MPO)等变化，旨在探讨胆道感染时PMN的功能变化及其在严重胆道感染肝损害机制中的作用。现报告如下：
1 材料和方法
1.1 动物模型及分组
Wistar大鼠，雌雄不拘，体重200～250g，自由进食进水。动物随机分为二组,急性胆管炎(AC)组:动物乙醚吸入麻醉，无菌条件下开腹，分离胆总管，结扎远端，近端注入0.3ml大肠菌液(1×109/ml)，关腹;假手术(SO)组:同样条件下开腹，游离胆总管，然后关腹。以上各组分别于手术后3,6,12及24h取材，每个时相点及正常对照组各6只动物。
1.2 大鼠PMN分离
, http://www.100md.com 参照严鸣的方法进行[1]
1.3 培养上清MDA测定[2]
待测样本25μl加入1/12NH2SO4NH2SO4 4ml，10%磷钨酸500μl，混匀后静置10min，400g离心5min，弃上清。沉淀中加入1/12NH2SO4 2ml，10%磷钨酸0.3ml，混匀后400g离心5min，弃上清。沉淀中加双蒸水1ml，混匀后95℃水溶6min，冷却后加入正丁醇5ml，混漩抽提1min，400g离心10min，吸取正丁醇层，用荧光分光光度计测定荧光强度EM：515nm，EX553nm。MDA含量=(样品测定值f/标准品测定值F)×10nM/ml。
1.4 培养上清MPO活性测定[3]
, http://www.100md.com
分离大鼠PMN，并取105PMN孵育1h，冷冻800g离心5min，取上清加入1.0%HTAB(澳化十六烷荃三甲胺)的PB缓冲液，立即在DU7500紫外分光光度计上选择波长450nm扫描2min，记录第30秒和第90秒的光密度差值，测定MPO的活性，以μ/105PMN表示。
2 结果
2.1 胆道感染大鼠PMN产生MDA量的变化
假手术对照大鼠PMN产生MDA的量较低，且各时相点变化无明显差异，与正常对照(术前)无明显差异(P>0.05)。胆管炎大鼠术后3h PMN产生MDA的量明显升高(P<0.01)，以后各时相点PMN产生的量进行性升高，24h最高,见表1。
表1 培养上清MDA含量变化 (nM/105PMN) 组别
, http://www.100md.com
术前
术 后 时 间 (h)
3
6
12
24
SO
1.07±0.23
1.35±0.10
1.47±0.12
1.58±0.25
1.48±0.23
AC
, http://www.100md.com
1.07±0.23
2.77±0.39
3.38±0.37
3.88±0.37
4.52±0.46
注：与SO组比较P<0.01
2.2 胆道感染大鼠PMN释放MPO量的变化
假手术对照大鼠PMN释放MPO水平较低，各时相点变化不明显，与正常对照(术前)无明显差异(P>0.05)。胆管炎大鼠各时相点PMN释放MPO的量均明显高于SO组(P<0.01)，并呈进行性增高趋势，24h最高,见表2。
表2 培养上清MPO活性变化 (U/105PMN) 组别
, http://www.100md.com
术前
术 后 时 间 (h)
3
6
12
24
SO
2.60±0.47
3.22±0.21
4.03±0.59
4.35±0.59
4.20±0.36
AC
, 百拇医药
2.60±0.47
7.07±0.97
14.47±2.28
15.12±1.33
18.47±1.82
注：与SO组比较P<0.01
3 讨论
3.1 胆道感染对PMN功能的影响
本文将胆道感染大鼠术后不同时相点取血获得PMN，观察PMN产生MDA及释放MPO的水平变化，结果显示胆管炎大鼠术后3h PMN产生MDA的量明显升高，以后各时相点MDA含量呈进行性升高,24h最高。MDA是反映氧自由基活性最重要的指标之一[4]，表明胆道感染时PMN被炎症介质激活，产生氧自由基显著增多，从而产生组织损伤作用。严重感染时，PMN被炎症介质激活后通过呼吸爆发时氧耗大量增加，PMN含有NADPH氧化酶，能还原分子氧为超氧阴离子，从而生成超氧阴离子(O-2)，超氧阴离子形成后由超氧化物岐化酶岐化，进一步单电子还原，形成H2O2胆道感染大鼠术后各时相点PMN释放NPO的量也显著增高，并呈进行性增高趋势，24h最高。MPO存在于PMN的嗜天青颗粒中，PMN激活时部分MPO可释放，培养上清MPO的量明显增加，表明PMN被炎症介质激活后发生脱颗粒大量释放MPO。
, 百拇医药
3.2 胆道感染时PMN对肝细胞的作用
如上所述，胆道感染时PMN被细胞因子和各种炎症介质活化，产生大量氧自由基，并释放MPO及弹性硬蛋白酶、胶原酶和明胶酶等各种蛋白水解酶，可造成肝脏损害。氧自由基可直接造成肝细胞损伤，并使肝细胞线粒体受损，抑制线粒体呼吸功能[5，6]。活化的PMN释放MPO，MPO可将H2O2和氯离子转为氯酸；次氯酸与胺反应生成氯胺。超氧阴离子及次氯酸是强氧化剂，可以氧化巯基，使氨基酸和蛋白质降解，从而造成细胞损伤。次氯酸与氯胺这些卤氧化物可与PMN释放的蛋白酶联合作用，增强对肝细胞的损伤。
参考文献：
[1]严 鸣，龚肖崎，张亚霏.大鼠中性粒细胞的分离及糖皮质激素受体阻断率的测定.第二军医大学学报，1994；15(1)：85
, 百拇医药 [2]Yagi KA.Simple fluorometric assay for lipoperoxidein blood plasma.Biochem Med,1976;15:212
[3]Lum H,Gibbs L,Lai L,et al.CD18 integrin-dependent endothelial injury:effects of opsonized zymosan and phorbol ester activation.J Leukoc Biol,1994;55:58
[4]Lalonde C, Konx J,youn YK,et al.Relationship between hepatic blood flow and tissue lipid peroxidation in the early postburm period.Crit Care Med,1992;20(6):789
, 百拇医药
[5]Jaeschke H.Pathogenetic mechanisms of acute liver failurel.Zentralbl Chir,1994;119:309
[6]Komatsu Y,Shiratori Y,Kawase T,et al.Role of polymorphonuclear leukocytes ingalactosamine hepatitis:mechanism of adherence to hepatic endothelial cell.Hepatology,1994;20:1548
刘恕审稿 丁丽云编辑
1999-05-26收稿, 百拇医药
单位：黄显凯 朱锡光(第三军医大学大坪医院普外科 重庆 400042)；韩本立(第三军医大学西南医院肝胆中心 重庆 400038)
关键词：胆管炎；中性粒细胞；丙二醛；髓过氧化物酶
中国现代医学杂志000106
该文观察了胆道感染时PMN产生MDA和释放MPO的变化。结果显示：胆管炎大鼠术后3 h PMN产生MDA的量明显升高(P<0.01)，以后各时相点PMN产生的量进行性升高。胆管炎大鼠各时相点PMN释放MPO的量均显著增高，明显高于SO组(P<0.01)，并呈进行性增高。表明胆道感染时PMN被炎症介质激活，产生氧自由基及脱颗粒释放各种酶增多，从而产生肝细胞损伤作用。
分类号：R575.7▲
, 百拇医药
本文观察胆道感染大鼠中性粒细胞(Polymor phonuclear,PMN)产生丙二醛(MDA)及释放髓过氧化物酶(MPO)等变化，旨在探讨胆道感染时PMN的功能变化及其在严重胆道感染肝损害机制中的作用。现报告如下：
1 材料和方法
1.1 动物模型及分组
Wistar大鼠，雌雄不拘，体重200～250g，自由进食进水。动物随机分为二组,急性胆管炎(AC)组:动物乙醚吸入麻醉，无菌条件下开腹，分离胆总管，结扎远端，近端注入0.3ml大肠菌液(1×109/ml)，关腹;假手术(SO)组:同样条件下开腹，游离胆总管，然后关腹。以上各组分别于手术后3,6,12及24h取材，每个时相点及正常对照组各6只动物。
1.2 大鼠PMN分离
, http://www.100md.com 参照严鸣的方法进行[1]
1.3 培养上清MDA测定[2]
待测样本25μl加入1/12NH2SO4NH2SO4 4ml，10%磷钨酸500μl，混匀后静置10min，400g离心5min，弃上清。沉淀中加入1/12NH2SO4 2ml，10%磷钨酸0.3ml，混匀后400g离心5min，弃上清。沉淀中加双蒸水1ml，混匀后95℃水溶6min，冷却后加入正丁醇5ml，混漩抽提1min，400g离心10min，吸取正丁醇层，用荧光分光光度计测定荧光强度EM：515nm，EX553nm。MDA含量=(样品测定值f/标准品测定值F)×10nM/ml。
1.4 培养上清MPO活性测定[3]
, http://www.100md.com
分离大鼠PMN，并取105PMN孵育1h，冷冻800g离心5min，取上清加入1.0%HTAB(澳化十六烷荃三甲胺)的PB缓冲液，立即在DU7500紫外分光光度计上选择波长450nm扫描2min，记录第30秒和第90秒的光密度差值，测定MPO的活性，以μ/105PMN表示。
2 结果
2.1 胆道感染大鼠PMN产生MDA量的变化
假手术对照大鼠PMN产生MDA的量较低，且各时相点变化无明显差异，与正常对照(术前)无明显差异(P>0.05)。胆管炎大鼠术后3h PMN产生MDA的量明显升高(P<0.01)，以后各时相点PMN产生的量进行性升高，24h最高,见表1。
表1 培养上清MDA含量变化 (nM/105PMN) 组别
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术前
术 后 时 间 (h)
3
6
12
24
SO
1.07±0.23
1.35±0.10
1.47±0.12
1.58±0.25
1.48±0.23
AC
, http://www.100md.com
1.07±0.23
2.77±0.39
3.38±0.37
3.88±0.37
4.52±0.46
注：与SO组比较P<0.01
2.2 胆道感染大鼠PMN释放MPO量的变化
假手术对照大鼠PMN释放MPO水平较低，各时相点变化不明显，与正常对照(术前)无明显差异(P>0.05)。胆管炎大鼠各时相点PMN释放MPO的量均明显高于SO组(P<0.01)，并呈进行性增高趋势，24h最高,见表2。
表2 培养上清MPO活性变化 (U/105PMN) 组别
, http://www.100md.com
术前
术 后 时 间 (h)
3
6
12
24
SO
2.60±0.47
3.22±0.21
4.03±0.59
4.35±0.59
4.20±0.36
AC
, 百拇医药
2.60±0.47
7.07±0.97
14.47±2.28
15.12±1.33
18.47±1.82
注：与SO组比较P<0.01
3 讨论
3.1 胆道感染对PMN功能的影响
本文将胆道感染大鼠术后不同时相点取血获得PMN，观察PMN产生MDA及释放MPO的水平变化，结果显示胆管炎大鼠术后3h PMN产生MDA的量明显升高，以后各时相点MDA含量呈进行性升高,24h最高。MDA是反映氧自由基活性最重要的指标之一[4]，表明胆道感染时PMN被炎症介质激活，产生氧自由基显著增多，从而产生组织损伤作用。严重感染时，PMN被炎症介质激活后通过呼吸爆发时氧耗大量增加，PMN含有NADPH氧化酶，能还原分子氧为超氧阴离子，从而生成超氧阴离子(O-2)，超氧阴离子形成后由超氧化物岐化酶岐化，进一步单电子还原，形成H2O2胆道感染大鼠术后各时相点PMN释放NPO的量也显著增高，并呈进行性增高趋势，24h最高。MPO存在于PMN的嗜天青颗粒中，PMN激活时部分MPO可释放，培养上清MPO的量明显增加，表明PMN被炎症介质激活后发生脱颗粒大量释放MPO。
, 百拇医药
3.2 胆道感染时PMN对肝细胞的作用
如上所述，胆道感染时PMN被细胞因子和各种炎症介质活化，产生大量氧自由基，并释放MPO及弹性硬蛋白酶、胶原酶和明胶酶等各种蛋白水解酶，可造成肝脏损害。氧自由基可直接造成肝细胞损伤，并使肝细胞线粒体受损，抑制线粒体呼吸功能[5，6]。活化的PMN释放MPO，MPO可将H2O2和氯离子转为氯酸；次氯酸与胺反应生成氯胺。超氧阴离子及次氯酸是强氧化剂，可以氧化巯基，使氨基酸和蛋白质降解，从而造成细胞损伤。次氯酸与氯胺这些卤氧化物可与PMN释放的蛋白酶联合作用，增强对肝细胞的损伤。
参考文献：
[1]严 鸣，龚肖崎，张亚霏.大鼠中性粒细胞的分离及糖皮质激素受体阻断率的测定.第二军医大学学报，1994；15(1)：85
, 百拇医药 [2]Yagi KA.Simple fluorometric assay for lipoperoxidein blood plasma.Biochem Med,1976;15:212
[3]Lum H,Gibbs L,Lai L,et al.CD18 integrin-dependent endothelial injury:effects of opsonized zymosan and phorbol ester activation.J Leukoc Biol,1994;55:58
[4]Lalonde C, Konx J,youn YK,et al.Relationship between hepatic blood flow and tissue lipid peroxidation in the early postburm period.Crit Care Med,1992;20(6):789
, 百拇医药
[5]Jaeschke H.Pathogenetic mechanisms of acute liver failurel.Zentralbl Chir,1994;119:309
[6]Komatsu Y,Shiratori Y,Kawase T,et al.Role of polymorphonuclear leukocytes ingalactosamine hepatitis:mechanism of adherence to hepatic endothelial cell.Hepatology,1994;20:1548
刘恕审稿 丁丽云编辑
1999-05-26收稿, 百拇医药